植物乳植杆菌是一类自然界中广泛分布的革兰氏阳性菌,营养代谢方式为化能异养型,具有兼性同型发酵特性,常见于各类发酵食品中,在人体中也普遍存在,是胃肠道内的益生菌群[1-2]。大量研究表明植物乳植杆菌有调节肠道菌群结构、改善肠道稳态的功能[3-4]。近年来,更多研究证实植物乳植杆菌还具有调节免疫,加强非特异性免疫[5];调节血糖、血脂、血压平衡,改善代谢紊乱[6];调节胆汁代谢,降低血清中胆固醇水平[7];促进营养物质吸收[8];缓解焦虑抑郁,调节阿尔兹海默症和认知障碍[9]等多种功能。植物乳植杆菌可被应用于一般食品或保健品行业,并在胃肠道疾病[10]、免疫受损[11]的临床治疗,改善面粉、鸡蛋等农产品特性[12],改良家畜或水产饲料[13]等方面也均有应用。
法国国家科研中心将分解碳水化合物的酶收录在CAZymes数据库中,其中包括糖苷酶、糖基转移酶和脂肪酶的信息[14]。CAZymes参与了复杂碳水化合物和糖复合物的组装和分解,按功能可分为糖苷水解酶(GHs)、糖基转移酶(GTs)、多糖裂解酶(PLs)、碳水化合物酯酶(CEs)、碳水化合物结合模块(CBMs)和辅助酶类家族(AAs)6大类。其中参与分解糖类、切断糖苷键的两类酶是GHs与PLs。菌株所能产生的碳水化合物酶越多,降解该种碳水化合物的能力越强,宏观上对该种碳源的利用效率就越高,在以该种碳水化合物为唯一碳源的培养基中的生长速率就越快。SHARMA等[15]利用CAZymes数据库对4种明串珠菌的碳水化合物酶活性进行分析,并阐明了明串珠菌属的低聚糖利用和叶酸生物合成途径。TAMURA等[16]研究了人体肠道微生物群(human gut microbiota,HGM)中各种CAZymes和非催化蛋白中聚糖识别的精细特异性,非催化性聚糖结合被归属于与细胞表面CAZymes串联生产的碳水化合物结合模块(carbohydrate binding modes,CBMs)。利用CAZymes预测系统可以有效地检测出菌株中所含的碳水化合物酶合成相关基因,通过查阅文献对检测得到的基因谱图进行注释,从而推断出菌株对应碳水化合物酶的表达量,为后续菌株的碳水化合物利用情况的研究和最佳培养基的筛选提供条件。
为了研究碳水化合物来源对菌株生长密度及最大比生长速率的影响,在通用的MRS培养基的基础上,根据植物乳植杆菌菌株的营养需要合成一种化学定义培养基(chemical definition culture medium,CDM)。CDM培养基能够精准控制变量,被广泛地运用到益生菌的单因素生长实验中。TEUSINK等[17]利用CDM培养基对植物乳植杆菌WCFS1的营养需求及代谢途径进行分析实验,验证了菌株生长过程中的氨基酸转化情况。利用CDM和MRS培养基作为对照开展平板实验能够有效地探究不同碳源对菌株生长的作用,从而验证酶预测得到的结果。
植物乳植杆菌AR113是上海理工大学食品微生物工程技术研究中心从四川泡菜中筛选出来的菌株,在缓解肠道微生物菌群失调、改善肠道炎症和维持上皮屏障完整性等方面具有良好效果[18]。本论文通过在线工具dbCAN,根据Diamond、HMMER以及Hotpep模型分析预测植物乳植杆菌AR113的碳水化合物酶类,并研究了AR113对不同碳源的利用情况,以期为提高培养密度、降低生产成本以及益生元的选择提供依据。
1 材料与方法
1.1 菌株
植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)AR113,由上海理工大学健康科学与工程学院实验室保藏。
1.2 碳源
肌醇、山梨醇、低聚木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖低聚半乳糖、纤维二糖、低聚果糖、麦芽糖。
1.3 培养基的制备
1.3.1 MRS液体培养基(g/L)
酪蛋白胨10.0、牛肉浸取物10.0、酵母提取液5.0、葡萄糖5.0、乙酸钠5.0、柠檬酸二胺2.0、吐温80 1.0、KH2PO4 2.0、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·7H2O 0.05、CaCO3 20.0。
1.3.2 MRS固体培养基
在液体培养基的基础上加入20.0 g/L的琼脂。
1.3.3 CDM培养基
根据文献[18]对CDM培养基进行修改,得到适合植物乳植杆菌AR113生长的CDM培养基(表1)。
表1 CDM培养基配方
Table 1 CDM medium formulation
