枇杷抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性部位的筛选及其酶动力学

魏爱红1,李晓虹2,曾煌1,2,梁淑荷2,林展雯3,庄远杯1,2,张声源1,2*

1(广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室(嘉应学院),广东 梅州, 514015) 2(嘉应学院 医学院客家药用生物资源研究所,广东 梅州,514031) 3(嘉应学院 医学院分子生物学中心实验室,广东 梅州,514031)

摘 要 比较研究枇杷不同药用部位(根、茎、叶、花、果肉、种子)醇提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性,并探究最强活性部位及其总黄酮的酶促反应动力学特征。采用95%乙醇超声提取制备枇杷不同药用部位醇提取物,超声辅助浸提并经AB-8大孔树脂制备总黄酮,利用紫外光谱法测定α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性,通过酶促动力学方法与Lineweaver-Burk曲线推断酶抑制类型。结果表明,枇杷不同药用部位醇提取物均具有一定的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性,α-葡萄糖苷酶抑制活性强弱依次为花>茎>根>叶>果肉>种子,α-淀粉酶抑制活性强弱依次为根>茎>花>叶>果肉>种子。枇杷花醇提取物、枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制活性半抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)值分别为(4.65±0.35)、(0.017 4±0.003 5) g/L,均为可逆非竞争性抑制类型;对α-淀粉酶抑制活性IC50值分别为(14.41±0.59)、(1.57±0.03)g/L,均为可逆非竞争性抑制类型。枇杷根对α-淀粉酶抑制活性最强,IC50值为(1.51±0.24)g/L,为可逆竞争性抑制类型。该研究结果为枇杷作为降血糖食品药品的开发利用提供了科学依据。

关键词 枇杷;α-葡萄糖苷酶;α-淀粉酶;酶促动力学;Lineweaver-Burk曲线

据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation,IDF)第10版数据显示,2021年全球20~79岁的成年糖尿病患者达5.37亿,预计到2030年将增至6.43亿,到2045年将增至7.83亿,中国糖尿病患者居世界首位[1]。持续性高血糖常导致糖尿病心脑血管病变、糖尿病神经病变、糖尿病肾病等并发症,严重危害人体健康[2]

α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶是降低餐后血糖的重要靶点,作用于该靶点的阿卡波糖等临床运用制剂在中国糖尿病药物市场占据主导地位,仅次于胰岛素类[3]。但阿卡波糖对α-淀粉酶的过度抑制是其副作用产生的因素之一[4]。中草药具有多成分、多靶点协调作用的特点,在治疗消渴疾病的运用历史悠久,是现代降血糖先导化合物挖掘的重要来源,从中药材中挖掘更为安全、低毒、有效的天然α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂在降血糖食品药品的开发具有重要的意义。

枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.]为蔷薇科枇杷属常绿小乔木,食用药用历史悠久,枇杷叶已收录于《中国药典》,枇杷花在2019年被批准为新食品原料,而果肉则作为水果食用,表明枇杷资源具有良好的药用食用基础,作为大健康食品药品的开发,具有更高的安全性[5]

枇杷果肉、茎、花、叶、根、种子均可供药用,具有降逆和胃、化痰止咳、止泻功效,主治肺热咳喘、呕吐、烦渴等症状[6],现已有枇杷叶膏、枇杷止咳颗粒等多种制剂应用于临床[7]。现代药理研究显示,枇杷主要含三萜、黄酮、酚类等化学成分,具有镇咳祛痰、降血糖、抗氧化、降血脂、抗菌消炎等药理作用[8-12]。枇杷降血糖药理活性显著,作为降血糖药用资源的开发具有广泛前景。关于枇杷降血糖的研究主要集中于枇杷叶和枇杷花,枇杷不同药物部位(根、茎、种子、叶、果肉、花)对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性差异的研究未见报道。

