竹叶花椒(Zanthoxylum armatum DC.)为芸香科花椒属(Zanthoxylum L.)植物的成熟果实，主产于四川盆地及其周边山地和重庆江津一带[1-2]。竹叶花椒因其清香麻鲜的味道和翠绿的色泽受到广大消费者的喜爱，近年来其近成熟的干燥果实常作为“青花椒”商品而备受关注[3]。

挥发油是竹叶花椒香味的主要表征成分，也是其品质评价的主要指标，主要由烯类、醇类、酮类、醛类等成分组成[4]。目前对花椒挥发油的研究主要集中在化学成分分析和药理活性的研究上，如对不同检测方式、不同提取方式、不同炮制方式、不同品种、不同产地的花椒挥发油中的挥发性成分的组成及相对含量的差异进行比较[5-11]，结果表明不同花椒挥发油挥发性成分差异较大，但主要以烯类、醇类成分为主；对花椒挥发油的抑菌、抗炎镇痛、促透皮吸收等药理活性进行研究[12-14]。但目前关于竹叶花椒挥发油中挥发性成分的定量分析研究报道较少，邓凯文等[15]、司昕蕾等[16]仅对花椒挥发油中主要成分芳樟醇、柠檬烯的含量进行了测定，现行的国家食品标准GB/T 30391—2013、四川地方标准SCYCBZ 2019-001等也仅对花椒挥发油的含量做出了要求(≥4%)，对具体成分含量并未做出规定。

鉴于挥发油是竹叶花椒的重要质量评价指标，在前期系统调研的基础上，本文选取了已报道竹叶花椒挥发油中含量较高的12种代表性成分(α-蒎烯、桧烯、β-蒎烯、月桂烯、D-柠檬烯、γ-松油烯、萜品油烯、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯、α-石竹烯、β-石竹烯)，利用气相色谱-质谱/选择离子监测法(gas chromatography-mass spectrometry/selected ion monitor，GC-MS/SIM)建立了竹叶花椒挥发油中多种挥发性成分定量检测的方法，并测定了22个产地竹叶花椒挥发油中12种挥发性成分的含量，以期为竹叶花椒质量评价及其标准提供参考[17-18]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水杨酸甲酯(AF20070751)、1-壬醇(AF20122111)、环己酮(AF20122116)、萜品油烯(AF20122117)、α-石竹烯(AF20122010)、β-石竹烯(AF20032353)、α-蒎烯(AF9091602)、月桂烯(AF20122051)、L-α-松油醇(AF20081520)、D-柠檬烯(AF20051051)、芳樟醇(AF20072551)、桧烯(AF201220)、β-蒎烯(AF20122009)、萜品醇(AF20122006)、乙酸芳樟酯(AF20122007)，均为色谱纯，纯度98%，成都克洛玛生物科技有限公司提供；正己烷为色谱纯，成都科隆化学试剂有限公司。

竹叶花椒样品通过委托不同产地商家代为购买，并在实验室除去多余的杂质和种子，经成都中医药大学陈鸿平教授鉴定样品来源均为芸香科花椒属植物竹叶花椒干燥成熟果皮，样品信息见表1。

1.2 仪器与设备

77890Aglient GC型气相色谱仪、5975 MSD型质谱仪、质谱检索数据库NIST 14、HP-5MS 5%苯基甲基硅氧烷气相色谱柱，美国Aglient公司。

1.3 实验方法

1.3.1 挥发油提取[19]

取竹叶花椒粉末样品，粉碎过2号筛，混匀，每组15 g，称定，平行3次，加水200 mL，振摇混合均匀，浸泡2 h，按《中国药典》2020版四部(2204)挥发油测定甲法蒸馏得到不同产地竹叶花椒挥发油。