物质质量浓度/(g·L-1)物质质量浓度/(g·L-1)丙氨酸0.240维生素B70.002 5精氨酸0.125维生素B110.005天冬氨酸0.420维生素B130.005谷氨酸0.500硫辛酸0.001甘氨酸0.175对氨基苯甲酸0.001组氨酸0.150抗坏血酸0.500异亮氨酸0.210维生素B120.001亮氨酸0.475盐酸吡哆胺0.005赖氨酸0.440腺嘌呤0.010甲硫氨酸0.125黄嘌呤0.010苯丙氨酸0.275鸟嘌呤0.010脯氨酸0.675尿嘧啶0.010丝氨酸0.340肌苷0.005苏氨酸0.225胸苷0.005色氨酸0.050K2HPO43酪氨酸0.250KH2PO43缬氨酸0.325柠檬酸氢二铵1半胱氨酸0.130MgSO4·7H2O0.200维生素B10.001三水乙酸钠8.300维生素B20.001MnCl2·4H2O0.025维生素B50.001CaCl20.050维生素B60.002葡萄糖20
表2 植物乳植杆菌AR113碳水化合物酶的鉴定
Table 2 Identification of L.plantarum AR113 CAZymes
碳水化合物酶类已鉴定基因具有信号肽的基因GH 糖苷水解酶549CE 碳水化合物酯酶21GT糖基转移酶 370CBM 碳水化合物结合模块64辅助酶类家族10独特基因总数9411
1.4 仪器与设备
PL2002型电子天平,梅特勒-托利多仪器有限公司;SW-CJ-1D型单人净化工作台,苏州净化设备有限公司;酶标仪,奥地利美谷分子;Ruskinn厌氧培养工作站,英国Ruskinn;BPH-G082型精密恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;Bioscreen C全自动生长曲线分析仪,芬兰Oy Growth Curves Ab公司;pH值酸度计,金博仕苏州生物技术有限公司;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂。
1.5 实验方法
1.5.1 菌株培养
将于-80 ℃保藏的植物乳植杆菌AR113在固体MRS培养基上进行划线,在37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h后,挑取单菌落于液体MRS培养基中,于37 ℃恒温培养箱中培养16～18 h后,以3%的比例接种于CDM中进行培养。
1.5.2 AR113碳水化合物酶预测
通过在线软件dbCAN 对结构域进行分类注释,dbCAN是一个用于注释碳水化合物活性相关酶的在线服务器,其基于保守结构域数据库(CDD)搜索和文献精选,为每个CAZymes家族明确定义了一个标签结构域并为此结构域构建隐马尔科夫模型(HMM)。选择Diamond、HMMER以及Hotpep工具对AR113的fasta格式的蛋白序列进行比对,得到可识别的CAZyme编码的基因和不同的碳水化合物酶家族分类。
1.5.3 碳源对AR113生长的影响
配制以各碳水化合物为唯一碳源的CDM培养基,将过夜培养的AR113以3%的接种比例接种于含不同碳源的CDM中,取200 μL置于培养板中,以未接菌的CDM液体培养基作参比,以接菌的MRS作为阳性对照,于37 ℃静置培养48 h,每30 min测定培养液600 nm处的吸光度值,并进行记录。每个样品设置3个平行。
将全自动生长曲线仪测得的结果进行处理,以时间为横坐标,OD600为纵坐标,得到AR113在含不同碳源的CDM中的生长曲线。
1.6 数据分析
将全自动生长曲线仪分析测得的数据使用Baranyi和Roberts模型模拟,得到比生长速率,如公式(1)～公式(3)所示:
(1)
y1=μmaxt+ln(e-μmaxtG-e-μmax(tG+tL)+e-μmaxtL)
(2)
y2=ln[1+10y0-ymax(eμmax(tG-tL)+e-μmaxtL)]
(3)
式中:y0,0 h菌悬液的OD600;ymax,菌悬液OD600的最大值;μmax,最大比生长速率,单位为OD600/h;tG,生长时间,h;tL,迟滞期时间,h。
试验数据采用 Microsoft Excel 2003 软件进行处理,用Origin 8.0进行作图,IBM SPSS Statistics 25.0软件进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 AR113碳水化合物酶预测