本文以枇杷果肉、茎、花、叶、根、种子的95%乙醇提取物为研究对象,测定枇杷不同药用部位对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制能力,明确活性部位,并进一步探究活性部位醇提取物及其主要组分总黄酮的酶促反应特征,为枇杷资源在降血糖功能食品药品的开发和高效利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枇杷于2020年7月采自广东省梅州市梅江区,经嘉应学院医学院客家药用生物资源研究所张声源副教授鉴定为蔷薇科(Rosaceae)枇杷属(Eriobotrya)枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.]。对硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)、对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside,pNPG),上海源叶生物科技有限公司;α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、牛血清白蛋白,Sigma有限公司;阿卡波糖,德国拜耳有限公司;可溶性淀粉,天津市大茂化学试剂厂;NaOH,上海麦克林生化科技有限公司;KH2PO4、K2HPO4,阿拉丁有限公司。

1.2 仪器和设备

SPARK酶标仪,TECAN公司;FA2004电子分析天平,德国赛多利斯有限公司;N-1100V旋转蒸发仪,上海爱朗仪器有限公司;MING-CHE 24UV超纯水机,法国Merck Millipore公司;PB-21型 pH计,北京赛多利斯科学仪器有限公司;DHP-9052电热恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 样品的制备

枇杷果肉、茎、花、叶、根、种子,晒干,粉碎,按料液比1∶3(g∶mL)加入95%乙醇超声波提取3次(30 min、35 ℃、100 Hz、200 W),静置24 h,用8层纱布过滤,合并提取液,浓缩得到枇杷根醇提物(提取率10.09%)、枇杷茎醇提物(提取率4.64%)、枇杷叶醇提物(提取率7.34%)、枇杷花醇提物(提取率6.21%)、枇杷果肉醇提物(提取率43.90%)、枇杷种子醇提物(提取率7.93%),保存备用[13]

枇杷花总黄酮的提取及纯化:称取枇杷花粉末200 g,依照1∶20 (g∶mL)的料液比,加入体积分数为60%的乙醇,超声波辅助浸提3次(250 W、60 ℃、40 min),抽滤,合并滤液,4 ℃、4 000 r/min离心5 min,取上清液,浓缩干燥得枇杷花黄酮粗提物32.04 g,提取率16.02%,总黄酮含量以芦丁当量,即1 g干样品中黄酮类化合物相当于芦丁的质量(mg),以rutin mg/g表示,含量为(44.46±1.34) rutin mg/g。准确配制6 g/L的枇杷花黄酮粗提物溶液,加至AB-8大孔树脂层析柱,4 h的静置吸附时间,先用蒸馏水洗去杂质,洗脱到滴出液无色,再用体积分数为50%的乙醇溶液洗脱,洗脱速率为2 BV/h,洗脱体积为3 BV,收集洗脱片段,减压浓缩干燥得精制枇杷花总黄酮,含量为(73.95±1.96) rutin mg/g[14-15]

1.4 α-葡萄糖苷酶的抑制活性

采用微孔板法测定[16],在96孔微孔板上加入110 μL PBS(pH 6.8,67 mmol/L),10 μL样品溶液,20 μL 0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶,振荡混匀,37 ℃恒温孵育15 min,加入20 μL 4.0 mmol/L pNPG,混匀,37 ℃恒温反应15 min,于405 nm测吸光度,平行3次。以阿卡波糖为阳性对照,按照公式(1)计算抑制率。

抑制率

(1)

式中:Ac,PBS代替样品的反应体系吸光度;Ab,PBS代替样品和酶的反应体系吸光度;AS,样品组的反应体系吸光度;Ad,PBS代替酶的反应体系吸光度。

1.5 α-淀粉酶的抑制活性

采用微孔板法测定[17],依次加入样品溶液120 μL,120 μL 10 U/mL α-淀粉酶溶液,振荡混匀,加入120 μL已于37 ℃预温5 min的10 g/L可溶性淀粉溶液,混匀,37 ℃反应15 min,立即加入200 μL DNS显色,沸水浴5 min,冰水冷浴5 min,加入1 040 μL PBS至1 600 μL,于540 nm测定吸光度,平行3次。以阿卡波糖为阳性对照,按照公式(1)计算抑制率。

