基于宏基因组测序技术解析市售强化酒曲微生物群落结构和功能特征

白酒是我国传统的酒精饮料,其历史悠久,酿造工艺复杂。中国白酒独特的生产工艺凝聚着我国古代劳动人民发明的、被誉为中国“第五大发明”的微生物制曲技术。作为一个“多菌多酶”的微生物制品,酒曲为白酒酿造提供了丰富的微生物及各种功能酶等代谢产物。其“菌、酶、风味”三系的种类与丰度是影响最终产品品质的关键因素之一[1]。由于各种酶类及大部分风味物质的产生均与酒曲中的微生物及其代谢活动有关,因此酒曲微生物群落结构及其功能的研究一直是中国白酒行业的热点。

酒曲根据生产原料、制作工艺等差异可以分为大曲、小曲、麦曲、红曲和麸曲等类型。这些传统酒曲的制作往往在开放环境下自然发酵而成,受发酵原料、制作环境等外界条件的影响,酒曲品质往往会存在较大的波动。已有的研究结果显示,即使是同一企业、同一批次、使用相同原料和工艺生产制作的酒曲,不同曲块间微生物群落结构组成及发酵特性亦会存在非常大的差异[2-3]。酒曲品质的这种不确定性和差异为后续白酒生产的质量标准化和品质控制带来了非常大的挑战。面对上述情况,越来越多的企业开始探索在酒曲制作的过程中额外添加发酵特性优良的功能菌株,从而制作得到品质更为可控、发酵性能更为突出的强化酒曲。但是目前还少有学者以不同类型强化酒曲产品为研究对象揭示这些产品在菌群群落结构和功能方面的差异。

在酒曲微生物研究技术方面,传统的分离培养技术目前仍在广泛使用。通过使用不同的选择性培养基可以实现对样品中目标微生物的分离和鉴定,从而确定酒曲中可培养微生物的主要类群,同时也为后续筛选优良发酵菌株奠定一定的基础。除此之外,也有一些学者采用非培养的分子生物学方法如变性梯度凝胶电泳技术、实时荧光定量PCR技术等用于酒曲微生物的检测。然而这类方法存在一定的缺陷,例如变性梯度凝胶电泳技术难以检测到样品中低丰度的微生物,而实时荧光定量PCR技术只能对少数目标物种进行定量分析,这阻碍了对样品中微生物群落结构的全面了解[4]。因此,目前对酒曲微生物研究最常见的方法是基于目的片段扩增的高通量测序技术。例如,陈申习等[5]以清香型和酱香型白酒酒曲为研究对象,采用Illumina MiSeq测序技术对不同类型酒曲中真菌ITS区进行测序,分析了不同酒曲中真菌群落结构组成。结果显示清香型白酒酒曲中含有较高比例的红曲霉属(Monascus)和根毛霉属(Rhizomucor),而热子囊菌属(Thermoascus)同时在酱香型酒曲和清香型酒曲中含量较高。ZHAO等[6]采用相同技术对黄酒曲中的细菌多样性展开了研究,结果显示黄酒曲细菌菌群主要由魏斯氏菌属(Weissella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)等组成,并且不同地区的样本之间细菌群落结构存在显著的差异。值得注意的是,受测序片段读长的限制,采用该方法的相关研究仅能在属水平挖掘样品中微生物的群落结构组成,无法充分揭示酒曲微生物在种水平和功能方面的特征。近年来,微生物宏基因组学测序技术和数据分析手段得到了长足的发展,该技术通过对样品中全部微生物基因组DNA进行提取和测序,避免了扩增子测序技术在扩增过程中引入的误差,同时可以在微生物种水平和功能方面提供更为详细的信息。该方法为酒曲中微生物群落结构和功能研究提供了强有力的技术支撑。

本研究以市售增香酒曲和白酒曲两种不同类型的强化型酒曲产品为研究对象,分别采用培养技术和宏基因组测序技术对产品中的可培养微生物及菌群群落结构和功能进行了解析。本研究结果一方面增加了人们对市售不同类型强化型酒曲产品微生物群落结构和功能的认识,同时也验证了宏基因组测序技术在酒曲产品微生物解析中的应用潜力。研究结果对于促进企业进一步提升酒曲品质亦具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从湖北襄阳市场购买了某品牌增香酒曲和白酒曲两款强化型酒曲产品各3份,酒曲采集后分别将3份同类型的强化酒曲充分磨碎、混匀为一个样品后暂存于-20 ℃冰箱直至开展后续实验。

