2型糖尿病作为世界公共卫生难题，其发病率占糖尿病总发病率的95%，严重威胁人类健康[1-3]。除胰岛细胞功能受损导致胰岛素分泌不足之外，因组织对胰岛素敏感性降低而引起的胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的最根本原因[4-5]。胰岛素抵抗主要发生在肝脏、肌肉和脂肪等组织中，其中肝脏是摄取、合成及代谢葡萄糖的主要场所，其在维持机体血糖平衡中发挥着直接作用[6]。胰岛素抵抗不仅会进一步加剧胰岛细胞功能损害，引起骨质疏松、周围神经病变等并发症，而且还往往与非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝癌的发生发展息息相关[5,7]。
壳寡糖(chitooligosaccharides，COS)是由海洋生物甲壳提取而成的低聚寡糖，其在抗炎、降血脂、提高免疫力及保肝等方面具有良好疗效[8]。COS能够显著降低糖尿病小鼠血糖水平，改善胰岛细胞功能并抑制肠道对葡萄糖的摄取[9]，但作用机制并不完全明晰。鉴于COS的药理作用往往与其聚合度息息相关[10]。因此，本研究旨在探究COS及其组成单体对胰岛素诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用，为COS的降糖、保肝等生物活性应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
HepG2细胞由本实验室保存；COS(成分为壳二糖、壳三糖和壳四糖，占比分别为28.4%、50.07%和21.53%)，扬州日兴生物科技股份有限公司；壳二糖、壳三糖、壳四糖标准品，青岛博智汇力公司；胰岛素、二甲双胍、DMEM培养基及葡萄糖检测试剂盒，Sigma公司；CCK-8试剂盒，日本同仁化学；抗体胰岛素受体(insulin receptor，IR)、胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRS-1)，Abcam公司；磷酸化蛋白激酶B(phosphate protein kinase B，p-PKB/p-Akt)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)，Cell Signaling Technology公司。
1.2 主要仪器
SpectraMaxM2e多功能酶标仪，美国molecular devices公司；T100型PCR分析仪、CFX96TMTouch荧光定量PCR分析仪，美国Bio-Rad公司；Tanon 4800 Multi化学发光图像分析仪，上海天能科技公司。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞活力检测
HepG2细胞在含体积分数10%血清和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2的湿润环境中培养。
HepG2细胞(2×104个/孔)培养于96孔板中至完全贴壁后，更换添加待测药物(干预组)的新鲜培养基继续孵育24 h，不添加药物的培养孔为对照组，无细胞的培养孔为空白组。然后，再次吸去每孔培养基，并用pH 7.5的PBS洗3遍后，加入含有10% CCK-8溶液的等体积无血清培养基，避光孵育2 h后于450 nm波长下测OD值(n=3)。根据公式(1)计算细胞活力。
细胞活力
(1)
1.3.2 HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立
HepG2细胞(2×104个/孔)于96孔板中培养贴壁后，更换不含或含不同浓度胰岛素(0.1 ～ 50 μmol/L)的DMEM培养基，分别设为对照组和模型组，继续培养24、36或48 h，无细胞的培养孔为空白组。漂洗3遍后更换新鲜无血清培养基继续孵育12 h，检测培养基中葡萄糖含量及细胞活力情况(n=3)。葡萄糖消耗量按公式(2)计算。
葡萄糖消耗量/(μmol·L-1)=c(空白)-c(对照/模型)
(2)
1.3.3 COS对葡萄糖消耗量的影响
参照1.3.2建立胰岛素抵抗模型，PBS洗3遍并更换含有不同浓度COS或其组分的DMEM培养基继续培养24 h。低剂量组100 μg/mL，高剂量组200 μg/mL，阳性组二甲双胍2 mmol/L，对照组则给予相同体积的DMEM培养基。之后，更换无血清培养基继续孵育12 h。取培养基上清液对其进行葡萄糖水平检测(n=3)。
1.3.4 RT-PCR分析
通过TRIzol法提取细胞总RNA[11]，1 μg总RNA逆转录为cDNA，反应体系：200 ng cDNA，5 nmol/L上下游引物，5 μL SYBR Green混合物，并在95 ℃、15 s，60 ℃、30 s条件下运行40个循环。通过RT-PCR系统测定靶基因的相对表达水平，并用2-(△△CT)方法进行分析。测定的目标基因为IR、IRS-1、GLUT4、过氧化物酶体增生物激活受体-γ辅激活子-1α(peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α)、叉头转录因子1(fork head transcription factor，Foxo1)、白细胞介素6(interleukin，IL-6)和β-肌动蛋白(β-actin)(表1)。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
