唾液酸(sialic acid, SA)是指一类含9个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物(图1)。由于在大部分哺乳动物组织中N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac)是SA的主要存在形式，因此通常将SA称为Neu5Ac[1-3]。研究表明SA具有抗炎、抗病毒、抗菌和抗肿瘤等生物学作用[4]，也有研究表明SA是一种脑部营养素，能促进婴幼儿大脑发育、增强学习和发育能力[5]。母乳是婴儿营养的主要来源，其中含量丰富的SA和幼儿早期的神经系统发育、抵抗力密切相关。目前，多以牛乳和羊乳为基础的婴幼儿奶粉来作为母乳的替代品，然而有研究表明牛乳和羊乳中含有的SA远远不如母乳[6-7]，所以国内外市场已将奶粉中SA的含量作为接近母乳的一个重要参数，通过在奶粉或者牛奶中添加SA，使其更接近母乳SA含量，有利于促进婴儿早期的认知发育。因此，定量奶制品尤其是婴幼儿奶粉中SA的含量可以为乳制品的生产质量把控和质量鉴定提供技术支持。
图1 唾液酸的基本结构
Fig.1 Basic structure of sialic acid*表示主要形式
目前，测定SA含量的方法主要有分光光度法[8-11]、高效液相色谱法[12-14]、气相色谱法[15]、核磁法[16]、酶联免疫分析[17]和液相色谱-质谱联用法[18-20]及其他方法[21]。其中分光光度法、色谱法和核磁法的灵敏度不高、定量准确性不高。酶联免疫法灵敏度高，但其成本较高，操作方法较为复杂，线性范围较窄。而液相色谱串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)因质谱灵敏度较高，且具有分离鉴定同时进行的优点，无需衍生就可以对复杂样品中的SA进行定性定量。目前，已有研究者采用LC-MS/MS法测定乳制品中SA的含量[18-20]，但这些研究均采用外标定量法，其定量准确性受基质效应限制。稳定同位素内标定量法因同位素标记的化合物在理化性质上与待测化合物有很大的相似性，可以有效地消除基质干扰效应。目前该方法作为LC-MS/MS定量的金标准方法被广泛地应用于环境、食品、临床、检测等分析领域。然而，采用基于稳定同位素内标的LC-MS/MS法定量乳制品中的SA的研究尚未报道。因此，在本研究中使用稳定同位素标记的化合物13C123-SA作为同位素内标，开发了一种基于稳定同位素内标的LC-MS/MS法，用于准确定量乳制品中的SA的含量。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
Ultivo高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪，MassHunterC1.1数据处理软件，美国Agilent公司；电子分析天平，赛多利斯科学仪器；超声波水浴，宁波新芝生物科技股份有限公司；恒温混匀仪，上海净信实业发展有限公司；移液枪、漩涡振荡器、台式离心机，美国Thermo公司；Millipore超纯水净化器，美国MILLIPORE公司。
1.2 样品与试剂
婴幼儿奶粉、奶酪、酸奶、鲜牛奶、脱脂高钙奶粉、全脂高钙奶粉，市售；乙酸铵(LC-MS级，99%)，北京百灵威科技有限公司；乙酸(LC-MS级，99.5%)，东京化成工业株氏会社；甲酸(LC-MS级)、乙腈(LC-MS级，99%)，赛默飞公司；唾液酸标准品(99%)，Adamas-beta公司；[1,2,3-13C3]-N-乙酰基-D-神经氨酸,上海甄准生物科技有限公司；试验用水均为超纯水。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液的配制
精确称取SA标准品14 mg，用超纯水溶液配制成1 mg/mL的标准储备液，于-20 ℃下储存备用。
将5 mg的SA同位素标准品用超纯水溶液配制成1 mg/mL的内标标准储备液，于-20 ℃下储存备用。
混合内标标准工作液的制备：准确移取一定量的标准储备液和内标标准储备液用体积分数0.05%甲酸水溶液逐级稀释成质量浓度5、2.5、0.5、0.25、0.05、0.025、0.012 5 μg/mL的唾液酸标准工作液，其中内标浓度均为0.25 μg/mL，于4 ℃下储存备用。
1.3.2 样品前处理
取供试品样品，精密称取20 mg(精确至0.000 1 g)于离心管中，加入1 mL体积分数50%的乙酸(pH 2)溶液，混匀振荡，水浴超声5 min，使其充分溶解。在恒温混匀仪中80 ℃反应2 h，水解后冷却至室温，15 000 r/min下离心10 min(×2)。离心后取上清液稀释1 000倍，其中加入同位素内标工作液使其浓度和标准工作液内标一致为0.25 μg/mL。接着用10 kDa的超滤管14 000×g离心10 min，过0.22 μm的有机滤膜，上机待测。
1.3.3 色谱条件