1.6 对α-葡萄糖苷酶抑制动力学试验

参考文献[18-19],在pNPG浓度为4.0 mmol/L,在3组质量浓度下(枇杷花醇提取物为0、5、10 g/L;枇杷花总黄酮为0、0.026 1、0.052 2 g/mL),分别测定不同α-葡萄糖苷酶活力时的酶促反应初速度,以酶活力(U/mL)为横坐标,反应初速度V0[μmol/(L·min)]为纵坐标作图,判断可逆或不可逆抑制类型。

固定α-葡萄糖苷酶活力为0.1 U/mL,在3组质量浓度下(枇杷花醇提取物为0、5、10 g/L;枇杷花总黄酮为0、0.026 1、0.052 2 g/mL),测定不同pNPG浓度反应体系的反应速率,横坐标为pNPG浓度的倒数(1/[S]),纵坐标为反应初速度的倒数(1/V0)绘制Lineweaver-Burk 曲线,判断其是竞争性抑制、非竞争性抑制抑或反竞争性抑制类型。

1.7 对α-淀粉酶抑制动力学试验

参考文献[20]的方法,在10 g/L可溶性淀粉溶液,在3组质量浓度下(枇杷根为0、1.5、3 g/L;枇杷花总黄酮为0、0.78、1.57 g/L),分别测定不同α-淀粉酶活力反应体系下的反应初速率,以酶活力为横坐标、反应初速率mol/(L·min)为纵坐标作图,判断其可逆或不可逆抑制类型。

固定α-淀粉酶活力10 U/mL,在3组质量浓度下(枇杷根为0、1.5、3 g/L;枇杷花总黄酮为0、0.78、1.57 g/L),测定其在不同淀粉质量浓度(0.312、0.625、1.25、2.5、5、10 g/L)反应体系下的反应初速率,以底物质量浓度的倒数(1/[S])为横坐标、反应初速率的倒数(1/V0)为纵坐标绘制Lineweaver-Burk曲线,判断其是竞争性抑制、非竞争性抑制抑或反竞争性抑制类型。

1.8 统计学处理方法

实验重复3次,通过Origin 8.5软件进行数据处理并作图,结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性

由图1可知,枇杷不同药用部位醇提取物均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,在一定质量浓度范围内,抑制率随质量浓度的增大而增强,呈现一定的量效关系。

图1 样品对α-葡萄糖苷酶的抑制效果
Fig.1 The α-glucosidase inhibition of sample

枇杷不同药用部位和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性强弱依次为:阿卡波糖>枇杷花>枇杷茎>枇杷根>枇杷叶>枇杷果肉>枇杷种子,半抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)值分别为:阿卡波糖(2.46±0.16)g/L,枇杷花(4.65±0.35)g/L,枇杷茎(6.40±0.74)g/L,枇杷根(7.27±0.64)g/L,枇杷叶(15.07±1.04)g/L,枇杷果肉(120.06±2.33)g/L,枇杷种子(179.20±2.95)g/L。枇杷花对α-葡萄糖苷酶的抑制效果与阿卡波糖较为接近,且强于其他药用部位。我国枇杷花资源丰富,食用药用历史悠久,据统计,我国枇杷栽种面积达11万hm2,为全球之最,但在疏花过程导致70%的枇杷花资源的浪费[21]。枇杷花可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂资源应用于降血糖功能食品的开发。

