超声波均质法制备糖基化蛋白-茶油纳米乳液及其稳定性的研究

油茶是我国广泛种植的木本作物,种植面积达453.56 hm2,产业总值达1 160亿元,其主要榨油产品是茶油[1]。具有降血压、降血脂、防止心脏血管硬化、预防肝癌和抗癌疾病的功能[2]。茶油因其富含多种生物活性成分亟待得到更广泛地利用[3],而选择合适的乳液递送系统则是提升茶油稳定性和利用度的极佳方法之一。

当前表面活性剂的应用和乳化技术的普及,使得乳状液在工业以及日常生活中取得了十分关键的地位。利用食品胶体颗粒稳定乳液是荷载生物活性物质和防止油脂腐败变质的有效途径[4]。小分子表面活性剂、多糖和蛋白质等常被作为乳化剂来提高乳液稳定性[5],由于乳化剂吸附在油水界面上可以形成一层稳定的物理屏障,具有一定的保护作用[6],减少界面张力和增加空间位阻,进而改善乳液稳定性[7]。乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)由于具有两亲性结构作为表面活性剂已应用于乳液生产中,但易变性和酸热不稳定性使其应用受限[8],因此需要对WPI进行改性。目前相关研究都证实,经过糖基化改性后的蛋白质的功能特性有了明显改善,如热稳定性、酸碱稳定性等。其本质是多羟基糖分子上的羰基和蛋白质分子上的氨基之间经过共价键结合而得到糖基化蛋白的过程[9]。这类反应称作美拉德反应,经美拉德反应改性后的理化性能更好。

纳米乳液使用在食品包装体系中可以提高产品的储藏性能,丰富产品种类,提高感官特性和加工性能,为产品的创新开发提供一种新途径。与普通的乳液相比,纳米乳液在高液滴体积分数时表现出光学透明性,在低液滴体积分数时表现出良好的黏弹性,并增强了扩散传输和货架稳定性[10]。蛋白质由于具备特定的乳化功能可以用作乳化剂制成纳米乳液,纳米乳液具有很高的动力学稳定性和低失稳性;其次,纳米乳液界面面积相对更高,既有利于消化液作用,也有利于改善功能活性成分的生物利用率[11]。同时,当液滴粒径相较于入射光波长更小时,其散射光会变弱,可具有一定的光学透过性,这也使得产品在外观上具有更好的视觉效果。生产正常采用高能和低能方法制备纳米乳液,低能方法优于高能方法,此方法需要更少的能量,并且不需要复杂的仪器。而高能方法需要较少量的表面活性剂[12],纳米乳液体积小,因此具有很高的动态稳定性[13],这种稳定性可能是有利的,通过消除限制微乳液组成空间的热力学限制,纳米乳液可用更多种类和数量的添加剂进行功能化。因此,纳米乳液具有从药物递送载体到新材料模板的潜在应用[14]。

超声波技术广泛应用于现代食品工业体系,具有明显的优点:可以提高生产率,缩短加工时间,改善机器操作条件和降低成本,也可以用来制备稳定的纳米乳液[15]。超声波处理是纳米材料合成过程中尺寸细化和分散的有效方法,有研究报道,经适当超声波处理对乳化液乳化性能有不同程度的改善[16]。在蛋白质的结构方面,研究表明超声波处理可降低辣木种子水溶性蛋白质β-转角和β-折叠含量,增加α-螺旋和无规则卷曲含量[17]。基于以上,本实验选择了WPI为主要原料,以乳糖作为糖分子对其进行糖基化反应,糖基化蛋白与茶油基于超声波处理技术制备纳米乳液,并对其进行优化研究,对比不同条件下液滴颗粒的大小,以平均粒径作为技术指标,研究糖基化蛋白-茶油乳液体系在不同环境条件下的稳定性,对于提升茶油稳定性和利用价值具有实际意义。本实验是制作水包油乳液,形成的乳液在发挥茶油功效的同时能保持良好的稳定性,为在食品工业生产中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

WPI(95%,纯度),Hilmar Ingredients公司;D-乳糖,四川伯利恒药业有限公司;山茶籽油,榨取自湖北当地油茶作物;实验用水为超纯水;甲醇、异丁醇、异辛烷、NaOH(分析纯) 等,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ME104E/20电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;JY2001电子天平,上海浦春计量仪器有限公司;85-2型恒温磁力搅拌器,金坛市城东新瑞仪器厂;FE20实验室pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;高速剪切机、超声波破碎搅拌机,宁波新芝生物科技股份有限公司;ZEN 3600马尔文粒径分析仪,上海思百吉仪器有限公司武汉分公司;HH-2数显恒温水浴锅,常州荣华仪器有限公司;DHP-9272电热恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;MIX-30S迷你混合仪,杭州米欧仪器有限公司;Min1512台式高速离心机、高速台式冷冻离心机,长沙英秦有限公司;UV-1000紫外可见分光光度计,翱艺仪器(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 糖基化反应产物的制备

