美拉德反应是指还原糖类等羰基化合物和氨基化合物之间的反应，其除了会赋予食品独特的风味和诱人的色泽，还会产生糖基化终末产物(advanced glycation endproducts，AGEs)等有害物质[1]。AGEs 在食品中广泛存在并通过摄入的食品积累在体内，有研究表明食品中羧甲基赖氨酸[Nε-(carboxymethyl)lysine，CML]、羧乙基赖氨酸[Nε-(carboxyethyl)lysine，CEL]是体内AGEs 的主要来源[2]，AGEs 的积累会使人体产生氧化应激反应，对糖尿病、肾病、动脉粥样硬化、阿尔兹海默症等疾病的诱发有着重要影响[3]。相对于低 AGEs 含量的饮食，摄取 AGEs 含量较高的食物容易引起实验动物肾病的发生[4]。因此检测与限制调控食品中的AGEs对于保障食品安全具有重要意义。目前报道的检测方法主要为酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[5]、荧光检测法[6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[7]、液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)[8]。ELISA准确度低，多用于检测总的AGEs含量；荧光检测法则一般用于能够自发荧光的AGEs的检测；GC-MS需要在测试前将样品进行复杂的衍生化；LC-MS/MS则需要复杂的前处理，需要使用固相萃取小柱对AGEs进行净化[9]，单次进样需要进行长时间的色谱分离，费时费力。
实时直接分析质谱(direct analysis in real time mass spectrometry，DART-MS)是一种开放式离子化质谱技术[10], 其主要结构包括DART离子源、轨道式进样器及质谱(图1)。该技术优点在于，对样品前处理要求较低、不需要色谱分离，因此能够对样品进行高通量检测[11]。近年来，DART-MS已经广泛应用于食品领域[12]。本研究以水煮牦牛肉为研究模型，拟建立一种基于DART-MS/MS技术的CML和CEL高通量快速检测方法，并考察外源性抗氧化食品原料苦荞、藤椒对牦牛肉水煮过程中CML、CEL生成的影响。研究结果将为食品中CML和CEL高通量快速检测、开发高品质牦牛肉产品提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牦牛肉，四川省溜溜牛食品有限公司；苦荞粉、藤椒粉，市售。
CML标准品(纯度98%，加拿大TRC公司)；芦丁标准品(纯度98%)，成都普瑞法科技开发有限公司；甲醇(色谱级)，上海易恩化学技术有限公司；正己烷、NaNO2、AlCl3·6H2O，成都市科隆化学品有限公司；高纯N2、高纯He，成都泰竽工业气体有限公司。
图1 DART-MS检测系统
Fig.1 DART-MS determination system
1.2 仪器与设备
DART离子源，美国Ionsense公司；SCIEX 3500 三重四级杆质谱仪，美国AB SCIEX公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液的制备
精确称取CML标准品，用甲醇溶解、稀释配制成质量浓度分别为50.0、30.0、20.0、10.0、5.0、1 μg/mL 的CML标准溶液[13-14]。
1.3.2 牦牛肉样品的准备
将50 g牦牛肉均匀切成1 cm3大小的块，加入200 mL冷水中进行煮制，煮制时分别加入牦牛肉质量0%(对照组)、10%、30%和50%的苦荞粉或藤椒粉，12 min后取出。每组3个平行。
1.3.3 牦牛肉中CML与CEL的提取
参考ZHANG等[15]和HEGELE等[16]的研究：取煮制后的牦牛肉5 g剁碎，将剁碎后的牦牛肉样品放于50 mL离心管中，加入20 mL预冷后的20 g/L三氯乙酸水溶液，除去蛋白沉淀。将上清液采用正己烷脱除油脂，将下清液置于真空离心浓缩机进行浓缩干燥，加入2 mL甲醇水溶液(体积比8∶2)复溶，经0.22 μm 微孔有机滤膜过滤后装入样品瓶中，备用。
1.3.4 苦荞、藤椒总黄酮的测定
根据REMIREZ等[17]的研究方法略作修改后测定苦荞粉和藤椒粉中的黄酮含量。结果以毫克芦丁当量每100g干物质(mg RE/100g DW)计。
1.3.5 质谱条件
DART SVP离子源条件：采用高纯He为工作气体；DART离子源与质谱仪距离2 cm，进样针移动速度为0.6 mm/s；进样体积1 μL。质谱条件：正离子扫描模式，去簇电压40 V，碰撞能量20 V。
1.4 计算方法
1.4.1 基质效应的计算
