麸质，即面筋蛋白，是小麦、黑麦、大麦、燕麦及其杂交种和衍生种中含有的一类蛋白质片段[1]。国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission，CAC) 规定，不含麸质的原料生产的食品，或者是原料中含有麸质，但经加工处理已去除麸质或麸质含量低于20 mg/kg，满足这一规定即为无麸质食品[2]。无麸质食品可以满足麸质过敏人群以及乳糜泻患者的饮食需求。乳糜泻(celiacdisease，CD)是最常见的麸质敏感性肠病，主要症状有腹泻、贫血、骨质疏松等[3]。乳糜泻为自身免疫性疾病，即携带遗传易感基因个体因摄入含麸质食品诱发的多种肠胃及肠外疾病[4]。调查发现，欧美国家乳糜泻发病率约为1%[5]，个别地区高达2%，且患者人数仍在不断增长。目前，控制含麸质食品的摄入是治疗乳糜泻的唯一方式。
当前国外市场上已有较成熟的无麸质食品，而我国对无麸质食品研究仍处于起步阶段。无麸质食品的原料主要有大米、玉米、高粱、荞麦、小米、马铃薯和藜麦[6]。由于大米的蛋白质含量适中，具有低过敏性，是制作无麸质食品的合适谷物之一[7]。由于原料不含麸质，即面筋蛋白，使得无麸质食品不易成型且结构疏松，目前的研究主要采用多种原料复合或添加品质改良剂模拟面筋蛋白的性质，以提高产品品质。
马铃薯蛋白是由19种氨基酸组成的完全蛋白质，其营养价值可与鸡蛋蛋白相当[8]， 而马铃薯蛋白微凝胶是一种具有三维交联网状结构的胶体颗粒，被认为是安全和非过敏性的，可用于无麸质饮食，但是目前关于马铃薯蛋白及其微凝胶在无麸质面团方面的研究较少。因此，本研究以低过敏性的大米粉为原料，添加马铃薯蛋白(potato protein，PP)、马铃薯蛋白微凝胶(potato protein microgel，PPM)、马铃薯蛋白/黄原胶复合物(potato protein/xanthan gum，PPXG)和马铃薯蛋白/黄原胶复合微凝胶(potato protein/xanthan gum microgel，PPXGM)，研究其对无麸质大米面团流变特性和微观结构等的影响，并进一步探索其对无麸质大米馒头品质的影响机理。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
马铃薯蛋白(蛋白质量浓度900.1 g/L)，兰州沃特莱斯生物科技有限公司；黄原胶，广州市威希生物有限公司；金龙鱼优质大米(碳水化合物75%，蛋白质5%，脂肪1.4%)；金龙鱼吉林分公司；盐酸，洛阳昊华化学试剂有限公司；NaOH、Na2HPO4和NaH2PO4，天津市大茂化学试剂厂。
AL 204 电子分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；HA-3480AS 和面机，克莱美斯机电科技(深圳)有限公司；DZM-140 电动压面机，永康市海鸥电器有限公司；HR-1 Discocvery流变仪、TA.XT plus 物性测定仪，美国TA公司；Vertex 70 傅里叶变换红外光谱仪，美国赛默飞公司；JEM-6490LV 场发射扫描电子显微镜，日本JEOL公司；BVM 6600 体积测定仪，波通瑞华科技仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 马铃薯蛋白微凝胶的制备
根据刘振艳[9]的方法略有改动。称取一定量马铃薯蛋白粉于去离子水中，使蛋白质质量浓度为40 g/L，室温搅拌3 h后，放置在4 ℃冰箱中过夜。用0.1 mol/L的NaOH溶液或者HCl溶液调节其pH值为6.0，90 ℃水浴加热30 min，立即放入冰水中冷却至室温。将冷却后的溶液4 000 r/min离心30 min 除去不溶性沉淀得微凝胶溶液，之后将微凝胶溶液冻干保存。
1.2.2 马铃薯蛋白-多糖微凝胶的制备
根据夏晓凤[10]的方法略有改动。称取一定量马铃薯蛋白粉及黄原胶溶于去离子水中，使蛋白质量浓度为10 g/L，多糖浓度分别为0.5～10 g/L，搅拌3 h后，放置于4 ℃冰箱中过夜。