2.2 α-淀粉酶抑制活性

由图2可知,枇杷不同药用部位均具有α-淀粉酶抑制活性,在一定质量浓度范围内,抑制率随质量浓度的增大而增强,呈现一定的量效关系。枇杷不同药用部位和阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制活性强弱依次为:阿卡波糖>枇杷根>枇杷茎>枇杷花>枇杷叶>枇杷果肉>枇杷种子,IC50值分别为:阿卡波糖(0.11±0.06)g/L,枇杷根(1.51±0.24)g/L,枇杷茎(12.26±0.56)g/L,枇杷花(14.41±0.59)g/L,枇杷叶(30.30±1.12)g/L,枇杷果肉(48.81±1.53)g/L,枇杷种子(237.16±2.67)g/L。枇杷根对α-淀粉酶的抑制效果强于其他药用部位。枇杷不同药用部位对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性强弱的次序不同,可能与其不同药用部位的萜类、黄酮类成分含量差异有关,郑美瑜等[22]研究发现枇杷花黄酮含量显著高于叶和种子,曹红云[23]研究发现枇杷根总萜物质含量高于枇杷叶。故实验进一步探究枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶以及枇杷根醇提取物对α-淀粉酶抑制的酶促动力学特征。此外,对α-淀粉酶的过度抑制是导致胃肠胀不良反应主要因素之一,为此我们选取了α-葡萄糖苷酶抑制作用最强而对α-淀粉酶抑制作用较弱的枇杷花为原料,进一步探究枇杷花纯化后的总黄酮对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制作用及其酶动力学特征。

图2 样品对α-淀粉酶的抑制效果
Fig.2 The α-amylase inhibition of sample

2.3 枇杷花醇提取物对酶抑制类型的确定

2.3.1 枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制类型

由图3-a可知,当枇杷花醇提取物质量浓度为0 g/L,即未加抑制剂组,得到的反应速率直线经过原点;当枇杷花醇提取物质量浓度为5、10 g/L时,所得的直线均近似通过原点,且为10 g/L的直线的斜率低于5 g/L的直线的斜率,由此可得枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶为可逆性抑制。由图3-b可知,当枇杷花醇提取物质量浓度为0、5、10 g/L,反应速率相对无抑制剂组明显下降,随着枇杷花醇提取物质量浓度的增大,反应速率越慢,且3条直线近似交于x轴的负半轴于同一点,即Km值不变,为2.60 mmol/L,但Vmax值变小,由此可得枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶为非竞争性抑制类型。该抑制类型与谢子玉[24]对枇杷花中槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷抑制α-葡萄糖苷酶类型不同,由此推测枇杷花95%乙醇提取物中具有其他潜在成分对α-葡萄糖苷酶抑制活性及其结合方式起着重要作用,应进一步探究其潜在的活性成分及其成分间协同降血糖作用效果。

a-可逆、不可逆抑制类型的确定;b-竞争性、非竞争性、 反竞争性和混合型抑制类型的确定
图3 枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制类型的确定
Fig.3 Determination of α-glucosidase inhibitory type of E.japonica flower ethanol extract

2.3.2 枇杷根醇提取物对α-淀粉酶抑制类型

由图4-a可知,当枇杷根质量浓度为0 g/L,即未加抑制剂组,得到一条经过原点的反应速率直线;当枇杷花质量浓度为1.5、3 g/L时,所得的直线均近似通过原点,且3 g/L的直线的斜率低于1.5 g/L的直线的斜率,由此可得枇杷根对α-淀粉酶为可逆性抑制。由图4-b可知,当枇杷根质量浓度为0、1.5、3 g/L的3条线性拟合直线经过y轴的正半轴于同一点,即Vmax值不变,为5.90 mol/(L·min),且随着枇杷根质量浓度的增大,反应速率加快,由此可得枇杷根对α-淀粉酶属于竞争性抑制类型,表明枇杷根95%乙醇提取物与淀粉竞争α-淀粉酶结合位点,从而达到延缓淀粉水解。该抑制类型与阳性对照阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制类型不同[25],是一种潜在的新型α-淀粉酶抑制剂筛选资源。

a-可逆、不可逆抑制类型的确定;b-竞争性、非竞争性、 反竞争性和混合型抑制类型的确定
图4 枇杷根醇提取物对α-淀粉抑制类型的确定
Fig.4 Determination of α-amylase inhibitory type of E.japonica root ethanol extract

