作为世界蒸馏酒的重要组成部分,中国白酒自西汉时就有记载[1],因其独特多样的工艺、香气和风味,在蒸馏酒市场上受到越来越多的关注[2]。酿造白酒的原料以各种谷物为主,而香型特征的形成与原料的选择和配比具有直接关系,行业内也有“高粱产酒香、大米产酒净、糯米产酒柔、小麦产酒纯”的说法[3]。米香型白酒是以大米为主要原料,经过小曲糖化、液态发酵、液态蒸馏等工艺步骤,酿造出具有“蜜香清雅、入口绵甜、落口爽净、回昧怡畅”香气风格的白酒[4]。在浓清酱米4种基本香型的基础上,白酒衍生出了12种香型[5],且随着工艺的进一步发展,更多衍生香型的白酒也在逐步投入市场[6]。清雅型石湾玉冰烧白酒以大米为主要发酵原料,采用野生菌和各种中草药制作而成的药曲为发酵剂,加水发酵,釜式蒸馏,经过山洞陈酿,酿造出了具有独特风味特征的清雅型石湾玉冰烧白酒[7]。
近年来,随着对白酒香气的研究逐步深入,微量香气化合物对白酒整体风味的影响越来越得到研究人员的重视[8-9]。全二维气相色谱飞行时间质谱(two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry, GC×GC-TOFMS)是在一维气相色谱的基础上开发出来的化学鉴定手段,相比于传统的一维分离,GC×GC-TOFMS具有2个色谱柱,可以更有效的分离出峰时间相近的化合物,改善化合物共流出对定性定量的影响[10]。因此,GC×GC-TOFMS被越来越多地应用到白酒、白兰地等具有复杂挥发性化合物组成的研究中来。如MU等[11]通过优化和验证顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction-mass spectrometry, HS-SPME)与GC×GC-TOFMS检测的方法,用于定量中国白酒中的痕量香气化合物;李元一等[12]采用HS-SPME结合GC×GC-TOFMS和感官分析对来自中国烟台和法国干邑的9种白兰地的香气特征进行了分析和区别;凌与听等[13]采用HS-SPME结合GC×GC-TOFMS系统分析了古井贡酒中的挥发性化合物,并明晰了陈酿时间对于古井贡酒造成的挥发性化合物组成的差异性。
在解析白酒香气属性特征时,感官分析也是不可或缺的方法。目前,定量描述分析(quantitative descriptiv analysis, QDA)实验广泛应用于各类酒精饮料香气的描述和量化中。经过科学训练的感官人员能够准确描述和定量复杂香气中的各类香气属性及其强度[14]。但QDA前期训练的周期长,成本高,促使研究人员逐渐开发并转向更为简单便捷的感官分析方法[15]。快速感官分析技术(Napping®)是一种基于感官位置的摆放从而确定样品相似性和差异性的一种快速感官分析方法[16]。相比于传统的感官分析方法,Napping®的培训难度低、周期短、成本少,近年来在国外的感官实验中越来越多被应用。Napping®和ultra flash profiling(UFP)常常在感官实验中被结合使用,在感官图旁边自由写下描述词,其分析结果可以达到近似于QDA的结果[17]。
清雅型白酒源于米香型,经过酿造工艺的改良,风味与传统米香型具有较大差异,但是其物质特征及风格特点还尚未有过系统研究。因此,本研究以清雅型石湾玉冰烧白酒和传统米香型白酒为研究对象,采用GC×GC-TOFMS仪器分析和Napping®-UFP感官分析技术,对清雅型石湾玉冰烧白酒和传统米香型白酒进行化学分析和感官分析,区别两者之间的化学组成差异和感官属性差异。研究不仅丰富了以大米为主要原料的白酒风味化学的理论体系,同时为其风味的进一步调控提供基础数据和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品
本研究选用了2款清雅型石湾玉冰烧白酒和4款传统米香型成品白酒,每个样品3瓶,具体信息如表1所示。
表1 白酒样品信息
Table 1 Baijiu sample information
编号样品酒精度/%vol1清雅型石湾玉冰烧A402米香A423米香B424清雅型石湾玉冰烧B505米香C536米香D52
1.1.2 试剂
C7～C30直链正构烷烃、愈创木酚(CAS:74495-69-5),均为色谱纯,Sigma-Aldrich公司;NaCl,分析纯,国药集团上海有限公司。