色谱柱：ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱温40 ℃；流速为0.3 mL/min，进样量1 μL；以含体积分数0.05%甲酸水溶液为流动相A，以含体积分数0.05%甲酸的乙腈为流动相B，按照体积比进行梯度洗脱:0.0～1.0 min，3% B；1.0～2.5 min，3%～80% B；2.5～4.0 min，80% B；4.0～8.0 min，80%～90% B；8.0～10.0 min，90%～3% B。
1.3.4 MS条件
电喷雾模式(electronic spray ionization, ESI)：负离子模式(ESI-)；质谱扫描方式：多重反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)；毛细管电压3 000 V，喷嘴电压500 V；鞘气流量11.0 L/min；鞘气温度325 ℃；雾化器压力30 psi；干燥器温度250 ℃；干燥器流量7 L/min；MRM参数见表1。
表1 唾液酸及其内标在MRM模式下的主要质谱参数
Table 1 Main mass spectrum parameters of sialic acid and its internal standard in MRM mode
化合物母离子 (m/z)子离子 (m/z)裂解电压/V碰撞能量/VSA308.187*,1707417iSA311.290*,1736917
注：*为定量离子
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的选择和优化
由于唾液酸1号碳上的羧基使得唾液酸分子带负电荷，推测ESI-较ESI+模式更利于SA检测，因此本研究尝试了用ESI-和ESI+2种模式对0.5 μg/mL的唾液酸标准液和内标标准液进行母离子全扫描，结果表明较ESI+模式，ESI-模式下母离子丰度更高，且背景干扰峰较少，因此本实验选择ESI-模式检测。在ESI-模式下，对所选定的母离子进行子离子扫描，最终选择含量较高的子离子m/z 87和子离子m/z 90为定量离子，子离子m/z 170和子离子m/z 173为定性离子，最后在ESI-模式下优化电压，碰撞能量等质谱参数，最大程度地提高了检测的灵敏度。优化后的MRM质谱参数见表1，唾液酸标准液和内标标准液的子离子质谱图见图2。
a-SA;b-iSA
图2 SA和iSA的子离子扫描图
Fig.2 Product ion scan diagrams of SA figure and iSA figure
在使用LC-MS/MS法检测样品中唾液酸时，唾液酸的响应会受到样品基质的影响，导致响应信号被抑制，因此使用外标法定量不准确。基于此，选择了[1,2,3-13C3]-N-乙酰基-D-神经氨酸作为内标，在预处理之前加入待测样品中，由于[1,2,3-13C3]-N-乙酰基-D-神经氨酸具有与SA相同的化学结构和性质，并且它们具有相同的稳定性、色谱保留、质谱响应和断裂模式，因此它们的特异性和灵敏检测可以通过质谱在MRM模式下基于它们的m/z值的差异来获得(图3)，因此可以校正由基质响应所带来的干扰，实现了高灵敏度和精确定量。结果表明，选用稳定同位素内标既降低了基质效应又能校正样品前处理过程的误差。
a-SA的色谱图；b-iSA的质谱图
图3 SA和iSA的MRM色谱图和质谱图
Fig.3 MRM chromatograms and mass spectra of SA figure and iSA figure
2.2 色谱条件的选择和优化
2.2.1 色谱柱的选择
通常选择C18色谱柱分离样品，鉴于唾液酸的高亲水性，本研究比较了Poroshell 120 HILIC Column (150 mm×2.1 mm,2.7 μm)和Eclipse Plus C18 Column (50 mm×2.1 mm,1.8 μm)这2种色谱柱。结果表明选用HILIC色谱柱分离效果欠佳，峰形有明显拖尾。而C18色谱柱分离效果较好，峰形较好，无严重的拖尾现象。故本实验最终选择C18色谱柱来进行分离(图4)。
a-HILIC；b-C18
图4 HILIC (150 mm) column、C18 (150 mm) column的MRM色谱图
Fig.4 MRM chromatogram of HILIC (150 mm) column figure and C18 (150 mm) column figure
2.2.2 流动相条件的优化
由于唾液酸的极性较大，通常使用乙腈和水作流动相，在流动相中有无添加剂也会影响峰的强度和峰形，因此研究了在水中加入乙酸铵和甲酸对峰的影响。使用C18色谱柱在负离子模式下对5 mmol/L的乙酸铵水溶液/乙腈、体积分数0.05%甲酸的水溶液/0.05%甲酸的乙腈溶液2种流动相进行筛选，并筛选最优梯度洗脱。结果表明流动相含有甲酸时，SA响应较好，峰形较好(图5-b)。为缩短检测时间以更好地满足快速检测的要求，最终选择了50 mm的同类型C18色谱柱用于后续样品的测定(图5-c)，最优洗脱梯度为0.0～1.0 min，3%B；1.0～2.5 min，3%～80%B；2.5～4.0 min，80%B；4.0～8.0 min，80%～90%B。
a-5 mmol/L乙酸铵水溶液；b-0.05%甲酸水溶液(150 mm)；c-0.05%甲酸水溶液(50 mm)