根据Diamond、HMMER以及Hotpep模型对AR113中可识别的CAZyme编码的基因进行整合,其中Diamond识别到174个基因,HMMER识别到99个基因,Hotpep识别到83个基因(图1)。3个工具识别到的共同的基因有68个。利用CAZyme数据库预测AR113中碳水化合物活性酶的分类和基因数量,AR113中包含糖苷水解酶家族(GHs)基因54个、糖基转移酶家族(GTs)基因37个、碳水化合物结合模块(CBMs)基因6个、碳水化合物酯酶家族(CEs)基因2个以及一个辅助活性酶家族(AA)的基因。AR113中含有丰富的GHs酶和GTs酶(表1),其中GHs酶主要包括GH1(11个)、GH25(5个)、GH13-31(5个)、GH25(5个)等,GTs酶主要包括GT4(14个)。
图1 植物乳植杆菌AR113碳水化合物酶的鉴定
Fig.1 Identification of L.plantarum AR113 CAZymes
2.2 CDM培养基中不同碳源对AR113生长的影响
根据糖环的个数将碳源分为3类,分别是单糖、二糖、寡糖(≥3个),在CDM培养基中,依次以这些碳水化合物作为唯一碳源,研究AR113对碳源的利用情况。
在以单糖为唯一碳源时,植物乳植杆菌AR113均能利用葡萄糖、果糖、甘露糖,不能利用阿拉伯糖,其中以甘露糖为碳源的培养基,在接种培养12 h后达到生长平稳期(OD=1.094),并且是最快进入对数期(3 h)(图2-a);在以二糖为唯一碳源时,植物乳植杆菌AR113能利用乳糖、海藻糖、麦芽糖、纤维二糖、蔗糖,其中以麦芽糖为碳源的培养基,在接种培养18 h后达到生长平稳期(OD600=1.357),显著高于其他水平实验(P<0.01)(图2-b);在以寡糖为唯一碳源时,植物乳植杆菌AR113能利用低聚半乳糖、甘露醇、山梨醇、低聚木糖,不能利用肌醇,其中以低聚半乳糖为碳源的培养基,在接种培养15 h后达到最大生长量(OD600=0.914),而后甘露醇、山梨醇也达到最大生长量(图2-c)。
a-以单糖为唯一碳源;b-以二糖为唯一碳源;c-以寡糖为唯一碳源
图2 CDM培养基中AR113的生长曲线
Fig.2 Growth curves for L.plantarum AR113 in CDM medium
以OD600的最大比生长速率作为代表量,进行单因素方差分析(表3)。由表3可知,与葡萄糖为碳源相比,AR113在部分碳源下的最大生长速率有显著增长,分别是低聚果糖0.082 OD600/h、纤维二糖0.082 OD600/h、麦芽糖0.089 OD600/h、甘露糖0.086 OD600/h、蔗糖0.085 OD600/h、海藻糖0.082 OD600/h,因此在CDM培养基中对碳源替换,对AR113有促增殖作用。AR113在以肌醇、阿拉伯糖为碳源的CDM培养基里几乎不生长。
表3 AR113的最大比生长速率
Table 3 The maximum growth ratio rate of L.plantarum AR113
CDM培养基MRS培养基碳源μmax/(OD600·h-1)最大OD值/(OD600)μmax/(OD600·h-1)最大OD值/(OD600)葡萄糖0.0661.0080.1591.401低聚果糖0.0821.1110.1591.471半乳糖0.0000.788 0.1141.299纤维二糖∗0.0821.2300.1571.478麦芽糖0.0891.4260.1551.558甘露糖0.0861.1350.1351.385低聚半乳糖0.0610.9390.1531.360肌醇∗0.0000.1660.0320.245果糖0.0590.6400.1501.175乳糖∗0.0240.9110.0310.814阿拉伯糖∗0.0000.1520.0660.571甘露醇0.0550.9310.1251.167山梨糖醇0.0440.9380.0651.174蔗糖∗0.0851.0850.1541.397低聚木糖0.0230.3660.0820.442海藻糖0.0821.205
注：*表示同一种碳源在2种培养基处理间差异显著(P<0.05)。
在不同培养基的碳源对AR113的增菌效果有显著性差异。从不同碳源液体培养基中AR113的OD600来看,对碳源利用率由高到低依次为麦芽糖、海藻糖(纤维二糖)、甘露糖、低聚果糖、蔗糖、葡萄糖、低聚半乳糖、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、果糖、低聚木糖。
2.3 MRS培养基中不同碳源对AR113生长的影响