1.2 仪器与设备
全二维气相色谱-飞行时间质谱仪(Pegasus® 4D飞行时间质谱仪,美国Leco公司;KT-2001冷喷调制器,美国Zoex公司;Agilent 7890B气相色谱,美国Agilent公司);MPS2顶空固相微萃取多功能自动进样系统,德国Gerstel公司;2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取头,美国Supelco公司;一维色谱柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Agilent公司;二维色谱柱Rxi-17Sil MS(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Restek公司;Mili-Q超纯水仪,美国密理博公司;电子天平,Mettler-Toledo公司。
1.3 实验方法
1.3.1 感官分析
参考GB/T 16291.1—2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第1部分:优选评价员》和研究室前期已建立的方法[18]进行感官品评人员的筛选和品评小组的组建。实验室通过自愿报名,问卷调查的方式从报名的50人中筛选出22个无不良嗜好,具有白酒品评经验的人,进行感官培训。感官小组进行为期1月,1周1次的感官培训,主要内容包括香气识别测试,差异测试和分类标尺实验检验。最终通过测试的15人组成感官实验小组。
正式实验时,每款白酒中取15 mL放入品评杯中,每一杯随机设置三位数,一起将6款白酒都交给品评员,要求品评员对6款白酒香气进行嗅闻,将6杯白酒按照香气的相似性和差异性放置在A4纸上。在全部摆放完后,在每一杯白酒下用圆圈和对应的数字做标记,并根据香气特点,在每一杯旁边写3～5个香气描述词。
1.3.2 HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析
样品前处理:参考研究室前期已建立的方法[19],使用超纯水将每款白酒按照酒精度稀释到10%vol,取5 mL稀释后酒样于20 mL气相进样瓶中,并加入1.5 g NaCl和50 μL 20.88 mg/L同位素内标愈创木酚。
顶空萃取:采用顶空固相微萃取多功能自动进样系统进行自动进样。在50 ℃下平衡5 min,萃取时间45 min,转速400 r/min,萃取后在进样口解析5 min,接着运行飞行时间质谱的程序,不分流进行3次。
二维气相色谱条件[20]:采用高纯度He(纯度>99.999 5%)为载气,流速1 mL/min,样品运行设置为恒流模式。一维烘箱的起始温度45 ℃,3 min后升温至150 ℃,升温速度4 ℃/min,保持2 min,继续升温到200 ℃,升温速度6 ℃/min,最后升温到230 ℃,升温速度10 ℃/min,保持10 min。二维烘箱的温度一直比一维烘箱高5 ℃。
飞行时间质谱条件:EI电离源,离子源电压70 eV,离子源温度230 ℃,线温度240 ℃。采集质量数范围m/z 35～400,采集频率100 spectra/s。检测器电压为1 430 V。
1.4 数据处理方法
1.4.1 全二维气相色谱飞行时间质谱数据处理
挥发性化合物定性[21]:采用软件自带的解析软件ChromaTOF® 4.61.1.0 software(LECO Corporation)进行化合物的定性。识别信噪比>200的色谱峰,自动解卷积并与软件自带的质谱库进行对比。筛选相似度>700且3个平行中至少检测到2次的化合物,删除含有卤族元素和柱流失的化合物。根据相同运行程序条件下,C7～C30直链正构烷烃的出峰时间,自动计算出各个化合物的保留指数(retention index, RI),保留与文献记录的保留指数相差<50的化合物。
挥发性化合物半定量质量浓度的计算如公式(1)所示:
挥发物浓度
(1)
1.4.2 数据处理
使用R语言处理Napping®-UFP实验数据,并绘制普氏多维向量分析图(procrusts multiple factor, PMFA);SIGMA软件处理差异性化合物数据,并绘制主成分分析(principal component analysis, PCA)图;HTML处理差异性化学物数据,绘制聚类热图。
