风味是食物的重要感知属性,用于评估其营养相关属性和新鲜度[1]。食物的香气品质很大程度上取决于挥发性物质的综合影响[2]。在全球,发酵豆乳的市场规模远低于酸乳市场[3],主要是由于发酵豆乳所产生的豆腥味影响消费者对其的接受度。发酵豆乳中存在多种挥发性风味物质,包括良好的香味物质和不良的豆腥味、青草味等异味挥发性成分,对发酵豆乳的风味有较大影响。目前,有研究表明,发酵豆乳中主要存在的豆腥味挥发性化合物有己醛、1-辛烯-3-醇、正己醇、苯甲醛、(E, E)-2,4癸二烯醛、戊醇、正壬醛和(E)-2-己烯醛,主要呈现割青草味、蘑菇、苦杏仁味和辛辣味[4-6]。非豆腥味化合物3-甲基正丁醛、(E)-2-辛烯醛、正壬醛和(E)-2-壬烯醛呈黑巧克力、青瓜、绿菜花和水果味[4],乙偶姻和2,3-丁二酮是发酵乳制品中特有的香气物质,对产品的香气有积极的影响,具有强烈的芳香气味和乳脂气息[7]。

针对发酵豆乳产生的豆腥味问题,许多学者对其做出解决方法,郭帅等[4]通过嗜热链球菌与植物乳杆菌复合发酵豆乳,降低豆腥味物质的产生,提高呈良好风味物质的产生;刘婷等[8]通过添加不同种类及浓度的碳源来提高发酵豆乳风味;徐寅等[9]通过改变牛乳添加量来降低发酵豆乳豆腥味,提高产品良好的风味;ZHENG 等[10]通过筛选高产2,3-丁二酮和乙偶姻的菌株来改善发酵豆乳的风味。发酵是挥发性风味物质产生的根本,不同发酵方式对挥发性风味物质产生有较大影响,但如何通过不同发酵方式改变发酵豆乳的风味,未有报道。

发酵豆乳的挥发性风味物质种类繁多,但并不是每一种风味物质都对风味起决定性作用,不同风味物质由于相对含量不同、呈味特性不同,对发酵豆乳最终的风味贡献程度也不相同[11]。本研究通过GC-MS技术对不同混合发酵方式的发酵豆乳风味进行检测,对3种方式下的产品进行聚类分析,并对主要挥发性成分进行主成分分析。该研究揭示了不同混合发酵方式对发酵豆乳风味造成差异的主要原因,有利于发酵豆乳产品的开发并对其工业化生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全脂乳,扬州大学康源乳业有限公司;大豆、蔗糖、小苏打,市售;商业发酵剂,江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室;氢氧化钠,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PL2002电子天平,梅特勒-托利多仪器有限公司;SW-CJ-1F超净工作台,苏州净化设备有限公司;GYB60-08超高压均质机,上海东华高压均质机厂;JF-SX-500高压蒸汽灭菌锅,日本TOMY公司;SPX-150FS-Ⅱ生化培养箱,上海新苗医疗器械制造有限公司;TMS-Pro质构仪,美国TMS公司。

1.3 混合发酵豆乳的制备工艺流程

大豆经清洗后,用0.3%NaHCO3水溶液浸泡16 h[m(干豆)∶m(水)=1∶3]、洗涤2～3次,沸水灭酶8 min,按一定比例制备豆乳,20 MPa均质,经95～100 ℃热处理10 min,冷却备用。

11.5%全脂乳中添加蔗糖,混合均匀,20 MPa均质,经过95 ℃/5 min热处理,冷却至42 ℃,接种2%乳酸菌发酵剂,42 ℃培养。

样品1:牛乳与豆乳按1.5∶1质量比混合后再发酵;样品2:单独发酵牛乳,再与豆乳按1.5∶1质量比混合;样品3:单独发酵牛乳,4 ℃后酸化24 h后,再与豆乳按1.5∶1质量比混合。

1.4 质构特性

发酵豆乳的质构测定参照参考文献[12],对发酵豆乳的硬度、黏附性、内聚性、弹性、胶黏性和咀嚼性等指标进行测定。

1.5 感官评分

感官评分标准参照参考文献[13],稍作修改。感官评定小组由乳品实验室10名研究生组成,该小组研究生均经过发酵乳和发酵豆乳的感官培训,评定小组成员从产品色泽、滋味、气味和组织状态进行评分。感官评价标准参照表1。