1.3.2 溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称定α-蒎烯、桧烯、β-蒎烯、月桂烯、D-柠檬烯、γ-松油烯、萜品油烯、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯、α-石竹烯、β-石竹烯，置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容至刻度，得对照品溶液，质量浓度分别为1.263、1.340、1.249、1.216、7.826、0.699、1.035、9.430、0.279、0.748、0.905、2.943 mg/mL。

内标溶液配制：精密量取称取1-壬醇，加入正己烷稀释并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为1.288 mg/mL的内标溶液。

供试品溶液的制备：取不同产地竹叶花椒挥发油20 μL定容至25 mL，取1 mL至5 mL容量瓶中，加入30 μL 内标溶液，定容，过0.22 μm的微孔滤膜即得。

1.3.3 GC-MS分析条件

气相色谱条件：载气为高纯氦气；体积流量1 mL/min，进样量1 μL，进样口温度230 ℃，分流比30∶1。升温程序：60 ℃保持1 min，以1 ℃/min升温至73 ℃，再以5 ℃/min升温至165 ℃，最后以20 ℃/min 升温至280 ℃，保持5 min。

质谱条件：电离方式为电子轰击离子源(electron impact ion source，EI)，电子轰击能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，溶剂延迟9 min；定性采用全扫描，扫描范围40～500，驻留时间0.2 s。定量采用选择离子扫描模式(SIM)，SIM参数见表2。

2 结果与分析

2.1 色谱分离结果

12种挥发性成分在此条件下分离效果如图1所示。由图1可知在该条件下12种挥发性成分的分离效果较好。

2.2 内标物的筛选

选择1种竹叶花椒挥发油中不含有且不产生，同时与竹叶花椒中挥发性成分性质相似的挥发性物质，沸点相近，挥发后性质稳定，保证其在色谱柱上能与其他挥发性成分分开。本文比较了环己酮、1-壬醇、水杨酸甲酯3种物质，由图2可知其保留时间分别为8.014、22.971、23.903 min，环己酮出峰时间早于其他挥发性成分，而水杨酸甲酯的保留时间与α-松油醇的保留时间(23.759 min)相近，分离效果不佳，故选择1-壬醇作为内标。

2.3 定量离子对的选择

在上述色谱和质谱条件下不同挥发性成分及内标物的离子选择结果见表2。选择其中丰度较高的离子作为定量和定型离子。

2.4 线性范围、检出限、定量限

精密量取混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于5 mL容量瓶中，加入内标溶液30 μL，定容混匀，即得不同质量浓度的混合对照品质量溶液。以内标物质量与对照品响应值之比作为纵坐标，以对照品浓度与内标物浓度之比作为横坐标，进行标准曲线绘制，结果见表3。以目标化合物色谱峰信噪比(S/N)大于3的质量浓度确定检出限，信噪比(S/N)大于10的质量浓度确定为定量限。不同挥发性成分的检出限和定量限如表3所示。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度

取同一对照品溶液，按1.3.3检测条件重复进样6次，计算各挥发性成分峰面积与内标物的比值，测得12种挥发性成分的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)值分别为4.79%、5.25%、4.98%、5.28%、5.81%、5.43%、5.58%、1.43%、4.76%、5.89%、5.03%、4.76%，表明该仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性

取竹叶花椒挥发油(S20)，按1.3.2制备加标试样，分别于0、8、14、18、20、24 h进样，测定并记录各成分与内标物峰面积的比值，测得12种挥发性成分的RSD值分别为1.66%、3.95%、3.79%、4.41%、4.43%、3.31%、2.68%、2.93%、3.92%、3.93%、5.62%、3.69%，表明该供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.3 重复性

取样品S20挥发油溶液，按“1.3.2”项下方法制备平行供试品溶液6份，按照“1.3.2”项下条件进样，计算各挥发性成分峰面积与内标物的比值，测得12种挥发性成分的RSD值分别为4.01%、3.21%、5.00%、3.12%、5.28%、3.44%、4.06%、4.74%、3.98%、2.89%、2.56%、2.91%，表明方法重复性良好。