2 结果与分析
2.1 感官分析
感官实验是进行香气分析的重要一环,往往和化合物分析相关联。通过感官实验明确白酒的特征香气属性及其强弱,对产品的工艺环节和消费偏好都有重要的指导意义。Napping®是一种快速感官分析方法,目前已广泛应用于各类食品风味的解析中[22],而在白酒风味感官实验中还尚未见报道。为了明确清雅型石湾玉冰烧白酒香气的风格特点以及和米香型白酒的差别,本研究采用快速感官分析技术Napping®-UFP进行分析。汇总和处理Napping®和UFP实验结果后,分别绘制6种白酒的聚类特征图和香气特征相关性图(图1)。观察Napping®实验结果绘制出的聚类特征图(图1-a),2款清雅型石湾玉冰烧白酒聚在一起,位于x轴左侧,而4款米香型白酒聚在一起,位于x轴右侧,这说明清雅型石湾玉冰烧白酒和米香型白酒在香气特征上具有明显的差异,且这种差异远大于酒精度带来的区别。结合UFP实验结果绘制出的香气特征相关性图(图1-b)发现,清雅型石湾玉冰烧白酒在植物、油脂香、中药、甘草、薄荷、雪碧等属性上明显区别于米香型白酒,而米香型白酒的香气则更多表现为米香以及水果、蜂蜜、糖果等甜香的香气特性。
a-聚类特征;b-香气特征相关性图
图1 清雅型石湾玉冰烧和米香型白酒Napping®结合UFP的普氏向量分析
Fig.1 Procrustes multiple factor analysis of Napping® with UFP between QINGYA flavor and rice flavor Baijiu
2.2 HS-SPME-GC×GC-TOF/MS分析
2.2.1 挥发性化合物组分定性分析
采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS,在清雅型石湾玉冰烧和米香型白酒中共定性出了400种挥发性化合物见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035392),其中2款清雅型石湾玉冰烧白酒中含有292种,具体各类别挥发物结果见表2。2款清雅型石湾玉冰烧白酒中鉴定出的挥发性化合物中含有酯类化合物78种,米香型白酒中鉴定到的酯类化合物数量大致相同,有83种。以往的白酒香气化合物研究中,酯类化合物的往往数量最多[23],这与本实验结果相符。从单个样品来看,2款清雅型石湾玉冰烧白酒的酯类化合物均多于对照组米香型白酒。由于主要原料是大米或者糯米,大量氨基酸在酵母的作用下转化为高级醇[24],因此大米为原料酿造的白酒往往具有较多的醇类物质。本研究在清雅型石湾玉冰烧和米香型白酒中共检测到55种醇类化合物,其中清雅型石湾玉冰烧中含有52种,而米香型白酒占40种。某些高级醇具有调和香气和后味的作用,而醛类化合物主要起到影响香气释放和香气质量的作用[25]。清雅型石湾玉冰烧白酒中的醛类化合物的种类明显高于米香型白酒。己醛类的醛类化合物往往给白酒带来生青、草本类的香气[26]。清雅型石湾玉冰烧检测到的萜类化合物共有25种。先前的研究中,何张兰等[27]通过对肉桂叶的挥发性香气化合物进行检测分析,发现其中含有多种萜类化合物。而清雅型石湾玉冰烧白酒的制曲过程中加入了甘草、肉桂叶、八角等多种中草药,因此酒中检测到大量的萜类化合物可能部分会来源于酒曲中加入的中草药,同时萜类物质也是感官特征中植物、中草药香气的重要来源。此外,从检测到化合物的数量来看,清雅型石湾玉冰烧白酒比米香型白酒含有的化合物更多。
表2 HS-SPME-GC×GC-TOFMS中鉴定的挥发性化合物
Table 2 Volatile compounds identified in HS-SPME-GC×GC-TOFMS
种类清雅型石湾玉冰烧A米香A米香B清雅型石湾玉冰烧B米香C米香D酯类715757705758醇类463726443227醛类362323342323酮类151214171311酸类1288986醚类753511萜类191015212216酚类584675芳香族19241617137呋喃12541075内酯332332含硫562633其他20121227168总数270210186269205172