1.6 挥发性风味物质

参照参考文献[14]的方法测定部分混合发酵豆乳贮藏期的挥发性风味物质。

GC条件:HP-5毛细管柱(30 mm×0.25 mm,0.25 μm);采用程序升温方式,起始温度35 ℃,保持5 min,以5 ℃/min的速率上升至140 ℃,保持2 min,以10 ℃/min的速率上升至250 ℃,保持3 min;气化室温度为250 ℃;载气为He,流速1.0 mL/min;不分流进样。

MS条件:电子电离源;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;质量扫描范围m/z 35～500;发射电流100 μA。

SPME萃取条件:萃取头老化温度250 ℃,老化时间为20 min,平衡温度为50 ℃,平衡时间为45 min,250 ℃解吸附3 min。

对测定结果进行定性与定量分析。

定性方法:利用随机携带Masshunter工作站NIST 11标准库进行自动比对。

定量方法:在发酵样品中加入内标物1,2-二氯苯溶液,样品中各组分风味物质的质量浓度可代入公式(1)计算:

(1)

式中:ρi,待测样品中各风味化合物的质量浓度,μg/L;ρs,1,2-二氯苯的质量浓度,μg/L;Ai,样品中待测物质对应的色谱峰面积;As,内标物色谱峰面积。在对发酵乳中挥发性风味化合物定量的基础上,以各风味化合物在水中的风味阈值作为参考,计算能表征风味化合物贡献率的物理量——香气活度值(odor activity value,OAV)。可代入公式(2)计算:

(2)

式中:OAVi,风味化合物i的香气活度值;ρi,发酵乳中挥发性风味化合物的质量浓度,μg/L;OTi表示所测风味化合物在水中的气味阈值。

1.7 数据统计与分析

使用Excel 2021、Origin 2020处理与分析数据,绘制主成分分析图、热力图和雷达图。

2 结果与分析

2.1 质构特性

质构是影响发酵乳制品质量的重要指标[15]。不同混合发酵方式的发酵豆乳的质构测定结果如表2所示。豆乳与牛乳混合后再发酵的制备方式,使样品1形成了稳定的凝胶结构,呈现为固态,而样品2和样品3均为搅拌型发酵豆乳,因此,其硬度、胶黏性和咀嚼性显著低于样品1(P<0.05),发酵乳发酵结束后就混入豆乳所制备的样品2,其流动性较大,胶黏性较小,而发酵乳发酵结束后酸化24 h再混入豆乳制备的样品3具有较高的黏附性、内聚性和弹性。

2.2 感官评分

感官评分是评价发酵乳制品的重要指标,通过感官评分可以反映出不同样品间的差异及消费者对样品的喜好程度[16]。品评小组对3种混合发酵方式制备的样品感官评分如图1所示。

3种混合发酵方式制备的样品在色泽上差异较小,3种方式下的样品整体呈现乳白色,稍带微黄,且具有良好的光泽。样品1呈现固态,具有良好的凝胶结构,且无乳清析出;样品3呈现半固态,具有较好的黏弹性;样品2与样品3具有相似的形态,但样品2流动性较大,黏弹性差,且有少量乳清析出,因此,样品2的组织状态较差。产品的气味主要取决于其内在的挥发性物质,滋味来源于挥发性成分和非挥发性成分,样品3的气味和滋味评分值最高,可能是样品3的良好风味物质成分较高,使发酵豆乳具有清爽的酸味和豆乳香气,产生强烈的芳香气味,从而使产品具有良好的滋味和气味。

2.3 挥发性风味物质的变化

2.3.1 挥发性风味物质的总体分析

不同混合发酵方式的发酵豆乳挥发性成分如表3所示,3种方式制备的发酵豆乳中检测出的主要挥发性风味物质共40种,其中,酸类化合物6种,醇类化合物10种,酮类化合物9种,醛类化合物6种,酯类化合物4种,其他化合物5种,并结合表3所示物质的含量和感觉阈值确定各组分的OAV,如表4所示。样品1共检测出主要挥发性风味物质26种;样品2共检测出主要挥发性风味物质21种;单独发酵牛乳,4 ℃后酸化24 h后,样品3共检测出主要挥发性风味物质25种。3种方式制备的发酵豆乳检测出共同挥发性风味化合物11种,其中,醇类和酮类化合物中相同的物质种类较多,酸类、酯类和醛类化合物差异较大。由图2-a和图2-b可知不同混合发酵方式对发酵豆乳挥发性物质种类和含量影响较大。结合表2和图2-b可知,样品2的酸类、醇类、酮类和醛类化合物含量高于样品1和样品3,但样品2未检测出酯类化合物,可能是由于酸和醇之间还未发生酯化反应或者反应产生的酯类化合物含量较少未检测到。