通过公式(1)计算牦牛肉样品中CML的基质效应。
基质效应
(1)
1.5 数据处理
实验数据采用SPSS统计软件进行分析，使用GraphPad Prism 8进行绘图。
2 结果与分析
2.1 CML和CEL的二级质谱裂解行为及定量离子对选择
预试验表明，CML、CEL均在正离子模式下才有信号，因此，本研究均采用质谱正离子模式进行测试。为了降低CML、CEL的检出限，需要对CML、CEL二级质谱裂解行为进行研究，选择合适的定量检测离子对[多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)]。对牦牛肉样品中CML、CEL分别进行二级质谱扫描，其二级质谱图见图2。
a-CML二级质谱图；b-CEL二级质谱图
图2 牦牛肉样品中CML、CEL的二级质谱图
Fig.2 DART-MS/MS fragments of CML and CEL
由于CML与CEL仅仅相差1个—CH2结构，其二级质谱裂解规律非常类似。本文仅以CML的二级质谱裂解规律为例进行解析。如图2和图3所示，CML的分子离子峰为m/z 205。碎片m/z 130是m/z 205经历氢重排后，脱去1个氨基乙酸基团形成的；碎片m/z 84是由m/z 130脱去1个—HCOOH形成；m/z 142 是由m/z 205依次脱去—H2O、—CO，电子迁移形成双键后脱去—NH3形成。由于碎片m/z 130为最强信号峰，因此CML选择205～130为定量离子对，CEL选择219～130为定量离子对。
图3 样品中CML二级质谱裂解规律
Fig.3 DART-MS/MS cracking law of CML
2.2 DART-MS条件优化
在DART-MS测试样品的过程中，解析气体的温度会显著影响待测样品组分的电离效率[18]。因此，本研究考察了解析气体的温度对CML一级母离子(m/z 205)响应强度的影响。如图4-a所示，随着气体温度从 300 ℃逐渐升至 450 ℃时，CML响应强度逐渐升高；当温度升至 500 ℃时，CML的响应强度开始下降。因此，选用450 ℃为解析气体的最优温度。
栅网电极电压能够减少空气中的杂质离子，可以减少质谱图上的背景干扰[19]。本研究考察了100～300 V的栅网电极电压对待测组分响应强度的影响。如图4-b所示，CML的响应强度在150 V时信号强度最大，随后CML母离子响应强度逐渐降低。因此，选择150 V为最优的栅网电极电压。
去簇电压的大小会显著影响CML(m/z 205)母离子的响应强度。本实验考察了10～50 V 去簇电压对m/z 205离子响应强度。如图4-c所示，随着去簇电压的增加，CML的响应强度先增大后减小，当去簇电压为40 V时，CML母离子峰的响应强度最高。因此，选择40 V为实验的去簇电压。
质谱的碰撞能量也能显著影响CML(m/z 205)二级碎片离子的信号强度。因此，选择合适的碰撞能量值对目标物的定量分析有着十分关键的作用。本研究采用m/z 130作为CML的定量离子，以二级碎片离子m/z 130的响应强度作为指标对碰撞能量值进行优化。如图4-d所示，随着CE值的增大，m/z 130的响应强度先增大后减小；相较于碰撞能量值为15 V时，碰撞能量值为20 V时，二级碎片离子的峰形更佳，且母离子碎裂更加充分，综合考虑，选择20 V作为CML定量分析的碰撞能量。
a-温度；b-栅网电极电压；c-去簇电压；d-碰撞能量
图4 基于DART-MS测定CML的测试条件优化
Fig.4 Optimization of test conditions for CML determination based on DART-MS
采用优化好的质谱条件对CML标准品进行测试，采用MRM模式，以m/z 205～m/z 130作为定量离子对，如图5所示，在2 min内即可完成8次平行样品的测定。由于CML与CEL属于同系物，其理化性质非常相近，采用传统超高效液相色谱-串联质谱(ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)方法检测，色谱分离需要 10 min以上，而 DART-MS/MS方法无色谱分离过程，在常压下能够直接进样，可以大幅缩短分析时长。
图5 CML 8次平行进样的总离子流图
Fig.5 Total ion chromatography diagram of eight parallel injections of CML
2.3 方法学验证
2.3.1 线性方程、相关系数、检出限(detection limit，LOD)及定量限(quantification limit，LOQ)