2.5.4 加标回收率

取竹叶花椒挥发油(S20)，精密加入α-蒎烯、桧烯、β-蒎烯、月桂烯、D-柠檬烯、γ-松油烯、萜品油烯、芳樟醇、α-松油醇、乙酸芳樟酯、α-石竹烯、β-石竹烯对照品，按照1.3.3的条件进行测量,测定结果见表3。RSD在0.007%～5.862%，回收率在98.333%～105.487%，表明该方法准确度较好。

2.6 实际样品的测定

采用本方法对不同产地的22批竹叶花椒中的挥发油进行了提取，并对其中12种挥发性成分进行了定量分析，测定结果见表4。所测定的22个产地的样品中，均含有以上12种挥发性成分，但含量差异较大，不同产地竹叶花椒中12种挥发性成分的含量范围由高到低依次为：芳樟醇(293.938～413.975 mg/mL)、桧烯(33.858～123.442 mg/mL)、D-柠檬烯(28.832～57.988 mg/mL)、月桂烯(13.570～35.067 mg/mL)、乙酸芳樟酯(2.540～24.212 mg/mL)、α-石竹烯(9.115～15.085 mg/mL)、β-石竹烯(6.111～16.675 mg/mL)、α-松油醇(3.058～6.088 mg/mL)、γ-松油烯(1.794～3.515 mg/mL)、α-蒎烯(0.851～3.720 mg/mL)、萜品油烯(0.807～1.421 mg/mL)、β-蒎烯(0.178～0.608 mg/mL)。

2.7 聚类分析

以22批竹叶花椒中12种挥发性成分的含量为数据源，以平方欧式距离进行层次聚类分析,聚类结果见图3。当欧式距离为15时，22批竹叶花椒被聚成三类，其中样品S17、S19、S16、S11聚为一类，S3、S20聚为一类，其余样品聚为一类。整体来看，竹叶花椒挥发性成分与地域关联性不强，如南充市营山县和仪陇县，巴中市平昌县和通江县均被聚为不同的类别，这可能是由于竹叶花椒中挥发性成分不稳定，且不同的产地加工方式、气候条件、栽培品种等多因素导致不同产地竹叶花椒挥发性成分差异较大，从而导致其不能很好地聚类[20-22]。

3 结论与讨论

本实验利用GC-MS/SIM技术建立了同时测定竹叶花椒中12种主要挥发性成分含量的方法，在选择离子检测方式下，仅对待测组分进行定性和定量，减少了杂质峰的干扰，大大提高了检测的灵敏度，该方法所建立的标准曲线线性相关性好、选择性高、专属性强、准确度高、重复性好，可作为竹叶花椒精油质量控制的检测方法[23-24]。

对四川境内22个产地的竹叶花椒挥发油中12种挥发性成分分析发现，不同产地竹叶花椒挥发油中挥发性成分均以芳樟醇、柠檬烯、桧烯为主，但含量差异较大，其挥发性成分无明显的地域差异，这可能是由于加工方式、栽培品种、产地等多种因素造成的。挥发性成分的差异，常会引起药理活性的改变，而本研究采用GC-MS/SIM对竹叶花椒中常报道的12种挥发性成分进行了定量，也为后续挥发油的选择及药理作用的研究提供了实验依据，同时为竹叶花椒的质量控制提供了参考。

参考文献

[1] 祝磊, 陈茜, 黎江华, 等.藤椒来源的考证与定义的思考[J].中草药, 2018, 49(4):987-992.

ZHU L, CHEN X, LI J H, et al.Textual research on origin of Zanthoxylum armatum and consideration of its definition[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2018, 49(4):987-992.

[2] 樊丹青, 刘友平, 陈鸿平.花椒本草考证[J].中药与临床, 2013, 4(6):59-61.

FAN D Q, LIU Y P, CHEN H P.Bencaological study of Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.and Zanthoxylum bungeanum Maxim.[J].Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica, 2013, 4(6):59-61.