酸类化合物是发酵乳制品中重要的风味物质,大多数酸是在发酵过程中产生的,部分是脂肪分解和蛋白质水解等代谢途径产生[17-19],对发酵乳风味有较大影响。有机酸是发酵豆乳酸味的来源,少量有机酸可以为产品带来愉快的酸爽味,但是过量的有机酸则会引起酸败气味,影响食欲[19]。乙酸质量浓度在0.5～18.8 μg/L较适合,不会使整体风味失衡[19],本研究在样品2和样品3中分别检测出乙酸的质量浓度分别为7.19和2.83 μg/L,可赋予产品清爽的酸味,而样品1中未检测出乙酸,但检测出其他酸类化合物(如己酸和辛酸),己酸在低质量浓度下也呈现一定的奶香味[20]。不同混合发酵方式对发酵豆乳产生的酸类化合物种类存在差异,含量也存在较大差异。

醇类化合物一般由醛、酮、氨基酸作用产生[21]。本研究测得3种混合发酵方式制备的样品中醇类物质主要有1-戊醇、2-甲基-3-戊醇、正己醇、正庚醇、正癸醇、环十五烷基醇、(Z)-3-壬烯-2-醇、正辛醇、异辛醇和1-壬醇等10种醇类化合物。其中,正己醇、正庚醇、正辛醇和1-壬醇在3种混合发酵方式制备的样品中都有被检测出,正己醇和正辛醇是发酵豆乳不良风味的来源,二者分别呈现脂肪氧化味和蘑菇味,样品1、样品2和样品3中正己醇的质量浓度在醇类化合物中较大,其质量浓度分别为8.11、17.45和12.35 μg/L,其阈值较低,对混合发酵豆乳产品气味产生较大影响,由于其所带来脂肪氧化味使发酵豆乳产生不良风味,且质量浓度越高带来的异味越浓烈,故使样品2的气味评分值较低。正辛醇在3个样品中的质量浓度较低,且其阈值较大,因此对样品的风味贡献较少。样品2中正己醇的质量浓度最高,其带来的令人不愉悦的青草味使样品2的气味感官评分降低。1-壬醇具有玫瑰香气,其存在会丰富发酵混合豆乳的香味[22],在样品1、样品2和样品3中的质量浓度分别为0.74、1.79、1.03 μg/L。2-甲基-3-戊醇是样品1独有的风味物质,但目前未有研究指出此化合物对发酵豆乳风味会产生何种影响。

酮类化合物是发酵乳中主要的一类挥发性化合物,2,3-丁二酮和乙偶姻是发酵乳中主要的香味物质,具有乳脂气息、干酪气息和豆香味,可赋予发酵豆乳良好的风味[4]。在样品1中检测到2,3-丁二酮的质量浓度为11.75 μg/L,含量较高,对发酵乳的风味有较大影响,当2,3-丁二酮的含量为1.5～5 μg/L时,会产生奶油味[10],但过量的2,3-丁二酮也会导致风味化合物失衡,产生一些其他化合物[23]。乙偶姻的感觉阈值是2,3-丁二酮的2.33倍,因此对风味的影响较小,样品1、样品2和样品3中乙偶姻的质量浓度分别为11.81、7.69、7.12 μg/L,样品1的乙偶姻含量较高,一部分是α-乙酰乳酸合成酶催化丙酮酸形成α-乙酰乳酸,α-乙酰乳酸脱羧酶作用于α-乙酰乳酸形成乙偶姻,另一部分是双乙酰通过双乙酰还原酶形成乙偶姻[24]。在3种不同混合发酵方式制备的样品中均检测到了2-庚酮和2-壬酮,样品1、样品2和样品3中检测到的2-庚酮质量浓度分别为7.77、19.94、16.35 μg/L,2-壬酮的质量浓度分别为4.40、8.30、7.38 μg/L,这2种酮类化合物在样品2中的质量浓度最高,2-庚酮具有奶酪香气,可赋予发酵豆乳醇厚的奶香味,使人喜欢,而2-壬酮具有脂肪味,较高质量浓度会使样品产生脂肪氧化味,影响其良好的风味,但目前未有研究指出同时具有高质量浓度的2-庚酮和2-壬酮对发酵豆乳制品风味会产生良好或不好影响,由于2-壬酮的阈值仅为2-庚酮的1/3,因此,推断高浓度的2-壬酮产生的脂肪氧化味会掩盖2-庚酮产生的乳香味,使产品风味不佳。