PCA、PDA和LB培养基,青岛海博生物技术有限公司;10×Buffer、脱氧核糖核苷三磷酸Mix和DNA聚合酶,北京全式金生物技术有限公司;微生物基因组提取试剂盒,德国QIAGEN公司;引物27F/1495R和ITS1/ITS4,武汉天一辉远生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Fluor Chem FC3化学发光凝胶成像系统,美国Protein Simple公司;ND-2000C微量紫外分光光度计,美国Thermo公司;琼脂糖凝胶电泳系统,北京六一公司;SW-CJ-2FD超净工作台,江苏苏净公司;Veriti FAST梯度PCR仪,美国ABI公司;Illumina Xten高通量测序平台,美国Illumina公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酒曲中细菌的分离纯化

分别称取10 g强化酒曲于250 mL三角锥形瓶中,随后加入90 mL 0.85%无菌生理盐水和适量玻璃珠,在25 ℃、180 r/min摇床上振荡5 min,使酒曲充分溶解。以十倍稀释法获取10-1～10-6浓度梯度的酒曲菌悬液,取50～100 μL稀释梯度为10-4、10-5、10-6的稀释液涂布于PCA固体平板上,于37 ℃恒温培养36～48 h后。观察平板中各菌落的形态,根据颜色、形态、大小的不同挑取单菌落进行划线纯化,纯化3代后挑取适量的菌体进行涂片及革兰氏染色[初染:结晶紫1 min;媒染:碘液1 min;脱色:95%(体积分数)乙醇15～20 s;复染:番红2 min],最后使用30%(体积分数)甘油进行冻存备用。

1.3.2 酒曲中真菌的分离纯化

取1.3.1中稀释梯度为10-4、10-5和10-6的稀释液涂布于PDA固体平板上,于28 ℃恒温培养48～72 h观察其菌落形态,按照1.3.1中要求挑取单菌落,纯化、镜检并冻存。

1.3.3 微生物基因组DNA的提取及目的片段的PCR扩增

分别采用CTAB法和消解酶-氯化苄法提取细菌和真菌菌株基因组DNA。其中细菌菌株基因组DNA使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1495R(5′-CTACGGCTACCTTCTTACGA-3′)对基因组DNA中的目的片段进行PCR扩增,具体流程参照刘逸群等[7]和赵慧君等[8]的方法。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性60 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,循环30次;72 ℃末端延伸10 min。真菌菌株使用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对目的片段进行扩增。PCR反应程序为94 ℃预变性4 min;94 ℃变性45 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

1.3.4 PCR产物的克隆和测序

将合格的PCR产物进行纯化,连接到T-载体并转入大肠杆菌感受态细胞中,吸取100 μL经过转化处理的大肠杆菌菌液涂布于含有氨苄青霉素钠的LB琼脂糖平板上过夜培养,随后挑取阳性克隆子送至测序公司进行测序。

1.3.5 分离株分类学地位的确定和系统发育树的构建

将测序公司返回的有效序列在NCBI数据库中进行BLAST比对。若测定的序列与模式菌株同源性>99%,则可鉴定此菌株与模式菌株为同一菌株,随后将模式菌株序列与测定的序列对齐之后使用邻接法计算序列之间的进化距离。最后使用MEGA7.0软件构建系统发育树。

1.3.6 宏基因组测序和测序质量控制

样品宏基因组DNA在完成文库的构建后进行宏基因组测序。具体而言,首先通过超声将宏基因组DNA片段化为350 bp左右的短片段,然后将DNA片段末端补齐,随后添加A-tailed,并与全长接头连接后使用Illumina Xten测序仪完成宏基因组测序。宏基因组DNA测定完成后使用fastp软件(v0.23.2)对原始序列进行质量控制,具体的质控参数为-q 20 -u 30 -n 5 -y -Y 30 -l 90 -w 12。随后,将质控合格的序列分别与植物和人类基因组进行比对,以去除植物和实验过程中可能引入的潜在污染序列,从而得到可用于后续分析的有效序列。

1.3.7 微生物群落结构和功能分析

使用kraken2(v2.1.1)软件[9]和Bracken(v2.5)软件[10]解析宏基因组数据中蕴含的菌群群落结构信息。与先进行序列组装后进行物种注释的方法相比,基于宏基因组测序序列的物种注释方法可以得到更加准确的物种注释结果。使用HUMAnN(V3.0)[11]软件结合UniRef 90数据库对宏基因组数据进行菌群功能特征和代谢途径的注释。