[3] 姚佳, 蒲彪.青花椒的研究进展[J].中国调味品, 2010, 35(6):35-39.

YAO J, PU B.Research progress on Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.[J].China Condiment, 2010, 35(6):35-39.

[4] 陈茜, 陶兴宝, 黄永亮, 等.花椒香气研究进展[J].中国调味品, 2018, 43(1):189-194.

CHEN Q, TAO X B, HUANG Y L, et al.Research progress on the aroma of Chinese prickly ash[J].China Condiment, 2018, 43(1):189-194.

[5] 杨玉贤, 高云涛, 邹维, 等.双溶剂微池顶空萃取气相色谱-质谱联用分析竹叶花椒中挥发性成分[J].食品与发酵工业, 2020, 46(22):214-219.

YANG Y X, GAO Y T, ZOU W, et al.GC-MS analysis of volatile components in Zanthoxylum armatum by double solvent micro cell headspace extraction[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(22):214-219.

[6] 罗凯, 朱琳, 阚建全.水蒸汽蒸馏、溶剂萃取、同时蒸馏萃取法提取花椒挥发油的效果比较[J].食品科技, 2012，37(10):234-236;240.

LUO K, ZHU L, KAN J Q.Comparison on extraction of steam distillation, solvent, simultaneous distillation for Zanthoxylum essential oil[J].Food Science and Technology, 2012，37(10):234-236;240.

[7] 王世敏, 王嘉林, 程金朋, 等.GC-MS分析比较昭通产红花椒与青花椒的挥发油组分[J].海峡药学, 2018, 30(1):45-47.

WANG S M, WANG J L, CHENG J P, et al.Evaluation on the essential oils quality from Zhaotong Zanthoxylum bungeanum Maxim.and Zanthoxylum schinigolium Sieb.et Zucc by GC-MS[J].Strait Pharmaceutical Journal, 2018, 30(1):45-47.

[8] 边甜甜, 司昕蕾, 牛江涛, 等.花椒及不同炮制品挥发油与总生物碱的比较研究[J].时珍国医国药, 2018, 29(12):2 937-2 939.

BIAN T T, SI X L, NIU J T, et al.Comparative study on volatile oils and total alkaloids from Zanthoxylum bungeanum and different processed products[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2018, 29(12):2 937-2 939.

[9] 徐双美, 杨森, 李泽娜, 等.GC-MS分析四川主产地竹叶花椒的挥发性成分[J].中国调味品, 2020, 45(12):124-129;133.

XU S M, YANG S, LI Z N, et al.Analysis of volatile components from Zanthoxylum armatum DC.in Sichuan province by GC-MS[J].China Condiment, 2020, 45(12):124-129;133.

[10] 刘飞, 梅国荣, 卢俊宇, 等.GC-MS-AMDIS结合保留指数分析比较花椒与青椒挥发油的组成[J].中国实验方剂学杂志, 2017, 23(5):84-89.

LIU F, MEI G R, LU J Y, et al.Analysis on essential oil from Zanthoxylum bungeanum and Zanthoxylum schinifolium by GC-MS-AMDIS combined with kováts retention index[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2017, 23(5):84-89.

[11] 杨潇, 芮光伟, 蒋珍菊.三种不同方法提取花椒挥发油中化学成分的GCMS/AMDIS比较分析[J].中国调味品, 2014，39(5):118-121;133.

YANG X, RUI G W, JIANG Z J.Comparative analysis of GCMS/AMDIS for chemical components in volatile oils from Zanthoxylum bungeanum Maxim.with three different extraction methods[J].China Condiment, 2014，39(5):118-121;133.

[12] 哈立洋, 杨斌, 尹可欢, 等.竹叶花椒挥发油提取工艺优化及镇痛抗炎活性研究[J].中药药理与临床, 2021, 37(3):127-132.