醛类化合物的阈值较低,对发酵乳的风味影响更大[25]。在本研究中仅检测出6种醛类化合物,分别为(Z)-2-庚醛、苯甲醛、(E, E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-辛烯醛、癸醛和(E, E)-2,4-癸二烯醛,其中,癸醛在3种不同混合发酵方式制备的样品中均被检测到,在样品1、样品2和样品3中的质量浓度分别为0.38、0.89、0.68 μg/L,癸醛的阈值仅为0.003,因此,较低质量浓度癸醛也会对发酵豆乳风味产生较大影响。同时,在样品2中检测到具有苦杏仁味的苯甲醛和油脂氧化味的(E, E)-2,4-癸二烯醛,质量浓度分别为3.93 μg/L和2.29 μg/L,苯甲醛阈值较大,对风味贡献较少,但(E, E)-2,4-癸二烯醛的阈值极低为0.000 16,其OAV为14 312.50,给样品带来较大的异味,严重影响了样品的风味。而样品3中均未检测到此2种不良风味化合物,而是检测到具有果香味的(E)-2-庚烯醛和(E)-2-辛烯醛,可使发酵豆乳具有宜人的芳香风味,由此可知,不同混合发酵方式下的发酵豆乳醛类化合物种类差异较大,且对风味贡献较大。

酯类化合物是发酵乳中的一类重要挥发性化合物,大多数酯类具有水果和花香味[26],可赋予发酵乳良好的风味。样品2无明显酯香味,在其风味检测中未检测到酯类化合物,可能是由于化合物含量极低而未检测到。样品1和样品3的酯类化合物种类和含量虽然较低,但能嗅到酯类的芳香气味,从而使产品的气味更加丰富且柔和。

由于其他化合物种类较少,因此,把烷烃类化合物归类在其中,烷烃类化合物由于其阈值较高,对发酵乳风味影响不明显[27]。在样品1中检测到了呈豆腥味的2-戊基呋喃,质量浓度为1.01 μg/L,但未发现其对样品风味贡献值的大小,因此,推断2-戊基呋喃也是使样品2产生不良风味的原因之一。

2.3.2 不同混合发酵方式的豆乳主要挥发性物质主成分分析

挥发性化合物的主成分分析用于进一步评估不同样品间的区别,不同混合发酵方式的样品及挥发性化合物的主成分分析(principal component analysis,PCA)结果如图3所示,选择贡献最大的2个主成分来生成PCA分布,PC1和PC2分别解释了总方差的68.6%和31.4%。不同混合发酵方式的样品在分布图中占据了相对独立的空间,3种混合发酵方式的样品明显分离,表明了不同发酵混合方式对发酵豆乳的香气成分有较大影响。

由图3-a和图3-b可知,样品1的风味与2,3-丁二酮和乙偶姻具有较强的相关性,2,3-丁二酮和乙偶姻的存在可使产品具有浓郁的奶香味和乳脂气息,但过量的2,3-丁二酮会使香气失衡,这可能是样品1中2,3-丁二酮和乙偶姻含量最高,但气味评分值较低的原因之一;样品2的风味与1-壬醇、正庚醇、苯甲醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-十一酮、辛酸和正辛醇有较强的相关性,样品2中苯甲醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛2种不良风味化合物含量较高,使产品产生苦杏仁味和强烈的油脂味,从而影响产品的气味和滋味评分值;样品3的风味与1-戊醇、(E)-2-辛烯醛和(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮有较强的相关性,1-戊醇、(E)-2-辛烯醛的存在使产品具有清爽的果香味,可提高发酵豆乳的芳香风味,使产品具有发酵豆乳特有的乳香和豆香味。