同样将碳源分为3类,在MRS培养基中,依次以这些碳水化合物作为唯一碳源,研究碳源对AR113生长的影响。
在以单糖为唯一碳源时,植物乳植杆菌AR113均能利用葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖,其中以甘露糖为碳源的培养基,在接种培养12 h后达到生长平稳期(图3-a);在以二糖为唯一碳源时,植物乳植杆菌AR113均能利用乳糖、麦芽糖、纤维二糖、蔗糖,其中以麦芽糖为碳源的培养基,在接种培养12 h后达到生长平稳期,显著高于其他水平实验(图3-b);在以寡糖为唯一碳源时,植物乳植杆菌AR113均能利用低聚半乳糖、甘露醇、山梨醇、低聚木糖、低聚果糖(图3-c),几乎不能利用肌醇,其中以低聚果糖为碳源的培养基,在接种培养24 h后达到最大生长量,而后甘露醇、低聚半乳糖也达到最大生长量。
a-以单糖为唯一碳源;b-以二糖为唯一碳源;c-以寡糖为唯一碳源
图3 MRS培养基中AR113的生长曲线
Fig.3 Growth curves for L.plantarum AR113 in MRS medium
同样以OD600的最大比生长速率作为代表量,将各组进行单因素方差分析(表3)。由表3可知,以葡萄糖为碳源的MRS培养基中,AR113的最大生长速率值最大为0.159 OD600/h,比较可见对AR113有促增殖作用。
从不同碳源液体培养基中AR113的OD600来看(表3),对碳源利用率由高到低依次为麦芽糖、低聚果糖(纤维二糖)、蔗糖(甘露糖)、低聚半乳糖、半乳糖、山梨糖醇(甘露醇)。
2.4 对比MRS和CDM培养基的最优碳源
由表3可知,MRS和CDM培养基的最优碳源均为麦芽糖,而两者同时刻的OD600比较发现,以MRS为基底的培养基的最大光密度值(OD600=1.558)显著优于以CDM为基底(OD600=1.426)的培养基,MRS中的葡萄糖碳源的最大光密度值(OD600=1.612)显著优于以CDM为基底(OD600=1.008),同一种碳源情况下,MRS培养基均优于CDM培养基,因此在配置增殖AR113的培养基时可以优先选择以麦芽糖为碳源的MRS培养基。
3 讨论
本研究通过CAZyme预测AR113碳水化合物酶并通过实验进行验证。CAZyme预测结果表明,AR113含有CAZyme共100个,其中包含糖苷水解酶家族(GHs)基因54个,分别为GH1(11个)、GH25(5个)、GH13-31(5个)、GH25(5个)。平板实验表明,AR113能够利用的碳水化合物种类丰富,均可利用单糖、二糖、寡糖,其中利用麦芽糖的能力最强。由于GHs与PLs是参与切断糖苷键的最主要的两类酶,而AR113中含有大量的GHs酶类,占总酶类的54%,使得菌株对多种碳水化合物表现出极强的降解能力,GHs酶的含量比CEs酶高,也证实本实验中AR113对麦芽糖、甘露糖的利用比葡萄糖更高效。多糖主链的降解主要通过GHs和一部分PLs来完成;侧链的降解则需要包括木糖苷酶、甘露糖苷酶及CEs在内的大量水解酶的参与[19],而AR113中也含有大量CEs酶类,使得AR113对寡糖的分解能力也有明显提高。菌株可以降解的碳水化合物类别与CAZymes的种类差异息息相关。植物乳植杆菌AR113含有GH1、GH16、GH30、CBM13、PL9、PL11、GT39酶类,主要功能为分解低聚木糖、葡聚糖、甘露糖和鼠李糖等;CBM26、CBM63、GH3/CBM50、GH13/CBM26酶类,主要功能为分解木糖、蔗糖、淀粉和纤维素等;GH1家族含有的β-葡萄糖苷酶可水解纤维二糖和纤维寡糖为单糖;GH13、GH15、CBM20、CBM25等,能够有效降解淀粉等多糖[20]。因此可以依据CAZymes预测结果大大缩小碳源范围。
但由于MRS培养基中含有酪蛋白胨、牛肉浸取物和酵母提取液等,这些成分也可能含有促进菌株生长的碳源,影响实验结果;而CDM培养基中的所有成分都是明确的,能够精准控制变量,被广泛地运用到益生菌的单因素生长实验中,而且实验结果准确可靠。通过对比发现,在CDM和MRS培养基中,AR113对不同碳源的喜好趋势相同,但是相同碳源下,AR113生长得更好。在两种培养基中,AR113最适碳源均为麦芽糖,说明麦芽糖更符合植物乳植杆菌的生长,这与金玉洁等[21]的研究结果一致,他们也发现植物乳植杆菌ZU018的最适碳源也是麦芽糖。虽然葡萄糖是最广泛的速效糖源,但对于特定的菌株可能存在最适的碳源,可以进一步利用这些碳源作为特异性益生元实现菌株快速增殖,但促进菌株生长的机制还需进一步的研究。