2.4 枇杷花总黄酮对酶抑制活性及抑制类型的确定

2.4.1 枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性

由表1可知,枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶均具有良好的抑制活性,对α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值为(0.017 4±0.003 5) g/mL,低于枇杷花醇提取物的(4.65±0.35)g/L;对α-淀粉酶的抑制活性的IC50值为(1.57±0.03)g/L,低于枇杷花醇提取物的(14.41±0.59)g/L,即枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制活性显著强于枇杷花醇提取物,表明经过超声波提取和大孔树脂纯化能有效富集枇杷花中抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性组分。

2.4.2 枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制类型

由图5-a可知,当枇杷花总黄酮质量浓度为0、0.026 1、0.052 2 g/L时,3组反应速率直线近似经过原点,由此可得枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶为可逆性抑制。由图5-b可知,枇杷花总黄酮质量浓度为0、0.026 1、0.052 2 g/L的3组速率直线相交于横轴负半轴的同一点,且Km值不变,为1.825 mmol/L,Vmax值随着质量浓度的增大而减小,可判断为非竞争性抑制类型。结合2.3.1结果可知,枇杷花总黄酮与枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制类型一致,均为可逆非竞争性抑制类型。

表1 枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性
Table 1 The α-glucosidase and α-amylase inhibition of total flavonoids from E.japonica flower

α-葡萄糖苷酶抑制活性α-淀粉酶抑制活性质量浓度/(g·L-1)抑制率/%IC50/(g·L-1)质量浓度/(g·L-1)抑制率/%IC50/(g·L-1)0.086 396.05±3.650.043 178.12±11.950.021 656.24±10.880.010 834.76±5.520.005 415.11±5.330.002 73.01±1.330.017 4±0.003 55.068.37±3.082.554.21±5.141.2543.84±3.720.6233.37±4.110.3124.81±2.310.1518.39±1.651.57±0.03

a-可逆、不可逆抑制类型的确定;b-竞争性、非竞争性、 反竞争性和混合型抑制类型的确定
图5 枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制类型的确定
Fig.5 Determination of α-glucosidase inhibitory type of total flavonoids from E.japonica flower

2.4.3 枇杷花总黄酮对α-淀粉酶抑制类型

由图6-a可知,当枇杷花总黄酮质量浓度为0、0.78、1.57 g/L时,3组反应速率直线近似经过原点,由此可得枇杷花总黄酮对α-淀粉酶为可逆性抑制。由图6-b可知,枇杷花总黄酮质量浓度为0、0.78、1.57 g/L的3组速率直线相交于横轴负半轴的同一点,且Km值不变,为1.536 9 g/L,Vmax值随着质量浓度的增大而减小,可判断为非竞争性抑制类型。

a-可逆、不可逆抑制类型的确定;b-竞争性、非竞争性、 反竞争性和混合型抑制类型的确定
图6 枇杷花总黄酮对α-淀粉酶抑制类型的确定
Fig.6 Determination of α-amylase inhibitory type of total flavonoids from E.japonica flower

3 结论

本文系统比较研究了枇杷根、茎、叶、花、果肉、种子6个药用部位95%乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性并对其最强活性部位的酶促反应动力学进行了分析。结果显示,在枇杷不同药用部位中,枇杷根醇提取物具有最强的α-淀粉酶抑制活性,IC50值为(1.51±0.24)g/L,对α-淀粉酶为可逆竞争性抑制类型,Vmax=5.90 mol/(L·min);枇杷花醇提取物具有最强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,IC50值为(4.65±0.35)g/L,对α-葡萄糖苷酶为可逆非竞争性抑制类型,Km=2.60 mmol/L。枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性IC50分别为(0.017 4±0.003 5)、(1.57±0.03)g/L,强于枇杷花醇提取物,且对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制类型与枇杷花醇提取物一致,均为可逆非竞争性抑制类型。明确了枇杷不同药用部位对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性差异,及其最强活性部位醇提取物和枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的结合方式。研究结果为枇杷作为α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂资源及其降血糖功能食品的开发利用提供了科学依据。

参考文献

[1] International Diabetes Federation.IDF diabetes atlas, 10th ed[EB/OL].2021.http://www.diabetesatlas.org.