搅拌条件下将黄原胶溶液和马铃薯蛋白溶液按照体积比10∶1混合，搅拌4 h后，用0.1 mol/L的NaOH或者HCl溶液调节pH值至2.0～4.0，搅拌4 h，90 ℃水浴加热30 min，冷却至室温，得到马铃薯蛋白/黄原胶微凝胶。
1.2.3 马铃薯蛋白-黄原胶复合物的制备
根据夏晓凤[10]的方法略有改动。称取一定质量的马铃薯蛋白粉(质量分数为1.00%)和黄原胶，分别用去离子水进行溶解，持续搅拌3 h，将制备好的溶液放入4 ℃冰箱中过夜；将黄原胶溶液加入到溶液中，持续搅拌4 h，使用浓度为0.1 mol/L的HCl溶液将上述溶液pH 值分别调节至2.0 ～4.0，得到PP-XG复合溶液，冻干保存，备用。
1.2.4 面团的制备
在大米粉中分别添加质量分数为2.5%、5.0%的PP、PPM、PPXG、PPXGM，添加85%的水，以大米面团作为对照样品。
1.2.5 面团流变特性的测定
采用20 mm的铝平板，间隙为1.0 mm，温度为25 ℃，设置频率为1 Hz，首先通过振幅扫描确定线性黏弹区。实验过程中待上夹具降低到1.05 mm处切边，为防止水分蒸发涂抹一层薄薄的甲基硅油。然后将夹具降低到1.0 mm进行测试[11]。
温度扫描测定：扫描范围25～90 ℃，升温速率5 ℃/min，应变为0.5%，频率为1 Hz。
1.2.6 傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)的测定
将上述制备的大米面团进行真空冷冻干燥，粉碎后过100目筛。将样品与光谱纯溴化钾按质量比(1∶50)混合，均匀研磨，使用配套压片机制片。用红外光谱仪在400～4 000 cm-1扫描。用Peak Fit 4.12对酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1)进行图谱分析，先进行基线校正，之后二阶导数拟合，直至拟合残差最小。
用Omnic 8.0 软件处理谱图，采用傅里叶去卷积处理800～1 200 cm-1特征峰，参数选择半峰宽为 38 cm-1，增强因子为1.9。利用Peakfit 4.12 软件对谱图进行分峰处理，计算1 045、1 022和995 cm-1的峰强度[12]。
1.2.7 微观形貌的测定
大米面团的微观结构变化采用场发射扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope，FESEM)观察，样品喷金处理，加速电压为20 kV，放大倍数为2 000倍。
1.2.8 馒头的制备
称取100 g大米粉，添加不同质量分数(2.5%和5.0%)的马铃薯蛋白微凝胶，1%的酵母，根据Mixolab混合实验仪最佳实验条件下所推荐加水量添加合适的水，混匀后在37 ℃，湿度85%恒温恒湿箱中发酵1 h，手工揉制成型，相同条件下醒发10 min，在沸水锅中蒸30 min后取出，室温冷却1 h备用[13]。
1.2.9 馒头比容的测定
将冷却后的馒头称重，之后在体积测定仪上测试，馒头体积与质量的比值即比体积，馒头的比容测试参照GB 21118—2007《小麦粉馒头》。
(1)
式中：λ,馒头比容，mL/g；V,馒头体积，mL；m,馒头质量，g。
1.2.10 馒头质构的测定
将冷却后的馒头，切成2 cm×2 cm×0.5 cm的块状。使用TPA质构模式测试。探头为P/36R，测前速度1.0 mm/s，测试速度1.0 mm/s，测后速度1.0 mm/s，触发力5.0 g，压缩比50%，2次压缩间隔3 s[14]。
1.2.11 统计分析
用Microsoft Excel 2010进行数据处理，用Origin 8.5绘图。利用 SPSS 17.0 软件进行显著性分析，采用Duncan’s多重比较法进行显著性检验(P<0.05)，实验均重复3次取平均值，数据以平均值±标准偏差表示。
2 结果与讨论
2.1 马铃薯蛋白微凝胶对大米面团流变特性的影响