如图6所示，以峰面积为纵坐标，CML质量浓度为横坐标进行线性回归分析，得到标准曲线和相关系数R2。CML在 1～50 μg/mL，R2为0.996 3，表明线性关系良好。LOD为0.1 μg/g，LOQ为0.5 μg/g。这表明本方法能有效地对CML进行检测，具有良好的灵敏度。
图6 CML标准曲线
Fig.6 Standard curve of CML by DART-MS
2.3.2 基质效应
基质效应是指样品中除目标组分以外的组分在电离过程中，对目标成分可能产生离子增强或者抑制效应[20]。基质效应在定量分析中可能会严重影响待测物的精密度和准确性，因此需要研究 DART-MS 方法测定CML的基质效应。
由于缺少商业化的空白基质(不含CML的牦牛肉)，因此本研究采用自由态AGEs的提取液直接溶解CML标准品，然后使用样品提取溶液对其进行连续稀释。最终牦牛肉中CML加标质量浓度为8.17～53.17 μg/mL，具体见表1。
表1 方法的线性参数、基质效应、检出限及定量限
Table 1 Linear parameters，matrix effect，detection limit and quantification limit of the method
分析物基质校准曲线R2基质效应/%LOD/(μg·g-1)LOQ/(μg·g-1)CML50%甲醇y=25 808x-50 7330.996 3—0.10.5牦牛肉提取液y=21 775x-171 1230.999 2-15.63%0.10.5
当|基质效应|≤ 20 时，可以认为基质效应较弱[21]。由表1可知，牦牛肉中CML的基质效应为-15.63%，表明牦牛肉中的基质对CML含量有轻微抑制作用，但是影响不显著，可以直接采用CML的标准曲线进行定量分析。
2.3.3 回收率与精密度
在样品中添加50、20、5 μg/g 3个质量分数的目标分析物(表2)，每个添加量平行测定5次，分别测定加标回收率和精密度。精密度用相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)表示。结果如表2所示，整体上CML的平均回收率为100.77%～117.36%，RSD为8.22%～9.87%。因此，DART-MS 方法的准确性和稳定性较好，可用于快速检测样品中CML的含量。
表2 方法的加标回收率与精密度(n=5)
Table 2 Results of standard recovery rate and precision of the method
目标物加标量/(μg·g-1)平均回收率/%RSD/%50100.778.22CML20106.059.005117.369.87
2.3.4 苦荞和藤椒对牦牛肉中CML、CEL生成的影响
苦荞和藤椒中含有多种黄酮类物质，具有较强的抗氧化活性，总黄酮含量与抗氧化活性成正相关。本文采用的苦荞粉中总黄酮含量为142.23 mg RE/100g DW，藤椒中总黄酮含量604.86 mg RE/100g DW。由于CML与CEL结构近似，采用上述建立的 DART-MS/MS快检方法对牦牛肉样品中的CEL含量进行估测(以CML计)。实验结果如图7所示，加入苦荞粉煮制后的牦牛肉中的CML和CEL含量逐渐降低，对比空白样，添加牦牛肉质量50%的苦荞粉煮制后，样品中CML含量降低7.72%，CEL含量下降1.46%，具有显著性差异；而加入牦牛肉质量50%藤椒粉煮制后的牦牛肉CML含量相较于空白样品降低了14.51%，CEL含量却增加7.35%，差异极显著，这可能是由于藤椒中富含苏氨酸，在AGEs生成过程中参与了CEL前体物质丙酮醛的生成，导致CEL含量增多。前人研究也发现，在蛋白质糖化早期，木犀草素等黄酮成分能够抑制AGEs形成[22]。苦荞、花椒中均含有多种黄酮类物质[23-24]，这可能是加入苦荞粉后牦牛肉中CML、CEL均显著下降的原因。
a-苦荞粉添加量；b-藤椒粉添加量
图7 苦荞粉、藤椒粉添加量对AGEs的影响
Fig.7 Effect of tartary buckwheat and zanthoxylum schinifolium powder on AGEs 注：ns表示无显著差异(P>0.05)；*表示差异显著(P<0.05)； **表示差异极显著(P<0.01)
3 结论
与UPLC-MS/MS方法相比，DART-MS方法操作简单，结果准确，单次样品测定时间小于30 s，能大幅缩短分析时长，并且不使用流动相，具有环保的优点。消减工艺研究结果表明，苦荞可以同时有效减少牦牛肉在煮制过程中CML和CEL的生成；藤椒能有效减少牦牛肉在煮制过程中CML含量，但却增加了CEL含量，其具体机制有待进一步研究。
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