2 结果与分析

2.1 微生物分离鉴定结果分析

本研究对强化酒曲中的微生物进行了分离、纯化和鉴定,部分纯化后的菌株在固体培养基中的菌落形态和显微镜下的菌株形态如图1所示。

由图1-a可知,细菌分离株中部分菌株的菌落形态为圆形或椭圆形,颜色为不透明的灰白色,表面粗糙,菌落中心有凸起,在电子显微镜下呈现杆状或短杆状,符合芽孢杆菌的典型特征。由图1-b和图1-c可知,真菌分离株中一部分菌株菌落形态为圆形,表面光滑、呈乳白色,边缘整齐无扩散,易挑取,符合酵母菌菌落的典型特征;另一部分分离株菌落形态较大,疏松、干燥、不透明,外观呈现出或紧或松的网状或绒毛状,符合霉菌的典型特征。

为了确定各分离株的准确分类学地位,本研究将测定的细菌16S rRNA基因全长序列、真菌ITS区序列在NCBI网站进行了Blast比对,随后将标准菌株序列与本研究测定的序列一起通过MEGA(V7.0)软件构建了系统发育树,结果如图2所示。

由图2-a可知,3株细菌分离株分别鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)和丙二酸盐阳性克罗诺菌(Cronobacter malonaticus),所有菌株与标准株的同源性均在99%以上。由图2-b和图2-c可知,强化酒曲中共分离到17株真菌,其中15株为酵母,2株为霉菌。由图2-b可知,15株酵母分离株中,8株被鉴定为费比恩赛伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera fabianii),7株被鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。由图2-c可知,2株霉菌分别鉴定为桔青霉(Penicillium citrinum)和Bjerkandera minispora。

2.2 强化酒曲中微生物群落结构和功能解析

2.2.1 宏基因组测序量和强化酒曲中微生物α多样性比较

本研究采用Illumina Xten测序平台对强化酒曲中的微生物进行了宏基因组测序,其中增香酒曲和白酒曲测得的下机数据分别为6.7 G和6.5 G。经过fastp软件进行序列质控并去除人及植物中的污染序列后,两个样品实际用于后续分析的数据量分别为6.6 G和6.3 G。基于强化酒曲微生物在种水平的组成进行了α多样性分析,结果显示增香酒曲和白酒曲的Chao1指数分别为1 910和2 367,Shannon指数分别为1.40和0.79。上述结果表明,增香酒曲的微生物丰度较低、多样性较高;而白酒曲中微生物丰度较高、多样性较低。

2.2.2 强化酒曲中微生物群落结构分析

采用Broken软件和kraken2软件相结合的方式,对强化酒曲中的微生物群落结构进行了解析。结果显示,强化酒曲中的微生物主要由真菌和细菌构成,其中真菌在增香酒曲和白酒曲中的相对含量分别为86.63%和94.15%,细菌在增香酒曲和白酒曲中的相对含量分别为13.24%和5.79%,该结果表明虽然真菌均是两类酒曲中的主要优势菌属,但其在白酒曲中的相对含量更高。此外,从两个样品中还中检测到部分古菌和病毒,但两者的相对含量均在0.1%以下。

本研究在酒曲中共鉴定到微生物门、属和种的数量分别为31个门、594个属和1 564个种。在门水平,强化酒曲样品主要由子囊菌门(Ascomycota)、硬壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)等组成(图3-a)。上述菌门在增香酒曲和白酒曲中的相对含量分别为86.58%、8.72%、3.42%、0.86%、0.16%和94.12%、2.02%、0.95%、2.58%、0.17%。在属水平,强化酒曲样品主要由酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、魏斯氏菌属(Weissella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和链霉菌属(Streptomyces)等组成。上述菌属在增香酒曲和白酒曲中的相对含量分别为77.72%、5.07%、4.99%、1.16%、2.17%、0.18%和90.64%、2.17%、0.04%、1.39%、0.03%、0.99%(图3-b)。在种水平,强化酒曲样品主要由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、米根霉(Aspergillus oryzae)、类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、融合魏斯氏菌(Weissella confusa)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和发酵黏液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)。上述菌种在增香酒曲和白酒曲中的相对含量分别为77.08%、4.94%、2.6%、1.94%、1.46%、1.03%、0.97%和90.24%、1.57%、0.03%、0.02%、0.01%、0.25%、0.04%(图3-c)。两种强化酒曲在种水平的共有微生物分析结果显示,有504个菌种为两种酒曲所共有,这些微生物累计占总微生物相对含量的98.7%以上。由此可知,两种酒曲共有的微生物构成了酒曲微生物的主体部分。