在和面搅拌、发酵和蒸煮过程中，面团中的淀粉会发生糊化，蛋白质发生变性，面团流变学特性也因此改变[15]。添加 PP 和 PPM 的大米面团的弹性模量(G′)、黏性模量(G″)和tanδ随频率变化曲线如图1所示。温度在25～50 ℃，弹性模量(G′)和黏性模量(G″)略微下降。在50～75 ℃，大米面团内的淀粉吸水膨胀发生糊化，G′和G″迅速增加达到峰值。75 ℃时，与对照相比，添加PP和PPM降低了面团的G′，尤其是添加量为5.0%时，G′显著降低。这与杨翠红[16]发现在加热过程中乳清分离蛋白可抑制玉米淀粉的膨胀糊化的研究结果一致。这可能是因为升温过程中二者的相互作用增强，蛋白质对淀粉的束缚作用抑制淀粉颗粒进一步糊化。另一方面可能由于蛋白质的存在稀释了淀粉的相对浓度，从而延缓了颗粒的糊化膨胀过程。但是，添加PPXG和PPXGM面团的G′和G″高于添加PP和PPM的面团，温度升高引起蛋白质的弱化和分子动能增加，面团变软，而体系中的黄原胶可能在一定程度上降低了这种弱化作用[17]。
损耗角正切tanδ是G″与G′的比值，值越高代表样品的黏度越大，可反应加热过程中面团结构的变化。在整个升温过程中，所有样品的tanδ值均<1，说明大米面团的弹性特征高于黏性特征。当测试温度为25～50 ℃时，tanδ略微增加，随着温度升高，面团的流动性增强，蛋白质分子链的热运动因温度升高而增加，但在该温度范围内其结构并未发生改变。在50～75 ℃，tanδ迅速增加，说明面团微观结构发生改变。一方面大米淀粉吸水膨胀导致面团强度下降；另一方面温度升高可能会导致马铃薯蛋白微凝胶的结构弱化。温度在75～100 ℃，大米淀粉完全糊化，tanδ迅速下降，说明出现了高度结构化的网络。温度>80 ℃，所有面团的tanδ依然降低，说明其微观结构持续变化，这可能是由高温下蛋白质形成的某种键引起[18]。
a-添加量2.5%的G′；b-添加量5.0%的G′；c-添加量2.5%的G″；d-添加量5.0% G″； e-添加量2.5%的tanδ；f-添加量5.0%的tanδ
图1 大米面团的温度扫描曲线
Fig.1 Scanning curve of rice dough temperature
2.2 马铃薯蛋白微凝胶对大米面团中蛋白二级结构的影响
红外光谱技术是一种非破坏性的可用于研究异质食品和生物体系分子结构的光谱技术。这种方法已经被用来分析蛋白质结构、面团流变特性和小麦面包工艺性能之间的关系[19]。与对照相比，添加PP、PPM、PPXG和PPXGM后，α-螺旋和无规则卷曲含量降低，β-折叠含量增加，β-转角含量略微降低(表1)，就所有样品而言，2.5%的添加量使得α-螺旋含量降低程度较小，5.0%的添加量使得β-折叠含量增加较多。一般来讲，蛋白质结构的有序性与α-螺旋含量呈正相关，蛋白质结构的稳定性和β-折叠含量呈正相关，且β-转角与面团的柔韧性有关。添加PP、PPM、PPXG和PPXGM后，无麸质大米面团中蛋白的有序性降低，但稳定性增加，结构变得更加稳定，推测是淀粉颗粒与蛋白或蛋白质微凝胶通过非共价相互作用所致,尤其是氢键，从而改善了面团的混合性能[19]。此外，添加5.0%的PPM和PPXGM后，面团中β-折叠含量最高，说明此时面团的结构稳定性最高。
表1 大米面团中蛋白的二级结构变化
Table 1 Secondary structure changes of protein in rice dough
质量分数/%蛋白二级结构单元相对百分含量/%α-螺旋β-折叠β-转角无规则卷曲对照39.04±0.87a28.01±1.15f16.92±0.51ab14.01±0.54aPP2.537.55±0.86bcd30.84±0.71bcd16.62±0.13ab12.55±0.23bc5.037.53±0.57bcd31.14±0.60bcd16.29±0.21bc12.58±0.30bcPPM2.538.10±0.46ab30.62±0.65cde16.44±0.04abc12.45±0.34bc5.035.60±0.81e33.05±0.61a17.07±0.56a11.81±0.36cPPXG2.538.56±1.17ab29.16±0.41ef16.78±0.41ab13.17±0.77ab5.036.63±0.14cde32.06±0.34abc15.10±0.56d12.75±0.62bcPPXGM2.537.87±0.64abc29.73±1.12de16.39±0.03abc13.79±0.39a5.036.37±0.68de32.24±1.22ab15.82±0.24c12.55±0.50bc