[1] 徐永霞, 白旭婷, 赵洪雷, 等.植物乳杆菌在水产品中的应用研究进展[J].中国调味品, 2022, 47(2):195-199.
XU Y X, BAI X T, ZHAO H L, et al.Research progress on application of Lactobacillus plantarum in aquatic products[J].China Condiment, 2022, 47(2):195-199.
[2] 曹承旭, 郭晶晶, 乌日娜, 等.植物乳杆菌的生理功能和组学研究进展[J].乳业科学与技术, 2018, 41(1):33-39.
CAO C X, GUO J J, WU R N, et al.Advances in understanding the physiological function and omics of Lactobacillus plantarum[J].Journal of Dairy Science and Technology, 2018, 41(1):33-39.
[3] 刘超楠. 不同来源植物乳杆菌基因组以及对碳水化合物利用的比较分析[D].北京:中国农业科学院, 2021.
LIU C N.Comparative analysis of different sources of Lactobacillus plantarum genome and carbohydrate utilization[D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2021.
[4] LEITE M C T, TROXELL B, BRUNO-B
RCENA J M, et al.Biology of Reactive Oxygen Species, Oxidative Stress, and Antioxidants in Lactic Acid Bacteria[M].Poole:Caister Academic Press, 2015:205-218.
[5] 李吉楠, 孙鹏, 覃春富, 等.乳酸菌对动物局部和系统免疫调节功能影响的研究进展[J].畜牧兽医学报, 2013, 44(11):1 700-1 705.
LI J N, SUN P, QIN C F, et al.Progress in effects of lactic acid bacteria on local and systemic immune in animals[J].Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 2013, 44(11):1 700-1 705.
[6] LI C, NIE S P, ZHU K X, et al.Lactobacillus plantarum NCU116 improves liver function, oxidative stress and lipid metabolism in rats with high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease[J].Food &Function, 2014, 5(12):3 216-3 223.
[7] SHUKLA P K, MEENA A S, MANDA B, et al.Lactobacillus plantarum prevents and mitigates alcohol-induced disruption of colonic epithelial tight junctions, endotoxemia, and liver damage by an EGF receptor-dependent mechanism[J].FASEB Journal:Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 2018, 32(11):6 274-6 292.
[8] 张群. 植物乳杆菌及其应用研究[J].食品与生物技术学报, 2013, 32(3):336.
ZHANG Q.Study on Lactobacillus plantarum and its application[J].Journal of Food Science and Biotechnology, 2013, 32(3):336.