2.2.3 强化酒曲中微生物功能分析

使用HUMAnN(V3.0)软件对强化酒曲中微生物的功能进行解析,从两种酒曲中共检测得到了464条代谢通路,优势代谢通路结果如图4所示。

由图4可知,两种强化酒曲丰度最高的3个代谢通路均为有氧呼吸(PWY-3781、PWY-7279)和蛋白质泛素化(PWY-7511),其他的优势代谢通路还包括叶绿醇降解(PWY66-389)、乙醛酸循环(GLYOXYLATE-BYPASS)、几丁质脱乙酰化(PWY-7118)、糖酵解IV(PWY-1042)、线粒体NADPH生产(PWY-7269)、丙酮酸发酵生成异丁醇(PWY-7111)、TCA循环V(PWY-6969)等。通过对各个菌的功能贡献度进行分析,结果显示酿酒酵母几乎对所有的代谢通路均起到了重要作用,这可能与其在样品中所具有的绝对优势地位有关。通过对两个样品各代谢通路的丰度进行比较,结果显示代谢通路棕榈酸生物合成(PWY-5971)、十二烯酸酯生物合成(PWY0-862)和油酸生物合成(PWY-7664)在增香酒曲中更为丰富;代谢通路叶绿醇降解(PWY66-389)、蛋白质泛素化(PWY-7511)、棕榈酰乙醇酰胺生物合成(PWY-8055)、磷脂酸生物合成(PWY-7411)、有氧呼吸代谢通路(PWY-7279)、线粒体NADPH生产(PWY-7269)和细胞质NADPH生产(PWY-7268)在白酒曲中更为丰富。

3 讨论

酒曲是白酒生产中的重要糖化发酵剂,是白酒发酵中各种酶类、微生物和香味物质前体的重要来源,对最终白酒品质的形成起着重要的作用。在一般酒曲尤其是中高温酒曲和高温酒曲的生产过程中,往往会经历一段时间的高温发酵过程,这会抑制酒曲中对温度耐受性不太高的酵母菌生长及其发酵活性。CAI等[12]的研究结果显示,在高温大曲中,占据优势地位的真菌属主要为嗜热真菌属(Thermomyces)和热子囊菌属(Thermoascus)等对高温耐受性较强的微生物,而酵母菌属的相对含量<1%。通过在白酒制作的过程中,添加具有优良发酵特性酵母菌制作的强化酒曲可以有效提高白酒中酯类、酮类、烯烃和酚类等挥发性化合物的浓度和感官品质[13]。本研究通过纯培养的方式共从强化酒曲样品中分离得到了20株菌株,其中大部分分离株为酵母菌,这与基于宏基因组测序的结果一致。本研究还分离得到了少量霉菌菌株,霉菌在白酒酿造过程中主要作用于发酵前期,其分泌的酶系如淀粉酶、糖化酶、脂肪酶和纤维素酶等可分解淀粉类和蛋白类大分子物质,不仅为白酒酿造提供重要的碳源、氮源,同时还为白酒呈香物质的形成提供前体物质。值得注意的是,本研究分离得到的其中一株霉菌为青霉,由于它们可以通过抑制其他有益微生物的生长来影响酒曲质量[14],因此一般认为该菌是白酒生产中不受欢迎的有害菌。在细菌方面,本研究从酒曲中分离得到解淀粉芽孢杆菌、耐寒短杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺菌各一株。之前的研究发现,解淀粉芽孢杆菌能够产生高活性的胞外蛋白水解酶和α-淀粉酶[15],加速糖的发酵并产生醇类、脂类和各种有机酸。短杆菌属的微生物经常可以在白酒酿造体系中检测到,据报道该菌属的微生物在产品风味形成方面发挥着重要作用[16]。克罗诺杆菌(原称阪崎肠杆菌)属的微生物在自然界中广泛分布,是一种食源性条件致病菌,该菌在白酒发酵中的具体作用目前尚不清楚。上述结果表明,在强化酒曲中既存在有利于发酵进行的微生物,同时也存在部分不利于白酒发酵的有害菌,值得在后续生产中进一步改进酒曲的质量。