将WPI与乳糖(D-lactose, Lac)按质量比1∶1溶解于超纯水,恒温搅拌搅拌12 h,-20 ℃冰箱冷冻,随后取出放入冻干机冷冻干燥3 d,将冻干得到的粉末置于含有饱和KBr溶液的容器中,并放入70 ℃培养箱中反应24 h,取出观察其颜色变化,若无明显变化则再次重复上述步骤,直至溶液颜色出现明显变黄,通过邻苯二甲醛法测定糖基化接枝度并保持批次间的一致性,得到糖基化反应产物(whey protein isolate glycosylation with lactose,WPIL)[18]。

1.3.2 茶油纳米乳液的制备

将一定质量的WPI和WPIL分别溶解在一定量的超纯水中,根据前期的研究进展,制成10 mg/mL的蛋白质溶液。恒温搅拌至少 2 h(25 ℃,500 r/min)后,加入0.2 mg/mL的叠氮化钠(防止微生物生长产生污染)。将WPI溶液放入4 ℃冰箱冷藏11 h,使蛋白质充分溶胀。将蛋白溶液与茶油按一定比例混合后均质(12 000 r/min,2 min)及超声波处理,得到超声处理乳清分离蛋白(ultrasonic whey protein isolate, UWPI)纳米乳液和超声处理糖基化乳清分离蛋白(ultrasonic whey protein isolate glycosylated, UWPIL)和纳米乳液。观察乳液外观变化,并取样经粒径分析仪测定不同pH下乳液平均粒径变化情况。

1.3.3 茶油纳米乳液粒径及多分散系数(polydispersity index,PDI)测定

采用动态光散射仪Malvern Nano-ZEN 3600测量1.3.2节制备的乳液粒径大小、PDI分布情况和外观变化,测量中使用的蛋白质和水的折射率分别为1.450和1.330。分别测量水相pH梯度(3.0、7.0、9.0),油相质量分数(5%～25%)、超声波处理时间(5～15 min)、功率(300～500 W)几种不同因素对粒径的影响。

1.3.4 酸、热稳定性实验

根据1.3.3节所得条件(水相pH 7.0、油相质量浓度10 g/L、超声波处理时间10 min,功率 450 W)制备糖基化蛋白-茶油纳米乳液留存备用,同样条件下制备对照组WPI茶油纳米乳液。调节乳液pH为2.0～9.0,静置30 min,观察乳液外观变化并取样通过粒径分析仪测定不同pH下乳液平均粒径变化情况;将乳液放入不同温度(40～100 ℃)水浴中 10 min,取出后冷却至室温并测定平均粒径和电位。

1.3.5 储藏稳定性实验

按1.3.3节所得的优化条件制备2种乳液,比较研究WPI糖基化产物-茶油纳米乳液的储藏稳定性。将制得的2种茶油纳米乳液置于50 ℃恒温培养箱中放置14 d,每48 h只从其中1个等分取样,测量其粒径、氢过氧化物含量和硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)含量,并观察表观变化。

1.3.6 测定乳液中氢过氧化物含量

将制得的2种纳米乳液和等量的茶油分别置于试管中,50 ℃下加速氧化14 d,每48 h测定1次氢过氧化物浓度。V(样品)∶V(异辛烷)∶V(异丙醇)=1∶6∶4,涡旋30 s,均匀混合, 2 000 r/min离心5 min。取上层有机相溶液0.2 mL,以2∶1的比例混合的甲醇和异丁醇溶液2.8 mL[19],再加入15 μL 3.94 mol/L硫氰酸铵溶液和15 μL亚铁离子溶液(0.132 mol/L BaCl2溶液和0.144 mol/L FeSO4溶液按体积比1∶1混合,涡旋30 s,离心取上清液),涡旋混合15 s,避光静置使之反应20 min后,在510 nm测吸光度。空白组样品为等量异辛烷。以过氧化氢异丙苯为标准物作为标准曲线。过氧化值计算如公式(1)所示:

式中:A,所测样品吸光值;a,标准曲线斜率;b,截距。

1.3.7 测定乳液中TBARS含量

将制得的2种纳米乳液和等量的茶油各等分成7等份置于具塞试管中于50 ℃恒温培养箱中氧化14 d,每间隔1 d测定TBARS浓度[19]。分别取样品、75 mg/mL的三氯乙酸和浓度为2.88 mg/mL的硫代巴比妥酸各2 mL混合均匀后,于95 ℃水浴15 min后迅速冷却至室温,经离心后静置10 min于532 nm条件下测定吸光值,以无水乙醇作空白,以丙二醛乙缩醛为标准物作标准曲线。

1.4 数据统计与分析

每组试验均重复 3次,每个样品的各指标至少平行测定3次,结果表示为

用Excel 2019和Origin Pro2021 软件进行图表绘制。利用SPSS 19统计软件对数据进行单因素方差分析,使用Duncan法对数据进行多重比较,P<0.05,差异显著。

2 结果与分析

2.1 超声波条件下WPIL-茶油纳米乳液的表征

2.1.1 pH对超声波条件下WPIL-茶油纳米乳液稳定性的影响

固定蛋白溶液10 mg/mL,油相质量分数15%,超声波处理功率450 W,时间10 min,研究蛋白溶液的pH对茶油纳米乳液稳定性的影响。由于蛋白溶液在pH值4.0～5.0时,靠近等电点4.8～5.2[20],其中的氨基酸分子与氢离子结合使蛋白质结构更紧密,抑制了其与茶油的结合,导致制得的乳液不稳定,故不可选用。选用了酸性水相pH 3.0,中性水相pH 7.0,碱性水相pH 9.0为代表。由表1可知,WPI及WPIL-茶油纳米乳液的粒径及PDI在水相pH改变时均有明显变化,2种乳液在pH 7.0时均有最小粒径,且PDI的数值也较小,并且改性后乳液的粒径和PDI更小,这说明了对WPI进行糖基化处理有助于制备更稳定的乳液,这也与PIRESTANI等[21]关于糖基化共轭物稳定的乳液显示出更小的平均液滴尺寸和更低的乳析指数,对于稳定乳液更有效的结论相一致。在后续的实验中,选取pH 7.0为制备乳化剂的优化pH值。

2.1.2 超声波条件下油相质量分数对WPIL-茶油纳米乳液稳定性的影响

由2.1.1节的结论,固定水相pH 7.0,蛋白溶液质量浓度为10 mg/mL,超声波功率450 W,超声波时间10 min,研究油相质量分数对茶油纳米乳液稳定性的影响。由图1-a、图1-b得知,改变油相质量分数时,乳液的粒径和PDI均有显著改变。当油相质量分数>10%且逐渐增加时2种乳液的粒径和PDI均逐渐变大,且在实验中发现,当油相分数较大时,超声波处理后的乳液表层会有油滴。这说明茶油没有全部被包裹住。当油相质量分数为5%时其粒径和PDI比质量分数为10%时大。由此可知当油相质量分数为10%时,乳液的稳定性最好。后续实验中,选择油相质量分数为10%制备乳液。

2.1.3 超声波功率对WPIL-茶油纳米乳液稳定性的影响

超声波处理是目前制备纳米乳液的有效处理手段,制备的纳米乳液具有粒径小、稳定性高、乳化剂使用量少、高效环保等特点[22-23]。由2.1.1节和2.1.2节结论,固定水相pH 7.0,油相质量分数10%,超声波时间10 min,研究超声波功率对纳米乳液稳定性的影响。观察图2可知,当超声波功率<400 W时,2种乳液的粒径和PDI均较大,这可能是超声波功率不足,导致油滴表面未能被乳化剂充分覆盖,造成粒径偏大,均一性差。UWPI在400和450 W时,乳液粒径无明显差异,但PDI发生变化,且450 W时2种乳液的PDI均小于0.3,表明乳液的均一性和分散性较好。而当超声波功率>450 W时,2种乳液的粒径和PDI均有所增加,可能是因为超声波功率过大,乳液中的蛋白部分发生聚集现象,导致油滴析出,粒径变大,分散性变差,较高超声波功率对乳液稳定性产生负面影响[24-25]。为制备稳定的纳米乳液,后续实验选择超声功率450 W。

2.1.4 超声波时间对WPIL-茶油纳米乳液稳定性的影响

根据2.1.1、2.1.2节和2.1.3节的结论,固定水相pH 7.0,油相质量分数10%,超声波功率450 W,研究超声波时间对纳米乳液稳定性的影响。由图3可知,在功率450 W时超声波10 min制得的乳液各方面均最优。而超声波时间5 min,测量的粒径偏大,这可能是超声波时间较短,没有完全产生作用。当超声波时间>10 min时,2种乳液的粒径缓慢变大,乳液的稳定性变差,而PDI则逐渐接近0.3,乳液的不均匀程度变大。原因可能是在选定超声波功率下处理时间过长,较长时间的超声波物理作用改变了乳液的粒径和PDI,长时间的超声波空化导致超声波处理引起的空化能量阈值降低了[26],有助于产生更剧烈的空化效应,从而更容易形成粒径小的液滴[27]。后续实验中选择超声波时间10 min。

