响应面-主成分分析法优化大曲发酵藤茶工艺

藤茶是一种葡萄科植物的枝叶嫩芽，俗称莓茶，主要分布于我国长江流域地区[1]。研究表明，藤茶富含黄酮、多糖、多酚、氨基酸等物质[2]以及多种香气成分。现代药理学研究表明，藤茶具有调节肝脏、促进血液循环等功效，在抗氧化、抗菌[3]等方面具有显著的药理活性[4-5]，是近年来保健产品的新宠[6]。目前市场上用于饮用的藤茶，多为初加工后的藤茶物料，这类饮品“青气”重，汤色浑浊，味道粗涩[7]，研究者们试图通过改变发酵工艺，改善藤茶品质。潘利华等[8]通过改变新老叶茎比例来改善藤茶苦味重及回甘不明显的问题。陈加勇等[9]将红茶和绿茶与藤茶进行配比，改善了藤茶的风味。李翠朵[10]通过黑曲霉发酵藤茶，使其提取物中黄酮和多酚的含量增加。综上，为进一步改善藤茶饮用的口感、增加风味，提高发酵藤茶中的黄酮、总酚、氨基酸等有益物质，本研究选取浓香型大曲对藤茶进行发酵。大曲作为中国高品质酒类常见的糖化发酵剂[11]，其代谢产物可生成风味物质及其前体，且在发酵过程中生成多种酸、醇类物质，对发酵产物口感的形成起着重要作用[12]。但是少有人将大曲应用于藤茶的发酵研究中，故探究大曲菌种在藤茶发酵中的应用很有必要，可为藤茶发酵后风味的改善提供参考。本试验通过响应面-主成分分析法确定最佳发酵工艺的条件，以期为人们提供健康茶品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藤茶(产地：湖北恩施地区)，黄鹤楼香精香料有限公司；中高温大曲，黄鹤楼酒业有限公司。

55 mm 0.22 μ混合纤维素脂(水系)微孔滤膜，上海兴亚净化材料厂；80目筛、UPT-Ⅱ-20T超纯水制备设备，成都超纯科技有限公司；DK-S22型恒温水浴箱、DUG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；CP213型电子天平，国象斯仪器上海有限公司；STARTER3100型pH计，OHAUS；100 μL、200 μL、1 000 μL移液枪，迈德飞；752N型紫外分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；超声波清洗器，上海生析超声仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 藤茶发酵工艺流程

藤茶→盐渍→醋蒸→放凉→揉捻→变温发酵→中温烘焙

原料：黄鹤楼香精香料有限公司提供的来自于湖北恩施地区的优质藤茶。盐渍：将藤茶放入质量浓度为2.0 g/L的盐水中[13]，浸泡10 min。醋蒸：向蒸锅中加入6 mL/L的陈醋，沸腾后将藤茶均匀分散于隔板上，持续加热到大部分藤茶变为茶绿色时停止加热，不开盖闷至全部藤茶变色后放凉。揉捻：将放凉的藤茶放入捻茶机揉捻至茶条柔软并保持其完整形态。变温发酵：按照一定质量比例向藤茶中加入特制大曲及蔗糖，用适量水调配蔗糖溶液，使大曲活化，过滤后均匀混合于藤茶中，在合适的温度和湿度下发酵36 h，为使系统中的大多数酶发挥作用，再将温度调至60 ℃发酵12 h。中温烘焙：将藤茶均匀铺在烘箱中烘焙，待藤茶含水量为10%左右，散发清香揉搓可碎裂时，即烘焙完成。待藤茶回潮后密封保存。

根据预试验发现在该工艺操作中，烘焙温度对藤茶品质的影响不可忽略，最终确定单因素试验基本条件为：发酵湿度50%(以10%为梯度)，大曲接种量为3%(以1%为梯度)，初始糖度(质量分数)为5%(以1%为梯度)，烘焙温度80 ℃(以5 ℃为梯度)，发酵温度35 ℃(以5 ℃为梯度)；测定并记录藤茶中总黄酮、总酚、还原糖、氨基酸、pH值及感官评价。经客观权重赋权法(criteria importance though intercrieria correlation,CRITIC)对衡量各单因素的指标进行客观赋权确定最优解，由响应面软件的中心组合原理设计试验，其中自变量为A(发酵温度)、B(大曲接种量)、C(初始糖度)、D(发酵湿度)、E(烘焙温度)，响应面的响应值为规范化综合得分，根据理论最佳工艺确定实际最佳发酵参数。

1.3 品质评价的测定方法

1.3.1 总黄酮的测定

根据芦丁浓度的变化绘制标准曲线，取过筛烘至恒重的藤茶粉1.000 g，参照亚硝酸钠-硝酸铝法[14]，利用超声波清洗仪超声辅助提取后进行测定。

1.3.2 总酚的测定

根据没食子酸浓度的变化绘制标准曲线，按照Folin-Ciocalteu法[15]测定。

1.3.3 氨基酸的测定

参考GB/T 8314—2013《茶游离氨基酸总量的测定》。

1.3.4 还原糖的测定

按照二硝基水杨酸法[16]进行测定。

利用pH计[17]进行测定。

1.3.6 藤茶感官评价

向湖北圣水茶厂有限责任公司送样，参考GB/T 23776—2018《茶叶感官评审方法》进行评价。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

根据电子增强出版附图1～附图5(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033290)的数据可知，以发酵参数为变量的指标测定结果与参考文献研究结果相近。王岚等[18]测定藤茶多酚含量为23.64 mg/g，李佳川等[19]发现藤茶中黄酮含量达40%，郭桂义等[17]测定一般优质茶叶的pH在6.2以上。