[2] 闫科润, 沈玥, 李宁, 等.异荭草素调控糖尿病的作用机制研究进展[J].食品与发酵工业, 2022, 48(22):338-344.

YAN K R, SHEN Y, LI N, et al.Research progress on the mechanism of isoorientin in regulating diabetes mellitus[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(22):338-344.

[3] 李子艳, 王春丽, 高柳滨.全球糖尿病治疗药物研发及市场态势[J].药学进展, 2018, 42(9):710-717.

LI Z Y, WANG C L, GAO L B.Global report on R&D and marketing trend of anti-diabetic drugs[J].Progress in Pharmaceutical Sciences, 2018, 42(9):710-717.

[4] 李波, 包怡红, 高锋, 等.红松松球鳞片多酚对α淀粉酶和α葡萄糖苷酶的抑制作用[J].食品工业科技, 2015, 36(1):63-65;69.

LI B, BAO Y H, GAO F, et al.Inhibitory effect of polyphenols from Korean pine cone lamella on α-amylase and α-glucosidase[J].Science and Technology of Food Industry, 2015, 36(1):63-65;69.

[5] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].第5册.上海:上海科学技术出版社, 1999.

Chinese Herbal Medicine Editorial Boards of State Administrstion of Traditional Chinese Medicine.Chinese Herbal Medicine[M].Volume 5.Shanghai:Shanghai Science and Technology Press, 1999.

[6] 中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志[M].科学出版社, 1990.

Flora of China Editorial Committee of Chinese Academy of Sciences.The Flora of China[M].Beijing:Science Press, 1990.

[7] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:一部[M].2020年版.北京:中国医药科技出版社, 2020.

State Pharamacopoeia Commission.Pharamacopoeia of the People’s Repulic of CHINA:Volume 1 [M].2020 edition.Beijing:China Medical Science and Technology Press, 2020.

[8] 刘丽丽, 刘玉垠, 王杰, 等.枇杷功能成分及生物活性研究进展[J].食品科学, 2020, 41(5):306-314.

LIU L L, LIU Y Y, WANG J, et al.A review of functional components and bioactivities in loquat(Eriobotrya japonica Lindl.)[J].Food Science, 2020, 41(5):306-314.

[9] ZHANG J X, LI Y, CHEN S S, et al.Systems pharmacology dissection of the anti-inflammatory mechanism for the medicinal herb Folium eriobotryae[J].International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(2):2 913-2 941.

[10] DELFANIAN M, KENARI R E, ALI SAHARI M.Evaluation of antioxidant activity of loquat fruit (Eriobotrya japonica Lindl.) skin and the feasibility of their application to improve the oxidative stability of soybean oil[J].Journal of Food Science and Technology, 2016, 53(5):2 244-2 252.

[11] TAN H, SONAM T, SHIMIZU K.The potential of triterpenoids from loquat leaves (Eriobotrya japonica) for prevention and treatment of skin disorder[J].International Journal of Molecular Sciences, 2017, 18(5):E1030.

[12] LU Q Y, ZHANG X M, YANG J P, et al.Triterpenoid-rich loquat leaf extract induces growth inhibition and apoptosis of pancreatic cancer cells through altering key flux ratios of glucose metabolism[J].Metabolomics, 2017, 13(4):1-10.

[13] 林紫兰, 沙小梅, 张志斌, 等.茅莓根提取物的体外抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶抑制能力研究[J].食品与发酵工业, 2021, 47(12):83-89.