2.2 酸、热条件下超声波处理茶油纳米乳液稳定性的影响

2.2.1 温度对超声波处理后WPIL-茶油纳米乳液稳定性的影响

由图4-a可知,UWPIL-茶油纳米乳液所放置的温度从40 ℃到100 ℃增加时,乳液的粒径和PDI变化较小。温度为40、50、60、70 ℃时乳液的粒径和PDI无显著变化,说明乳液在此温度范围内较稳定。当温度在80～100 ℃时,乳液粒径和PDI有变化的趋势,两者数值都在缓慢增加。这可能是由于温度的升高造成乳化剂分子结构中的蛋白质部分发生变性,也就是乳化剂发生变性,乳化茶油的能力下降。由于加热处理后蛋白质发生不同程度的变性,使乳化能力逐渐降低,其粒径和PDI逐渐增大,但增长的幅度小,或许是纳米乳液之间存在强静电排斥作用降低了界面蛋白质分子间的相互作用产生的影响[28]。由此可知,经糖基化改性后制备的超声波茶油纳米乳液的热稳定性是比较好的。而图4-b则表现出明显的上升态势,超声波处理蛋白UWPI-茶油纳米乳液的粒径和PDI随温度的升高而增大,乳液分散性变差,说明UWPI-茶油纳米乳液的热稳定性较差,这可能是WPI本身热稳定性较差,当温度变化时其变性程度也增大。对比可知UWPIL-茶油纳米乳液热稳定性比未改性的更好。由此可知,在较高温度的工业生产中,选用糖基化蛋白结合超声波处理可以制作更稳定的茶油纳米乳液,可以更好地将茶油的功效利用到需要较高温度生产的工艺中。

2.2.2 pH对超声波处理后WPIL-茶油纳米乳液稳定性的影响

由图5-a可知,超声波处理后乳液的pH在7.0～9.0时,2种乳液的粒径均没有出现明显变化,说明乳液在此pH区间内较稳定。但当乳液的pH降到5.0时,取样时发现乳液的分散性变差,且粒径发生巨大改变。再次降低乳液pH至4.0,UWPI-茶油纳米乳液的粒径有些许下降但仍然很大,此时乳液极不稳定,出现这种现象可能是WPI的等电点在pH 4.8～5.2[14],蛋白质易沉淀聚集,导致油滴析出,乳液粒径增大[18]。改性后乳液的粒径则出现明显减小,这可能是因为用乳糖糖基化改性后蛋白的等电点在pH 5.0附近,乳液发生聚结而使粒径变大。当乳液的pH为3.0时,乳液粒径又下降且趋于较稳定的数值,pH降至2.0时乳液的粒径轻微减小,此时乳液处于较稳定的状态。再看图5-b中两种乳液在不同pH下的PDI变化。当pH从9.0逐渐降低到7.0时,UWPIL-茶油纳米乳液的PDI逐渐减小并且整体低于UWPI,而pH从7.0逐渐降低到5.0时,UWPIL-茶油纳米乳液的PDI逐渐增大但整体依然低于UWPI,说明乳液逐渐趋向不稳定的状态。但当pH逐渐由5.0降低到2.0时,UWPIL-茶油纳米乳液的PDI又逐渐减小至0.3以下,且处于较均匀和分散性较好的状态。而在整个过程中,UWPI-茶油乳液的PDI除pH 3.0时,在其他pH下乳液PDI均比同样环境条件下改性后的蛋白乳液要大,此时的乳液较不均匀,这与之前的研究结论是一致的[29]。以上分析可以说明在乳液pH从9.0到2.0逐渐降低时,经糖基化改性后制备的乳液基本上更稳定,使茶油在酸碱条件下的稳定性有显著提升,更好发挥茶油功效作用。