2.2.2 挥发性化合物组分半定量浓度分析
并不是所有的挥发性化合物都具有香气特征,因此又进一步通过检索Flavornet Home(http://www.flavornet.org/index.html)和Flavor DB(https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)2个香气数据库,对定性出的挥发性化合物进行筛选,锁定了292种具有香气特征的挥发性化合物。将上述香气化合物的半定量浓度[见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035392)]进行单因素方差分析,筛选具有显著差异的化合物(P<0.01),并依据半定量浓度进行聚类热图分析和主成分分析。根据PCA结果(图2)可以发现,2款清雅型石湾玉冰烧白酒和对应的米香型白酒分别位于X轴两侧,这表明清雅型石湾玉冰烧白酒在差异性香气化合物种类和浓度方面明显区别于米香型白酒。
图2 清雅型石湾玉冰烧和米香型白酒差异性化合物主成分分析
Fig.2 PCA of differential compounds between QINGYA Shiwan Yubingshao and rice flavor Baijiu
热图的聚类结果(图3)同样验证了PCA的结果,6款白酒中2个香型的白酒分别聚成一类,说明在显著差异性化合物的种类和浓度上,清雅型石湾玉冰烧和米香型白酒均具有各自的特征。热图显示清雅型石湾玉冰烧白酒中含量较高的物质主要是醛类、醇类、萜类等化合物。酯类化合物是白酒香气中贡献水果属性的重要化合物,清雅型石湾玉冰烧白酒中酯类化合物较多,但XU等[23]研究中具有重要香气影响的酯类化合物(如异戊酸乙酯、乙酸苯乙酯)在米香型白酒中的浓度更高,这和感官结果中米香型白酒具有更多更强的水果香气属性相符。清雅型石湾玉冰烧中较多醛类和醇类化合物的浓度明显高于米香型白酒,这2类物质往往贡献出生青和植物的香气,极有可能是清雅型石湾玉冰烧感官特性中各类植物香气属性的来源。alpha-松油醇和反式橙花叔醇等萜类化合物在清雅型石湾玉冰烧中的浓度略高于米香型白酒,这些萜类化合物的阈值往往极低,可能是构成植物类和香料类香气属性的关键香气物质。感官实验结果中清雅型石湾玉冰烧具有较为明显的烘焙类香气,这可能由呋喃和内酯类化合物贡献。许多呋喃类化合物的阈值偏低,且具有烘焙、坚果类的香气,往往是构成白酒中烘焙粮香属性的重要化合物。显著差异性化合物中,呋喃类化合物数量较多,其中2-戊基呋喃和糠醛等化合物的含量较高,明显多于米香型白酒。糠醛作为一种具有杏仁、焦香香气的挥发性化合物,被证明是酱香型白酒和芝麻香型白酒的重要呈香物质[28]。而清雅型石湾玉冰烧中含有浓度明显高于米香型白酒的糠醛,这可能是造成清雅型石湾玉冰烧白酒中焦糖和杏仁属性的重要物质。
图3 显著性差异香气组分热图分析和 HCA 聚类分析
Fig.3 Heat map and HCA clustering results of aroma compounds with a significant difference in QINGYA Shiwan Yubingshao and rice flavor Baijiu
注:图中数字编号对应样品信息见表1,纵坐标为香气物质CAS号。
3 结论
以清雅型石湾玉冰烧白酒和米香型白酒为研究对象,采用GC×GC-TOFMS结合Napping®-UFP感官实验,探究其香气的化学构成和感官差异。GC×GC-TOFMS定性出了400种挥发性化合物,通过香气数据库筛选出了292种香气化合物,以酯类、醇类、醛酮类、萜类化合物为主。聚类热图和PCA结果显示,清雅型石湾玉冰烧白酒和米香型白酒在香气化合物的种类和浓度具有明显差异。Napping®-UFP结果显示,植物、油脂香、中药、甘草、薄荷、雪碧是清雅型白酒区别于米香型白酒的主要香气属性。该研究明确了清雅型石湾玉冰烧白酒的风味组成和感官特性,丰富了以大米为主要原料的白酒风味化学研究体系。
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