基因上游引物序列F(5’-3’)下游引物序列R(5’-3’)IRCATCCGGGGATCACGACTGATCAGGTTGTAGAGGCCGAGTIRS-1CCCAGGACCCGCATTCAAAGGCGGTAGATACCAATCAGGTGLUT4ATCCTTGGACGATTCCTCATTGGCAGGTGAGTGGGAGCAATCTPGC-1αGCTTTCTGGGTGGACTCAAGTGAGGGCAATCCGTCTTCATCCFoxo1TCGTCATAATCTGTCCCTACACACGGCTTCGGCTCTTAGCAAAIL-6ACTCACCTCTTCAGAACGAATTGCCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTGβ-actinCATGTACGTTGCTATCCAGGCCTCCTTAATGTCACGCACGAT
1.3.5 Western Blot分析
细胞重悬于添加了磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的裂解液中，冰上涡旋10 s，静置1 min，反复操作3次。4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清液，获得总蛋白。蛋白定量后，与Loading buffer混匀沸水浴10 min。蛋白通过SDS-PAGE分离后，凝胶迅速转移到聚偏氟乙烯膜上，并进行电转。封闭2 h后，一抗4 ℃孵育过夜。洗涤缓冲液荡洗3遍后二抗室温孵育1～2 h，通过化学发光法对目标蛋白显影，并通过image J软件定量分析。
1.4 统计学分析
数据用平均值±标准差表示，采用单向方差分析法进行分析，通过GraphPad Prism 5软件作图分析。P<0.05为具有显著性差异。与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns为无统计学差异。
2 结果与分析
2.1 HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立
高浓度胰岛素刺激是建立胰岛素抵抗模型的常用方法之一，如图1-a所示，50 μmol/L胰岛素孵育细胞24 h即能够显著降低其葡萄糖消耗量(P<0.05)；在刺激36 h和48 h后，5 μmol/L胰岛素也能够明显抑制HepG2细胞的葡萄糖消耗量(P<0.05)(图1-b，图1-c)。同时，为了评估胰岛素对HepG2细胞的毒性作用，通过CCK-8法检测细胞增殖情况，如图1-d所示，孵育24 h时，胰岛素刺激无细胞毒性(P>0.05)；孵育36 h时，50 μmol/L胰岛素显著引起细胞毒性(P<0.05)(图1-e)；图1-f显示，孵育48 h时，10和50 μmol/L的胰岛素均可以明显引起细胞毒性(P<0.05)。综合考虑，选择5 μmol/L胰岛素对HepG2细胞刺激36 h为诱导胰岛素抵抗的造模条件。
a-胰岛素刺激细胞24 h葡萄糖消耗量；b-胰岛素刺激细胞36 h葡萄糖消耗量；c-胰岛素刺激细胞48 h葡萄糖消耗量； d-胰岛素刺激细胞24 h细胞存活率；e-胰岛素刺激细胞48 h细胞存活率；f-胰岛素刺激细胞36 h细胞存活率
图1 HepG2细胞的胰岛素抵抗模型建立
Fig.1 Establishment of insulin-resistant HepG2 cell model
2.2 COS对HepG2细胞增殖活性影响
为探究COS对HepG2细胞的毒性作用，CCK-8法检测结果显示，与对照组比较，COS在15.625～1 000 μg/mL质量浓度下对HepG2细胞无毒性作用(P>0.05)(图2)。
图2 COS对HepG2细胞毒性分析
Fig.2 Cytotoxicity analysis of COS and chitotriose on HepG2 cells
2.3 COS对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用
如图3所示，高剂量组的COS能够显著促进胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量(P<0.05)。COS能够改善2型糖尿病小鼠空腹血糖水平、口服糖耐量、饮水量和体重等[12]。细胞水平上，COS可以逆转胰岛细胞损伤、提高肝细胞和小肠上皮中糖转运蛋白水平以促进葡萄糖吸收[13]。虽然COS改善葡萄糖代谢的详细机制并未完全清楚，但是以上结果体现了COS确实具有显著的降血糖、促进葡萄糖代谢作用。
图3 COS对胰岛素抵抗HepG2细胞的缓解作用