通过对酒曲进行宏基因组测序,本研究对比了增香酒曲和白酒曲两种强化酒曲中微生物群落结构和功能的异同。研究结果显示,宏基因组学测序技术在挖掘酒曲微生物方面具有显著的优势,其能够检测到的微生物种类及精细化水平远高于扩增子测序技术[17]。菌群群落结构分析结果显示白酒曲与增香酒曲相比,微生物的丰度更高,但多样性更低,这可能与在白酒曲中90%以上的微生物都属于酿酒酵母,其他微生物的相对含量较低存在一定的关系。在菌群群落结构方面,除酿酒酵母在白酒曲中占据更高的相对含量外,其他优势微生物如米根霉、类肠膜魏斯氏菌、肺炎克雷伯菌、融合魏斯氏菌、蜡样芽孢杆菌等均在增香酒曲中相对含量更高。通过对比其他报道中强化酒曲的菌群组成,发现酒曲中接种不同的菌种,会导致最终产品中菌群群落结构存在非常大的差异。例如,WANG等[18]的研究结果显示,在制作大曲时添加地衣芽孢杆菌会导致最终强化酒曲产品中芽孢杆菌属(21.5%)、曲霉菌属(>30%)和棒孢酵母属(Clavispora,>4%)成为优势菌,与本研究两种强化酒曲中的优势菌群组成截然不同。基于以往的研究结果,我们发现除酿酒酵母外,本研究强化酒曲中的米根霉、魏斯氏菌属等微生物对于白酒发酵亦具有积极的作用。具体而言,米根霉在发酵过程中能产生多种水解酶和乙醇、乳酸、富马酸、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、酯类等众多的风味化合物[19]。魏斯氏菌属有利于发酵体系中有机酸、酯和短链脂肪酸的合成[20]。强化酒曲中还检测到了一定比例的蜡样芽孢杆菌,该菌种根据菌株是否携带肠毒素基因可以分为产毒菌株和不产毒菌株。其中,经过筛选的不产毒菌株可以产生丰富的淀粉酶和糖化酶,这对于产生白酒中的风味物质如己酸乙酯、醛类和酮类起着重要的作用[21],而该菌种的一些产毒菌株可以引起人体的腹泻、呕吐等症状[22],因此,后续研究中需要进一步确认酒曲中该菌种的产毒特性。本研究在强化酒曲中还检测到了大量的有害微生物——肺炎克雷伯菌。该菌虽然具有产生酒精的作用[23],但据报道肺炎克雷伯菌代谢会产生非挥发性的毒素,在特定条件下具有一定致病性[24]。因此,在制曲中肺炎克雷伯菌的有效控制也是值得关注的问题。需要指出的是本研究通过培养技术分离得到的一些优势菌种与基于宏基因测序分析得到的优势菌种之间存在一定的差异,导致这一结果可能的原因如下:(1)在对微生物进行分离鉴定时使用的培养基为选择性培养基,这可能会放大一部分菌群在分离得到的菌株中的比例;(2)在从平板上挑菌进行鉴定时,所挑取的菌株存在一定的随机性。在上述因素的共同作用下,可能会导致基于培养方法分离到的菌种比例与基于高通量测序技术分析得到的优势菌群之间有所出入。

在功能方面,两种酒曲的优势代谢通路组成相似。其中有氧呼吸代谢通路较为活跃,对于微生物分解原料产生能量,从而促进细胞生长、分化和存活至关重要。蛋白质泛素化则有利于特定的蛋白质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素[25],有利于促进发酵过程的进行。在增香酒曲中相对丰度较高的代谢通路大多与各种有机酸如棕榈酸、十二烯酸酯和油酸的生物合成有关。其中,棕榈酸和油酸均可以与乙醇相互作用,从而生成两种白酒中重要的脂类物质棕榈酸乙酯和油酸乙酯。同时棕榈酸还是长链脂肪酸合成的前体,在白酒发酵的过程中可以代谢成为多种长链脂肪酸[26]。这些均有利于使发酵得到的酒体更为丰满、醇厚。而在白酒曲中更为丰富的代谢通路中,如蛋白质泛素化、有氧呼吸、NADPH生产[27]等大多是与微生物生长密切相关,这说明白酒曲中的微生物具有潜在更强的生长繁殖能力,从而有利于促进发酵体系中的微生物的丰度,加速发酵反应的进程。

4 结论

本研究通过培养技术和宏基因组测序技术相结合的方式对市售两种不同类型强化酒曲中的可培养微生物和菌群群落结构及功能进行了解析。酵母菌是两种类型强化酒曲中的优势菌群,不同类型的强化酒曲菌群差异主要体现在优势菌群相对丰度方面而非构成方面。白酒曲拥有更高的酿酒酵母丰度,在功能方面白酒曲中的微生物具有潜在更强的增殖能力,有利于快速增加发酵体系中酿造微生物的丰度。而增香酒曲除了含较多的酿酒酵母外,还拥有众多与白酒风味物质产生相关的功能菌,具有潜在更强的风味物质产生能力。与此同时,强化酒曲中可以检测到青霉菌和较大比例的肺炎克雷伯菌等对白酒品质存在不利影响的微生物,因此市售强化酒曲的质量存在进一步提升的空间。本研究增加了人们对市售不同类型强化酒曲产品微生物群落结构和功能的认识,研究结果对于促进企业进一步提升酒曲品质亦具有一定的指导意义。

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