2.3 超声波处理对WPIL-茶油纳米乳液的储藏稳定性

由图6-a可知,制得的2种乳液的粒径均呈现增长趋势,但总体增长幅度不大,说明2种乳液的储藏稳定性均较好,但仔细观察发现UWPIL-茶油乳液粒径增幅更小,在相同储藏时间下粒径更低,说明糖基化改性产物更有助于提升茶油纳米乳液的储藏稳定性。由图6-b可知,2种乳液的PDI都出现缓慢增长,这可能是溶液中的茶油发生氧化反应,生成的过氧化物容易分布在乳液的油-水界面上,造成乳液粒径和PDI增大,稳定性降低。UWPI-茶油纳米乳液在储藏6 d后其PDI数值就超过0.3,其后8 d的PDI逐渐增加,第8天时粒径增加到230 nm,这表明此时的乳液已经不再均匀,分散性变差。而UWPIL -茶油纳米乳液的PDI则在第8天后数值才大于0.3,其后几天数值缓慢增长,且均小于或等于UWPI-茶油纳米乳液的PDI数值,直到12 d时粒径才增加至230 nm,较WPI-茶油纳米乳液而言,UWPIL-茶油纳米乳液能保持良好分散性和储藏稳定性。由1.3.5节可知,乳液在50 ℃条件下恒温储藏[30],结合2.2.1节可以得出结论:UWPIL-茶油纳米乳液的储藏稳定性比UWPI-茶油纳米乳液要好。且前者更能承受较高温度,储存时间更久。因此,在研究如何长时间、储存温度高于室温时保存茶油,更多保留功能活性物质,可以制作更稳定的UWPIL-茶油纳米乳液,延长功效时间。

2.4 超声波处理对WPIL-茶油纳米乳液的氧化稳定性

2.4.1 储藏时间对超声波处理后WPIL-茶油纳米乳液ROOH形成的影响

根据1.3.6节的方法配制的待测溶液,茶油样品呈现较深的颜色,乳液样品颜色则较浅,这可能是由于茶油含有的过氧化物较多,因此溶液颜色较深,而乳液将茶油包裹,减少了茶油氧化的可能性,使过氧化物含量比单纯茶油储藏时低,溶液颜色也就相对较浅。结合图7-a分析,前6 d过氧化物浓度上升速度较快,其后8 d较为缓慢,总体水平较低,说明在长时间的储藏过程中茶油被保护的较好。这可能是由于茶油本身含有的低极性多酚物质能有效地抑制脂质过氧化物的产生[31];也可能是制备乳液的过程中经过了超声波处理,超声波的物理作用使蛋白均匀包裹于液滴表面,油滴被保护,被氧化程度降低,且尺寸分布窄,乳液因此达到了稳定的纳米级[32]。但从图7中还是可以看出,2种乳液中,UWPIL-茶油纳米乳液的过氧化物浓度更低一些,进一步说明它的氧化稳定性更好[30]。结合乳液的50 ℃储藏环境,在进行提高乳液氧化稳定性的试验时,表明UWPIL更适合做乳化剂,制备茶油纳米乳液不仅不易氧化,热稳定性好,而且能很好地保存负载物质的功能,使其在长时间储藏中不易氧化变质,更好地运用到食品工业中。

2.4.2 储藏时间对超声波处理后WPIL-茶油纳米乳液次级氧化产物形成的影响

根据1.3.7节的方法配制检测溶液,进一步分析乳液储藏过程中次级氧化产物TBARS含量的变化情况。如图7-b所示,前8 d的中次级氧化产物浓度上升速度较快,后6 d较为缓慢,观测过程中所测得的样品中TBARS含量大小顺序为:UWPI>UWPIL。这个结果表明氧化14 d中UWPIL-茶油纳米乳液的次级氧化产物浓度更低,这也与LI等[33]研究结论一致,可能是由于糖基化改性引入了乳糖分子后可以快速吸附在油滴表面并形成更为稳定的蛋白界面层,更好地包裹茶油液滴从而可以有效减少次级氧化产物的生成,使UWPIL-茶油乳液具有更好的氧化稳定性。

3 结论

以WPI-乳糖糖基化改性产物作乳化剂,采用超声波辅助均质处理制备茶油纳米乳液。通过优化试验发现,当水相pH 7.0,油相质量分数10%,超声波功率450 W,超声波时间10 min时可制备稳定的超声波茶油纳米乳液。超声处理后乳液在pH 7.0～9.0,2种乳液的粒径均稳定, 并且UWPIL/UWPI-茶油纳米乳液的PDI均在 0.3以下,处于较均匀和分散性较好的状态,UWPIL-茶油乳液在pH 7.0时PDI最小,乳液最稳定,并且在储藏过程中粒径始终不超过235 nm,相较于用WPI制备的超声波茶油纳米乳液而言,糖基化蛋白制备的超声波茶油纳米乳液在不同温度、不同pH下更稳定,且储藏稳定性和氧化稳定性也得到了改善。对于提升茶油产品综合开发利用价值和改善茶油的稳定性具有实际参考意义,为拓宽茶油乳液在食品工业中的应用奠定了基础。

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