图5 5 mmol/L乙酸铵水溶液、0.05%甲酸水溶液(150 mm)和0.05%甲酸水溶液(50 mm)的流动相的优化
Fig.5 Optimization of mobile phase of 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution figure and 0.05% formic acid aqueous solution figure
2.3 样品前处理的优化
乳制品中除了游离的SA，更多的是与蛋白质结合的SA，乳制品成分复杂，含有大量乳糖、半乳糖、低聚糖等碳水化合物复杂基质，这使得奶粉中唾液酸的检测极具挑战性[23]，故需要对样品进行水解以释放唾液酸。唾液酸的水解有2种：酶水解、酸水解。由于酶水解需要温和的条件，水解不完全。本研究采用酸水解法，目前已报道硫酸、磷酸、三氟乙酸、盐酸等酸解条件[3,22-23]，但硫酸、磷酸等无机酸与质谱不兼容。考虑到与质谱的兼容性，本研究考察了乙酸和甲酸，结果表明相较甲酸，乙酸的水解效果更好，能较好地将唾液酸游离出来，故本研究选择50%的乙酸(pH 2)作为水解酸。
由于奶粉样品中含有许多蛋白质、脂质等大分子，这就需要对所得到的唾液酸粗品进行预分离纯化。样品经0.22 μm的有机滤膜过滤后，选择用超滤法(10 kDa超滤膜)进行分离纯化，以除去样品中杂质和大分子。用超滤法预分离纯化样品，不仅操作简单，唾液酸的损失较小。
2.4 方法学验证
2.4.1 标准曲线、检出限与定量限
SA标准品系列浓度为0.0125、0.025、0.05、0.25、0.5、2.5、5 μg/mL，同位素内标质量浓度为0.25 μg/mL。以SA标准品的浓度(X)为横坐标，对应的SA标准品与同位素内标峰面积的比值(Y)为纵坐标绘制标准曲线。结果显示在0.0125～5 μg/mL线性良好，相关系数(R2)为0.999 9。以信噪比S/N(signal to noise ratio)≥10计算方法的定量下限为1.6 ng/mL, S/N≥3计算方法的检出限为0.4 ng/mL。该方法的灵敏度足以满足乳制品中SA的检测要求。
2.4.2 加标回收率与相对标准偏差
精密称取已知唾液酸含量的样品20 mg，按照先前建立的方法处理后进行测定。依次在原含量样品的基础上分别添加0.025、0.25、2.5 μg/mL的唾液酸标准品溶液，在优化实验条件下，每个加标水平平行进样6次，计算加标回收率，结果如表2。该方法的平均回收率(n=6)为76%～96%。相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)分别为0.6%～6.35%，有较高的回收率。
表2 乳制品中唾液酸的加标回收实验
Table 2 Labeled recovery experiment of sialic acid in the dairy products
样品添加量/(μg·mL-1)回收率/%相对标准偏差/%婴幼儿奶粉0.025966.350.25961.922.5962.85全脂高钙奶粉0.025882.700.25831.712.5911.91脱脂高钙奶粉0.025873.340.25901.692.5912.00酸奶0.025933.400.25850.602.5780.70鲜牛奶0.025981.900.25881.402.5760.60奶酪0.025832.100.25780.702.5900.70
2.4.3 精密度、重复性、稳定性
取200 μL含有内标的唾液酸标准液(质量浓度0.5 μg/mL)，重复进样6次，RSD为2.71%，精密度良好。同一样品和标品检测数据的日间和夜间平行性很好(RSD≤4.30%)，表明唾液酸标准品在24 h内稳定(表3)。
表3 唾液酸标准品稳定性
Table 3 Stability of sialic acid standard
时间/h面积RSD/%015 881.48217 430.07416 524.48617 618.61817 909.132417 824.594.30
2.5 样品测定
应用本实验所建立的方法对超市中售卖的婴幼儿奶粉、高钙奶粉及其他奶制品进行SA定量检测，测定结果如表4所示。
表4 样品中SA的含量
Table 4 Content of SA in the samples
样品含量/[μg·(100 mg)-1]RSD/%酸奶0.561.84鲜牛奶0.572.22奶酪0.530.43婴幼儿奶粉9.903.40全脂高钙奶粉7.263.40脱脂高钙奶粉12.821.29
3 结论
本文建立了基于稳定同位素内标高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量乳制品中SA含量的方法，该方法重现性和精密度良好，试剂用量少，操作简单，无需衍生，避免了复杂的样品前处理过程。并且由于稳定同位素内标的引入极大地降低了复杂样品中基质的干扰，因此，该方法可准确地测定婴幼儿配方奶粉及其他奶制品中SA的含量，为乳制品的生产质量把控和质量鉴定提供有力和有效的手段。
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