HA L Y, YANG B, YIN K H, et al.Extraction process optimization of volatile oil from Zanthoxylum armatum DC.and study of analgesic and anti-inflammatory activity[J].Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica, 2021, 37(3):127-132.

[13] 干信, 吴士筠, 高雯琪.花椒挥发油抑菌作用研究[J].食品科学, 2009, 30(21):128-130.

GAN X, WU S J, GAO W Q.Antimicrobial activity of volatile oil from peppers[J].Food Science, 2009, 30(21):128-130.

[14] 蒋丽艳, 刘继鑫, 张浩, 等.花椒挥发油对两种人体蠕形螨的体外抑杀作用[J].医学研究杂志, 2009, 38(2):78-79.

JIANG L Y, LIU J X, ZHANG H, et al.The effect of the volatile oil of Zanthoxylum bungeanum on human Demodex in vitro[J].Journal of Medical Research, 2009, 38(2):78-79.

[15] 邓凯文, 李静, 侯君, 等.花椒挥发油提取并测定其柠檬烯含量[J].西南国防医药, 2020, 30(9):793-796.

DENG K W, LI J, HOU J, et al.Extraction of essential oil from Zanthoxylum bungeanum Maxim.and determination of limonene content[J].Medical Journal of National Defending Forces in Southwest China, 2020, 30(9):793-796.

[16] 司昕蕾, 蔡秀荣, 曹瑞, 等.基于GC-MS技术对甘肃陇南大红袍花椒挥发油柠檬烯 芳樟醇含量的测定[J].中国现代中药, 2019, 21(2):173-175;193.

SI X L, CAI X R, CAO R, et al.Determination of limonene and linalool in volatile oil of Dahongpao Zanthoxylum bungeanum in Longnan by GC-MS[J].Modern Chinese Medicine, 2019, 21(2):173-175;193.

[17] 卢俊宇, 梅国荣, 刘飞, 等.GC-MS-AMDIS结合保留指数分析比较青椒与竹叶花椒挥发油的组成成分[J].中药与临床, 2015, 6(5):18-21;35.

LU J Y, MEI G R, LIU F, et al.The analysis and comparison of components of volatile oil in Zanthoxylum schinifolium sieb.et Zucc.and Zanthoxylum armatum DC.by combination of GC-MS-AMDIS and retention index[J].Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica, 2015, 6(5):18-21;35.

[18] TIWARY M, NAIK S N, TEWARY D K, et al.Chemical composition and larvicidal activities of the essential oil of Zanthoxylum armatum DC.(Rutaceae) against three mosquito vectors[J].Journal of Vector Borne Diseases, 2007, 44(3):198-204.

[19] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(四部)[M].北京:中国医药科技出版社, 2020.

Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People′s Republic of China (IV)[M].Beijing:China Medical Science and Technology Press, 2020.

[20] 杨森, 冯靖雯, 刘友平, 等.热风干燥温度对竹叶花椒干燥特性及品质的影响[J].食品与发酵工业, 2021, 47(12):203-209.

YANG S, FENG J W, LIU Y P, et al.The effect of hot air drying temperature on the drying characteristics and quality of Zanthoxylum armatum DC.[J].Food and Fermentation Industries, 2021, 47(12):203-209.

[21] 李越峰, 张淑娟, 边甜甜, 等.花椒不同炮制品中挥发性成分GC-MS分析[J].天然产物研究与开发, 2020, 32(9):1 470-1 476.

LI Y F, ZHANG S J, BIAN T T, et al.GC-MS analysis of volatile components in different processed Zanthoxylum bungeanum[J].Natural Product Research and Development, 2020, 32(9):1 470-1 476.

[22] 吴素玲, 张锋伦, 孙晓明, 等.杀青等处理对云南昭通青花椒挥发性成分变化的影响[J].中国野生植物资源, 2016, 35(2):19-21;53.