注：同一列中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.3 马铃薯蛋白微凝胶对大米面团微观结构的影响
图2为大米面团的扫描电镜图。对照组大米面团的结构中淀粉颗粒彼此分离，呈现疏松状，可观察到各自淀粉颗粒的多边形形状。添加PP、PPM、PPXG和PPXGM后，淀粉颗粒被包裹在弱的蛋白质凝胶基质中，不同程度改善了面团的微观结构，且添加量的增加对微观结构有积极的影响。添加PPXG和PPXGM后，淀粉颗粒几乎完全被一层蛋白质微凝胶膜所覆盖，尤其是添加5.0% PPXGM，推测是淀粉颗粒与马铃薯蛋白微凝胶通过非共价作用形成了更加紧密的结构,主要是氢键作用的影响，有助于面团的形成[20]。这与SARABHAI等[21]的研究结果类似，无麸质饼干的面团中淀粉颗粒被蛋白膜覆盖，结构变得更加紧密。这有助于面团网络的形成。
a-对照；b-2.5%马铃薯蛋白；c-5.0%马铃薯蛋白；d-2.5%马铃薯蛋白微凝胶；e-5.0%马铃薯蛋白微凝胶；f-2.5%马铃薯/黄原胶复合物； g-5.0%马铃薯/黄原胶复合物；h-2.5%马铃薯/黄原胶复合微凝胶；i-5.0%马铃薯/黄原胶复合微凝胶
图2 添加马铃薯蛋白微凝胶后无麸质大米面团的微观结构
Fig.2 Microstructure of gluten-free rice dough after adding potato protein microgels
2.4 马铃薯蛋白微凝胶对大米馒头比容的影响
比容是衡量馒头品质的重要指标之一。比容较大的馒头芯硬度较小，质地较为柔软，消费者接受度较好。马铃薯蛋白微凝胶对大米馒头比容的影响如图3所示。PPXG和PPXGM的添加使无麸质大米馒头的比容显著增加，马铃薯蛋白与黄原胶复合后对比容的影响优于单独的马铃薯蛋白。单独大米馒头的比容为1.14 mL/g，添加5.0%的PP、PPM、PPXG和PPXGM后，馒头的比容依次为1.18、1.21、1.48、1.44 mL/g。WITCZAK等[14]发现，2%的马铃薯蛋白添加量会增加无麸质面包的体积，但6%～10%添加量会导致体积降低。马铃薯蛋白微凝胶的2种添加量均未造成馒头比容的明显降低，尽管添加5.0%的PPXGM后，比容略微下降，但不显著(P>0.05)。大米馒头比容的增加说明马铃薯蛋白微凝胶充当了面筋蛋白的角色，与大米淀粉通过非共价相互作用稳定面团内的气泡结构，改善了大米面团在发酵过程中的持气性。此外，PPXG和PPXGM与大米淀粉相互黏结，减少其流动性，从而有效保持发酵过程中产生的气体，从而增加比容[22]。在添加量为2.5%时，PPXGM的效果高于PPXG，且在添加5.0%的PPXGM后，微凝胶颗粒网络结构使得比容比对照组提高了26.3%，效果显著。
图3 添加马铃薯蛋白微凝胶对大米馒头比容的影响
Fig.3 Effect of adding potato protein microgels on the specific volume of rice steamed buns
2.5 马铃薯蛋白微凝胶对大米馒头质构特性的影响