2.3.3 不同混合发酵方式的发酵豆乳主要挥发性物质聚类分析

不同混合发酵方式的豆乳样品挥发性风味物质含量采用lg缩放,随后采用热力图可视化结合相关聚类分析进行分析,颜色越红表示其含量越高,结果如图4所示。

由图4可知,从树状图的第一级分类中可以看出,牛乳与豆乳混合后发酵和单独发酵牛乳与豆乳混合2种方式的产品挥发性风味物质具有较为相似的风味物质。它们的主要香气成分包括正癸醇、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-十一酮、异长叶烯酮、辛酸、2-壬酮、乙偶姻、2-庚酮、正己醇、十二烷、癸醛、2,6,10-三甲基十二烷、1-壬醇、正辛醇、正庚醇和正己酸16种风味物质。

在树状图的第二级分类中可以看出,3种混合发酵方式的样品都具有较为相似的风味物质。它们在2-壬酮、乙偶姻、2-庚酮、正己醇、十二烷、癸醛、2,6,10-三甲基十二烷、1-壬醇、正辛醇、正庚醇和正己酸等11种风味物质上具有较高的相似性,其中,2-壬酮、乙偶姻、2-庚酮、正己醇、癸醛和正己酸对发酵豆乳风味贡献较大。

3 结论

本试验通过感官评分对3种混合发酵方式制备的样品进行评定,并采用SPME-GC-MS技术,结合主成分分析和聚类分析对3种混合发酵方式制备的样品的挥发性风味物质进行分析。酮类和酯类化合物的存在丰富了发酵豆乳的乳脂香气,乙偶姻和2,3-丁二酮是主要的香气物质,而过量的2,3-丁二酮使发酵豆乳的芳香风味失衡,降低了其气味评分值,醛类化合物是不良风味的主要来源,但(E)-2-庚烯醛和(E)-2-辛烯醛可使发酵豆乳具有宜人的芳香风味,因此,样品3具有丰富的乳香味、豆香味和柔和的芳香味,感官评分值较高。另外,在样品1中发现了质量浓度为4.79 μg/L的2-甲基-3-戊醇,但目前未有研究指出2-甲基-3-戊醇的存在会给发酵豆乳带来何种影响,因此,为下一步发酵豆乳风味化合物的研究提供了新思路。

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Effects of different mixed fermentation methods on the characteristic flavor of fermented soymilk

ZONG Lina, QU Hengxian, ZHANG Longfei, LIU Yang, LU Maolin, WANG Wenqiong, WA Yunchao, GU Ruixia*

(Jiangsu Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Safety Control, Yangzhou University, Yangzhou 225000, China)

ABSTRACT In this study, the effect of different mixed fermentation methods on the flavor of fermented soymilk was studied. The volatile flavor of fermented soymilk under different mixed fermentation methods were analyzed by sensory score. The results showed that 40 kinds of volatile flavor compounds were detected in fermented mixed soymilk samples, among them, nine ketones and four esters were the main compounds that give fermented soymilk an aromatic smell, while six aldehydes were the main compounds that make fermented soymilk produce a bad flavor. The fermented milk was firstly acidified at 4 ℃ for 24 h, and then it was mixed with soymilk at a mass ratio of 1.5∶1. Under this condition, the acetoin, 2-heptanone, 1-nonanol, (E)-2-heptanaldehyde and (E)-2-octenal were produced to give good creamy flavor and soft aromatic flavor, it can cover up the bad flavor and give the best sensory score, and the sensory score was the highest.

Key words fermented mixed soymilk; mixed fermentation; sensory score; volatile flavor substances

第一作者：硕士研究生(顾瑞霞教授为通信作者,E-mail:guruixia1963@163.com)

基金项目：国家自然科学基金面上项目(31972094);江苏省自然科学基金面上项目(BK20211325)

收稿日期：2022-09-02,改回日期：2022-10-06

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033522

引用格式：宗丽娜,瞿恒贤,张龙飞,等.不同混合发酵方式对发酵豆乳特征风味的影响[J].食品与发酵工业,2023,49(11):102-110.ZONG Lina, QU Hengxian, ZHANG Longfei, et al.Effects of different mixed fermentation methods on the characteristic flavor of fermented soymilk[J].Food and Fermentation Industries,2023,49(11):102-110.