WU S L, ZHANG F L, SUN X M, et al.Effects of fixation treatment on the changes of essential oil components of Zanthoxylum armatum var.novemfolius in Zhaotong, Yunnan[J].Chinese Wild Plant Resources, 2016, 35(2):19-21;53.

[23] TAN S Y, NIU Y J, LIU L, et al.Development of a GC-MS/SIM method for the determination of phytosteryl esters[J].Food Chemistry, 2019, 281:236-241.

[24] 任恒鑫, 吕玉光, 宗希明, 等.GC-MS/SIM法同时测定臭冷杉挥发油中柠檬烯和醋酸龙脑酯含量[J].中国野生植物资源, 2018, 37(1):41-43;50.

REN H X, LYU Y G, ZONG X M, et al.Simultaneous determation of limonene and bornyl acetate in the essential oil from Abies nephrolepis by GC-MS/SIM[J].Chinese Wild Plant Resources, 2018, 37(1):41-43;50.

Determination and comparison of 12 volatile components in volatile oil from Zanthoxylum armatum DC.

YANG Sen1,HE Han1,YI Da2,WANG Fu1,LIU Youping1, CHEN Lin1*,CHEN Hongping1*

1(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China) 2(Nanchong City, Sichuan Province Food and Drug Inspection and Testing Institute, Nanchong 637002, China)

ABSTRACT The aim of this study was to establish a method for simultaneously determine the content of 12 components of α-pinene, Sabinene, β-pinene, myrcene, D-limonene, γ-terpinene, terpinolene, linalool, α-terpineol, linalyl acetate, α-caryophyllene, β-caryophyllene in the volatile oil of Zanthoxylum armatum DC.. Steam distillation was used to extract volatile oil from Zanthoxylum armatum DC. from different origins. Determine the content of 12 volatile components in the volatile oil of Zanthoxylum armatum DC. With 1-nonanol as the internal standard, gas chromatography-mass spectrometry/selected ion monitor technique was used to determine the content of 12 volatile components in the volatile oil of Zanthoxylum armatum DC.. The results showed that the established method could achieve a good separation of the various index components in the sample. In the scope of the investigation, the peak area ratio of the 12 volatile components in the volatile oil of Zanthoxylum armatum DC. and the internal standard substance had good linearity with the mass concentration. The relationship (r>0.999 0), the recovery rate of sample addition was 98.33%-107.09%, and the relative standard deviation was less than 6%. The above-mentioned 12 volatile components were found to be presented in all measured samples, and linalool (293.938-413.975 mg/mL), sabinene (33.858-123.442 mg/mL), D-limonene (28.832-51.788 mg/mL), myrcene (13.570-33.445 mg/mL), linalyl acetate (2.540-24.212 mg/mL), α-caryophyllene (9.115-15.085 mg/mL), β-caryophyllene (6.111-16.675 mg/mL) had higher contents. The method developed here is simple, rapid and accurate, and can be used for the quality control of the volatile oil of Zanthoxylum armatum DC..

Key words Zanthoxylum armatum DC.; volatile oil; gas chromatoraphy-mass spectrometry; volatile components; quantitative method

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.028128

引用格式:杨森，何晗，易达，等.川产竹叶花椒挥发油中12种挥发性成分的测定与比较[J].食品与发酵工业,2022,48(8):270-275.YANG Sen,HE Han,YI Da, et al.Determination and comparison of 12 volatile components in volatile oil from Zanthoxylum armatum DC.[J].Food and Fermentation Industries,2022,48(8):270-275.

第一作者：硕士研究生(陈林副教授和陈鸿平教授为共同通信作者，E-mail：chenlin@cdutcm.edu.cn；chen_hongping@126.com)

基金项目：四川省科技计划项目(2019YFS0159)；成都中医药大学西南特色中药资源重点实验室开放研究基金资助项目(2020QNJS002)

收稿日期：2021-05-27，改回日期：2021-07-20