根据DIAKOULAKI等[20]提出的CRITIC法进行单因素结果分析。

式中：zij,无量纲处理后的样本指标值；ci,综合权重；m,指标个数；ωi,权重；zi,第i个指标的样本均值；si,对比强度；n,样本个数；dj,样本综合评价值；rij,指标i和j之间的相关系数；δi,冲突性。

根据表1和表2确定单因素最佳条件为发酵温度37.5 ℃、大曲接种量3%、初始糖度5%、发酵湿度40%、烘焙温度85 ℃。

2.2 响应面试验结果及分析

2.2.1 响应面试验结果

按照表3设计的变量因素水平完成Box-Behnken(Design-Expert 8.0.6)，共46个试验点，根据自动生成的随机顺序进行试验，探究5个变量对发酵藤茶中氨基酸、还原糖、黄酮、总酚、pH和感官评价的影响(表4)。

2.2.2 响应面试验结果及分析

2.2.2.1 发酵藤茶主成分分析

对预先设定的6个评分指标，即感官评价、总酚、还原糖、pH、氨基酸和黄酮在SPSS 25中进行主成分分析，结果见表5。为满足累计贡献率>80%的原则[21]，提取前3个主成分，此时累计贡献率达到81.999%，这3个主成分足以表征发酵藤茶的品质信息。

由表6可知，根据特征向量值的绝对值大小分析，感官品质评价、黄酮含量对第1主成分的影响相对较大，pH值、总酚含量对第2主成分的影响相对较大，还原糖含量、黄酮含量对第3主成分的影响较大。

为使响应面结果更加规范，需要将综合得分Y进行规范化处理，按公式(6)计算，以解决6个指标之间存在的量级和单位上的差异。规范化综合得分Z参考公式(7)，见表7。

式中：C,主成分的累积特征值；Fi,发酵藤茶各指标的规范化得分；Yi,主成分特征值；Ymin,Y的最小值；Ymax,Y的最大值。

2.2.2.2 规范化综合得分的响应面分析

对6个因素及其对应的规范化综合得分进行响应面模拟，多元回归拟合模型方程如下。

Z=0.89+0.26A-0.050B+0.066C-0.014D+9.356E-003E+0.022AB-0.073AC+0.20AD-0.046AE+0.037BC+0.079BD-0.076BE+0.015CD-0.011CE-0.016DE-0.29A2-0.16B2-0.12C2-0.033D2-0.23E2

由表8可知，失拟项(P>0.05)不显著，修正相关系数

模型项(P<0.000 1)显著性极高，信噪较大(Adeq Precision=24.544)，决定系数R2=0.966 1，即建模成功且理论值和试验值相关性较好，可用该模型来分析试验。各因素中，一次项A、B、C的P<0.01，即发酵温度、大曲接种量、初始糖度均对所选指标的影响极大，同理D、E(P>0.05)不显著；交互项AD、BD的P<0.01说明发酵温度与发酵湿度、大曲接种量与发酵湿度的叠加作用对所选指标影响极大，交互项AC、BE的P<0.05说明发酵温度与初始糖度、大曲接种量与烘焙温度的叠加作用对所选指标影响较大，同理其他交互项不显著；二次项A2、B2、C2、E2对指标的影响极大(P<0.01)，同理D2该因素对指标影响不大(P>0.05)。比较因素的F值大小可知，影响藤茶发酵品质的因素关系为：A(发酵温度)>C(初始糖度)>B(大曲接种量)>E(烘焙温度)>D(发酵湿度)。

根据响应面分析软件得出的理论工艺参数及指标为：发酵温度39.57 ℃，初始糖度5.17%，大曲接种量3.21%，烘焙温度79.32 ℃，发酵湿度50%，黄酮含量423.363 mg/g，总酚含量28.408 9 mg/g，氨基酸含量20.100 9 mg/g，还原糖含量111.303 mg/g，pH值为6.356 44，感官评价为85.905 5，规范化综合得分1.024 2。经实际验证得，该条件下发酵藤茶中黄酮含量为435.303 mg/g，总酚含量27.68 mg/g，氨基酸含量21.092 5 mg/g，还原糖含量110.875 mg/g，pH 6.32，感官评分90.50，与软件预测的理论值基本一致，因此该模型的可以用于一定规模下的藤茶发酵。

3 结论

以常见酒类发酵剂浓香型大曲为菌种，湖北恩施的藤茶为原料，通过响应面主成分分析的方法优化发酵藤茶的工艺参数。为使经过验证实验的工艺参数可以应用于工业化生产，将参数调整为：发酵温度39.6 ℃，大曲接种量3.2%，初始糖度5.2%，发酵湿度50%，烘焙温度80 ℃。通过发酵参数的优化，增加了藤茶的风味物质，有效地保留藤茶中的活性成分，改善藤茶原本苦涩、回甘不明显的弊端。优化后的藤茶，茶叶匀整净度好，茶汤嫩黄明亮且伴有清香，回甘速度快且滋味甘鲜，叶底软嫩、灰绿明亮。高于优质茶叶的感官评判标准。

利用大曲菌种对藤茶进行发酵的研究鲜有报道，该研究为改善藤茶饮品的风味、为藤茶的开发和利用提供参考。同时本文将CRITIC法与单因素分析结合起来，为单因素分析提供了更加规范的分析方法。

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