LIN Z L, SHA X M, ZHANG Z B, et al.In vitro antioxidant activities and inhibitory activities of α-glucosidase and acetylcholinesterase in Rubus parvifolius L.root extract[J].Food and Fermentation Industries, 2021, 47(12):83-89.

[14] 黄琼, 谢向机.超声波辅助提取枇杷花黄酮类化合物工艺的优化[J].食品工业, 2012, 33(1):8-12.

HUANG Q, XIE X J.Optimization of ultrasound-assisted extraction flavonoids from flower of Eriobotrya japonica[J].The Food Industry, 2012, 33(1):8-12.

[15] 陈晶, 李琪, 黄春萍, 等.枇杷花总黄酮、总三萜的大孔树脂制备工艺[J].食品科学, 2015, 36(18):58-63.

CHEN J, LI Q, HUANG C P, et al.Preparation of flavonoids and triterpenoids from flowers of Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl by macroporous resins[J].Food Science, 2015, 36(18):58-63.

[16] 滕欢欢, 王仁中, 吴德玲, 等.多花黄精炮制前后不同极性部位抗氧化与降血糖活性研究[J].食品与发酵工业, 2022, 48(8):70-75.

TENG H H, WANG R Z, WU D L, et al.The study on the antioxidant and hypoglycemic activities of different polar extracts from crude and steam-processed Polygonatum cyrtonema Hua[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(8):70-75.

[17] 周雯, 韩丽娟, 马娜娜, 等.黄刺浆果不同组分多糖理化性质及生物活性的比较[J].食品与发酵工业, 2022, 48(2):189-197.

ZHOU W, HAN L J, MA N N, et al.Comparative study on the physicochemical properties and biological activities of polysaccharides from different components in the berry of Berberi dasystachya[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(2):189-197.

[18] 孟爱莲, 陈媛媛, 马嫄, 等.苦笋壳提取物不同极性相抗氧化与降血糖活性研究[J].食品与发酵工业, 2022, 48(3):92-98.

MENG A L, CHEN Y Y, MA Y, et al.Antioxidant and hypoglycemic activities of different polar phases of bitter bamboo shoot husk extract[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(3):92-98.

[19] 庄远杯, 凌梅娣, 魏爱红, 等.石韦不同极性萃取物体外降血糖活性研究[J].广西植物, 2022, 42(5):855-859.

ZHUANG Y B, LING M D, WEI A H, et al.Hypoglycemic activities of different solvent extracts from Pyrrosia lingua in vitro[J].Guihaia, 2022, 42(5):855-859.

[20] TAHA M, ALRASHEDY A S, ALMANDIL N B, et al.Synthesis of indole derivatives as diabetics II inhibitors and enzymatic kinetics study of α-glucosidase and α-amylase along with their in-silico study[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2021, 190:301-318.

[21] 王翰华, 阮洪生, 陈云.枇杷花化学成分及其药理作用研究进展[J].中成药, 2019, 41(12):2 977-2 981.

WANG H H, RUAN H S, CHEN Y.Research progress on chemical constituents and pharmacological effects of loquat flowers[J].Chinese Traditional Patent Medicine, 2019, 41(12):2 977-2 981.

[22] 郑美瑜, 陆胜民, 陈剑兵, 等.枇杷花总黄酮的提取工艺优化[J].食品与发酵科技, 2009, 45(4):52-54.

ZHENG M Y, LU S M, CHEN J B, et al.Study on extraction technology of flavonoids in loquat flowers[J].Food and Fermentation Technology, 2009, 45(4):52-54.

[23] 曹红云. 枇杷根、叶主要药效成分含量及活性比较研究[D].福州:福建农林大学, 2012.

CAO H Y.Comparison on the main medicinal components and activities of loquat root and loquat leaf[D].Fuzhou:Fujian Agriculture and Forestry University, 2012.

[24] 谢子玉. 枇杷花多酚保健成分的分离、作用机理探究及多酚纳米颗粒的制备[D].金华:浙江师范大学, 2021.