质构可用于评价产品的品质，判断其可接受性。添加不同比例的马铃薯蛋白微凝胶对大米馒头的质构影响如表2所示。硬度、咀嚼性和胶着性与产品的品质呈负相关，值越大口感越差。硬度大，咀嚼困难，胶着性强，口感粘牙。弹性和回复性与产品品质呈正相关，值越大口感越好。与对照相比，添加PP、PPM、PPXG和PPXGM后，馒头的硬度、胶着性和咀嚼性降低，弹性升高，添加PP和PPM可增加馒头的回复性，添加PPXG和PPXGM却降低了回复性。对于同一个样品，添加量越大，效果越明显，且所有样品的硬度、咀嚼性、胶着性和弹性变化趋势相同。以硬度的变化为例，添加2.5%和5.0%的PP，硬度分别下降8.36%和11.48%；添加PPM后，硬度分别降低18.60%和25.95%；添加PPXG后，硬度分别降低25.94%和43.34%；添加PPXGM后，硬度分别下降39.14%和52.17%。馒头品质依次为PPXGM>PPXG>PPM>PP>对照。于亚洲[23]发现乳清蛋白和乳清蛋白冷凝胶均可降低大米面包的硬度，增加面包的弹性和回复性，与本研究结果类似。TOMIC等[24]发现添加蛋白质后无麸质小米面包的硬度会降低，可能与面包较高的比容和较大的气室数量有关。这说明面包的比容与硬度呈负相关。添加PPXGM后馒头硬度的降低是由于其较强的持水能力可阻止水从馒头内部向外部的运输，从而降低了馒头的硬度[25]。添加PP、PPM、PPXG和PPXGM 后，胶着性降低，弹性增加，馒头表现出柔软、爽口的品质。总之，马铃薯蛋白微凝胶的添加对大米馒头的品质均具有一定程度的改善作用。这可能是因为马铃薯蛋白微凝胶具有较好的乳化性，可与面团里的脂质结合，增强面团的韧性和持气性，使馒头的比容增加，质构特性得以改善。
表2 马铃薯蛋白微凝胶对大米馒头质构特性的影响
Table 2 Effects of potato protein microgels on the texture of rice steamed buns
质量分数/%硬度/g弹性胶着性咀嚼性/g回复性对照2 409.20±24.16a0.87±0.04c2 014.15±15.14a1 841.00±34.16a0.47±0.00dePP2.52 207.68±70.71b0.90±0.00bc1 869.98±58.50b1 682.26±55.05b0.49±0.00bc5.02 132.68±84.87b0.96±0.00a1 777.41±59.77bc1 699.29±56.01b0.48±0.01cdPPM2.51 961.01±5.75c0.90±0.00b1 685.24±25.12cd1 437.58±129.52c0.50±0.00b5.01 783.98±119.04d0.92±0.01ab1 584.29±116.11de1 465.06±129.42c0.55±0.02aPPXG2.51 784.18±45.53d0.93±0.01a1 471.70±31.37e1 374.75±18.42c0.44±0.00f5.01 365.02±29.51e0.92±0.01ab1 111.10±19.17g1 026.54±10.80e0.44±0.00fPPXGM2.51 466.20±88.68e0.95±0.03a1 240.53±92.12f1 182.28±48.89d0.45±0.01ef5.01 152.41±60.10f0.94±0.00a941.30±51.44h885.35±50.84f0.44±0.01f
3 结论
在大米面团中加入质量分数为2.5% 和5.0%的PP、PPM、PPXG和PPXGM，可对面团的流变特性和微观结构产生不同的影响。添加PPXG和PPXGM可增加无麸质大米面团的G′和G″，降低面团的tanδ，提高了面团加工性能。添加PP、PPM、PPXG和PPXGM后，α-螺旋和无规则卷曲含量降低，β-折叠含量增加，尤其是5.0%的PPM和PPXGM使无麸质大米面团的结构更加稳定。PPXG和PPXGM相对于PP和PPM更能提高面团的持气性，增加馒头的比容。添加马铃薯蛋白微凝胶后馒头的硬度、胶着性和咀嚼性降低，弹性升高，添加PPXGM的馒头品质相比PP、PPXG、PPXGM更好。大米馒头既符合中国人的饮食习惯，又能满足麸质不耐受患者的需求。
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