[9] LIU Y W, LIU W H, WU C C, et al.Psychotropic effects of Lactobacillus plantarum PS128 in early life-stressed and naïve adult mice[J].Brain Research, 2016, 1631:1-12.
[10] HIGASHIKAWA F, NODA M, AWAYA T, et al.Improvement of constipation and liver function by plant-derived lactic acid bacteria:A double-blind, randomized trial[J].Nutrition, 2010, 26(4):367-374.
[11] MA
É J, PEDROSA E, LORÉN V, et al.A mixture of Lactobucillus plantarum CECT 7315 and CECT 7316 enhances systemic immunity in elderly subjects.A dose-response.double-blind.placebo-controlled randomized pilot trial[J].Nutricion Hospitalaria, 2011, 26(1):228-235.
[12] 汪桢,马森,孙冰华,等. 植物乳杆菌和酿酒酵母协同发酵条件下的麦麸膳食纤维对小麦淀粉特性的影响研究[C].北京:2021年中国食品科学技术学会第十八届年会论文集. 2022:271-272.
WANG Z, MA S, SUN B H, et al. Effect of wheat bran dietary fiber on structural and thermal properties of wheat starch after synergistic fermentation of Lactobacillus plantarum and Saccharomyces cerevisiae[C]. Beijing: Proceedings of the 18th Annual Conference of Food Science and Technology Society of China in 2021. 2022:271-272.
[13] 陈雪林. 植物乳杆菌对蛋鸡生产性能、蛋品质及经济效益的影响[J].饲料研究, 2021, 44(11):49-52.
CHEN X L.Effect of Lactobacillus plantarum on production performance, egg quality and economic benefit of laying hens[J].Feed Research, 2021, 44(11):49-52.
[14] 安琦, 曹亚彬, 牛彦波, 等.优化植物乳杆菌发酵黄芩药渣制备饲料添加剂的研究[J].饲料研究, 2022, 45(4):75-79.
AN Q, CAO Y B, NIU Y B, et al.Study on optimization of preparation of feed additives from Scutellaria baicalensis residues fermented by Lactobacillus plantarum[J].Feed Research, 2022, 45(4):75-79.
[15] SHARMA A, SHARMA N, GUPTA D, et al.Comparative genome analysis of four Leuconostoc strains with a focus on carbohydrate-active enzymes and oligosaccharide utilization pathways[J].Computational and Structural Biotechnology Journal, 2022, 20:4 771-4 785.
[16] TAMURA K, BRUMER H.Glycan utilization systems in the human gut microbiota:A gold mine for structural discoveries[J].Current Opinion in Structural Biology, 2021, 68:26-40.
[17] TEUSINK B, VAN ENCKEVORT F H, FRANCKE C, et al.In silico reconstruction of the metabolic pathways of Lactobacillus plantarum:Comparing predictions of nutrient requirements with those from growth experiments[J].Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(11):7 253-7 262.
[18] FUKUDA K, SHI T L, NAGAMI K, et al.Effects of carbohydrate source on physicochemical properties of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus fermentum TDS030603 in a chemically defined medium[J].Carbohydrate Polymers, 2010, 79(4):1 040-1 045.
[19] BATTAGLIA E, BENOIT I, VAN DEN BRINK J, et al.Carbohydrate-active enzymes from the zygomycete fungus Rhizopus oryzae:A highly specialized approach to carbohydrate degradation depicted at genome level[J].BMC Genomics, 2011, 12:38.
[20] 刘文君, 吕瑞瑞, 李伟程, 等.基于比较基因组学揭示不同植物乳杆菌的遗传特征及菌株差异:以Lactobacillus plantarum P9和Lp-6研究为例[J].微生物学报, 2021, 61(8):2 370-2 381.
LIU W J, LYU R R, LI W C, et al.Comparative genomics revealed genetic characteristics of different Lactobacillus plantarum strains:Using P9 and Lp-6 strains as examples[J].Acta Microbiologica Sinica, 2021, 61(8):2 370-2 381.
[21] 金玉洁, 何国庆.植物乳杆菌ZU018增殖培养基的优化[J].食品工业科技, 2020, 41(14):94-100.
JIN Y J, HE G Q.Optimization of Lactobacillus plantarum ZU018 proliferation medium[J].Science and Technology of Food Industry, 2020, 41(14):94-100.