Fig.3 Alleviative effect of COS on insulin resistant HepG2 cells
2.4 不同COS单体对胰岛素抵抗HepG2细胞的作用
为进一步探讨不同COS单体对HepG2细胞胰岛素抵抗的作用，对壳二糖、壳三糖和壳四糖的作用进行评价。如图4所示，不同浓度下的壳二糖和壳四糖对胰岛素抵抗的HepG2细胞葡萄糖消耗量并无明显的改善效果(P>0.05)，而壳三糖可以明显地提高胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗量(P<0.05)。不同聚合度COS因携带的电荷量、与作用受体亲和力等差异而具有不同的生物活性[14]。本研究中，壳三糖对胰岛素抵抗HepG2细胞的改善作用表现出最优效果，这可能与其相关受体具有更高的亲和力等原因有关。综上，COS组分中的壳三糖对胰岛素抵抗HepG2细胞具有显著的改善效果。
a-壳二糖；b-壳三糖；c-壳四糖
图4 不同COS单体对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用
Fig.4 Improvement of insulin resistance of HepG2 cells by COS with different degree of polymerization
2.5 HepG2细胞胰岛素抵抗相关基因转录水平
正常情况下，胰岛素的主要作用方式为与下游IR结合，结合胰岛素后的IR与下游IRS-1进一步发生酪氨酸磷酸化反应，活化后的IR/IRS-1复合体进一步与Akt结合，促使其磷酸化[15-16]。磷酸化的Akt会进一步使下游靶蛋白磷酸化引起一系列级联反应，最终引起GLUT4移位到细胞膜表面，促进葡萄糖从胞外向胞内转运，从而降低胞外的葡萄糖水平[15-16]。然而，在胰岛素抵抗状态下，IR对胰岛素产生耐受，该通路表达下调，导致葡萄糖转运下降，血糖水平继而升高。为分析COS和壳三糖缓解HepG2细胞胰岛素抵抗的作用机制，首先对IR、IRS-1和GLUT4等基因转录水平进行评估。结果显示，COS(200 μg/mL)和壳三糖(100 μg/mL)孵育后可以显著提高其转录水平(P<0.05)，其改善效果与阳性对照组基本保持一致的趋势(图5-a～图5-c)。Foxo1是胰岛素通路下游的重要转录因子，受Akt磷酸化的调节，过度活化Foxo1可以导致胰岛素敏感性降低[17-19]。另外，PGC-1α与胰岛素抵抗形成密切相关，其可加速肝脏糖异生进程，诱发肝内胰岛素抵抗[19]。因此，为进一步评估COS及其壳三糖对IR/Akt/GLUT4通路下游基因的影响情况，分别探究了Foxo1和PGC-1α基因转录水平的变化情况。如图5-d，图5-e所示，COS和壳三糖可以显著降低Foxo1和PGC-1α基因的转录水平(P<0.05)，COS和壳三糖也逆转了胰岛素抵抗模型中的IL-6基因转录水平(P<0.05)(图5-f)。
a-IR；b-IRS-1；c-GLUT4；d-FOXO1；e-PGC-1α；f-IL-6
图5 HepG2细胞胰岛素抵抗相关基因转录水平变化
Fig.5 Amelioration of insulin resistance related mRNA levels in HepG2 cells
2.6 HepG2细胞胰岛素抵抗Akt/GLUT4蛋白水平变化
如图6所示，模型组细胞中IR、IRS-1、GLUT4及p-Akt水平显著低于对照组(P<0.05)，COS(200 μg/mL)和壳三糖(100 μg/mL)处理后可以显著上调IR、IRS-1、GLUT4和Akt的蛋白水平(P<0.05)。
a-凝胶电泳条带；b-IR；c-IRS-1；d-GLUT4；e-P-AKT
图6 HepG2细胞胰岛素抵抗Akt/GLUT4蛋白水平变化
Fig.6 The protein levels of Akt/GLUT4 in insulin resistance of HepG2 cells
报道显示，COS对多种细胞系均可以显著调控其Akt的磷酸化水平，尤其在2型糖尿病疾病中，能够通过激活Akt蛋白促进胰岛素分泌、提高胰岛素敏感性和胰高血糖素样肽1水平，改善机体血糖水平，降低胆固醇及血清甘油三酯水平等，被认为是一种理想的糖尿病食品[20-21]，与本文结果基本一致。综上，COS和壳三糖通过上调Akt/GLUT4通路改善HepG2细胞的胰岛素抵抗情况，作用机制如图7所示。
图7 COS改善胰岛素抵抗的作用机制
Fig.7 Mechanism of COS ameliorating insulin resistance
3 结论
COS具有广泛的生物活性，其中，降糖作用一直是研究热点，但由于COS组成及聚合度的复杂性，以及评价所用细胞类型和造模方式等差异，其降糖作用机制尚未完全阐明。研究结果表明，COS作用于胰岛素抵抗的HepG2细胞可显著促进葡萄糖代谢作用，其中壳三糖的作用显著高于壳二糖和壳四糖。COS和壳三糖通过上调Akt/GLUT4通路从而改善胰岛素抵抗。
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