XIE Z Y.Separation and action mechanism of polyphenols from loquat flowers and its nanopaticles preparation[D].Jinhua:Zhejiang Normal University, 2021.

[25] 袁向华, 周艳玲, 勾洵, 等.阿卡波糖对胰α-淀粉酶的抑制动力学研究[J].世界科技研究与发展, 2016, 38(1):117-121.

YUAN X H, ZHOU Y L, GOU X, et al.Researches on inhibition kinetics of pancreatic α-amylase by acarbose[J].World Sci-Tech R & D, 2016, 38(1):117-121.

Screening of effective fraction from Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl with inhibiting activity against α-glucosidase and α-amylase and its inhibition kinetics

WEI Aihong1, LI Xiaohong2, ZENG Huang1,2, LIANG Shuhe2, LIN Zhanwen3, ZHUANG Yuanbei1,2, ZHANG Shengyuan1,2*

1(Guangdong Provincial Key Laboratory of Conservation and Precision Utilization of Characteristic Agricultural Resources in Mountainous Areas, Jiaying University, Meizhou 514015, China) 2(Institute of Hakka Medicinal Bio-resources, Medical College, Jiaying University, Meizhou 514031, China) 3(Central Laboratory of Molecular Biology, Medical College, Jiaying University, Meizhou 514031, China)

ABSTRACT To compare the inhibitory activities of alcohol extracts from different medicinal parts (roots, stems, leaves, flowers, pulp, seeds) of Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl on α-glucosidase and α-amylase, and to explore the enzymatic activity of the strongest active parts and their total flavonoids Reaction kinetic characteristics. The alcoholic extracts of different medicinal parts of E. japonica were prepared by ultrasonic extraction with 95% ethanol, and the total flavonoids were prepared by ultrasonic-assisted extraction and AB-8 macroporous resin. The inhibitory activities of α-glucosidase and α-amylase were determined by ultraviolet spectroscopy. The type of enzymatic inhibition was inferred by enzymatic kinetics method and Lineweaver-Burk curve. The results showed that the alcohol extracts from different medicinal parts of E. japonica had certain α-glucosidase and α-amylase inhibitory activities, and the order of α-glucosidase inhibitory activity was flower>stem>root>leaf>pulp>seeds, the order of α-amylase inhibitory activity was root>stem>flower>leaf>pulp>seed. The α-glucosidase inhibitory activity IC50 values of E. japonica flower alcohol extract and E. japonica flower total flavonoids were (4.65±0.35) g/L and (0.017 4±0.003 5) μg/mL, all of which were reversible and non-competitive inhibition types; The IC50 values of α-amylase inhibitory activity were (14.41±0.59) g/L and (1.57±0.03) g/L, both of which were reversible and non-competitive inhibition types. The E. japonica root had the strongest inhibitory activity on α-amylase, with IC50 value of (1.51±0.24) g/L, which was a reversible competitive inhibition type. The results of this study provide a scientific basis for the development and utilization of loquat as a hypoglycemic food and drug.

Key words Eriobotrya japonica (Thunb.)Lindl; α-glucosidase;α-amylase; enzyme reaction kinetics; Lineweaver-Burk

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031927

引用格式:魏爱红,李晓虹,曾煌,等.枇杷抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性部位的筛选及其酶动力学[J].食品与发酵工业,2023,49(5):53-59.WEI Aihong, LI Xiaohong, ZENG Huang, et al.Screening of effective fraction from Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl with inhibiting activity against α-glucosidase and α-amylase and its inhibition kinetics[J].Food and Fermentation Industries,2023,49(5):53-59.

第一作者:学士,助理实验师(张声源副教授为通信作者,E-mail:mcdullzhang@yeah.net)

基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(81703662);嘉应学院科研项目(2021KJY06);梅州市医药卫生科研课题 (2021-B-63);梅州市应用型科技专项资金项目(2020B0205004,2021B0201001);广东省大学生创新创业项目(202110582008,202010582269)

收稿日期:2022-04-11,改回日期:2022-05-06