中药类保健食品是我国保健食品的重要组成部分,其原料主要来源于“药食同源”类中药,具有食品属性。原料中药的成分复杂多样及多功能活性给中药类保健食品质量的有效控制带来了巨大挑战[1]。中药类保健食品的质量控制现多借鉴中药复方质量控制方法体系和思路。但鉴于其食品属性,在质量控制上的关注点应着重于其功能相关的成分以保证核心功能的有效性。若对产品中大多数或全部功效成分进行监测控制,在实际生产中又存在检测难度大,成本高等问题。通过对少量特征性强、功能明确的成分进行检测和评价,可规避现有许多保健食品仅以总黄酮、总皂苷等总成分含量作为代表评价,从而造成产品质量不稳定的现象[2-3]。为了保证保健食品的功效,亟需建立一套稳定、适用于生产且符合产品自身功能等特点的质量控制体系。通过对多个功效成分整体的控制可以在保证质量标准在实际生产中可行性的基础上,更全面地监控产品质量。
网络药理学是近年来常应用于中药及中药复方研究中的一个探究核心成分与功能的方法,可通过对“成分-靶点-疾病”网络的多层次网络联系完成对中药药效物质基础及机制探寻[4]。分子对接通过联系成分和作用靶点,建立其相互作用关系,广泛应用于药物发现与评价领域,是对“成分-靶点-疾病”网络预测结果的一种验证方式[5]。
白及五味子颗粒是由白及、黄芪、五味子和陈皮组成的具有保胃护肝双功能的中药类保健食品。本研究以白及五味子颗粒为例,从网络药理学的角度切入,筛选得到白及五味子颗粒功效成分和其保胃护肝核心靶点,并利用分子对接的方法进行验证,建立多成分含量测定方法。研究白及五味子颗粒中具有保胃护肝双功能的功效成分,探索中药类保健食品功效成分辨别和功能机制阐述的新途径,为白及五味子颗粒与中药类保健食品的质量控制提供思路。
1 材料与方法
1.1 仪器与资料
Acchorm S6000高效液相色谱仪,配备在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器,华谱科仪;BT25S十万分之一电子天平,北京赛多利斯科学仪器有限公司;KQ-250DE超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司。
TCMSP整合药理学数据库(http://www.tcmip.cn/TCMSP/index.php)、Genecards数据库(https://www.genecards.org/)、Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)、STRING 数据库(https://string-db.org/)、GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)、Cytoscape 3.8.2。
1.2 试剂与材料
白及五味子颗粒中所用药材白及(批号:201001)、黄芪(批号:190801)、五味子(批号:191001)和陈皮(批号:200901),均由禹州市凯旋药业有限公司提供。
橙皮苷对照品(批号110721-202019,质量分数≥98%)、五味子醇甲对照品(批号110857-201815,质量分数≥98%)、五味子甲素对照品(批号110764-201915,质量分数≥98%)、五味子乙素对照品(批号110765-201813,质量分数≥98%),中国食品药品检定研究院;川陈皮素对照品(批号AF20032911,质量分数≥98%)、芒柄花素对照品(批号AF20052952,质量分数≥98%),成都埃法生物科技有限公司。
乙腈为色谱级,美国Fisher Scientific公司;其余试剂均为分析纯。水(批号:20210820),杭州娃哈哈集团有限公司。
1.3 网络药理学分析
1.3.1 白及五味子颗粒目标成分和疾病作用靶点相关数据集的建立
以“gastric mucosa injury”和“liver disease”为关键词、实验以人源作为样本对胃黏膜损伤和肝损伤的条件在GEO数据库和Genecards数据库中对疾病作用靶点进行搜集。使用R进行数据处理获取正常组与患病组差异表达基因。对GEO和Genecards数据库的靶点信息取并集,去重后得到疾病基因靶点并建立肝损伤和胃黏膜损伤疾病作用靶点数据集。
利用中药系统药理学平台TCMSP数据库检索白及五味子颗粒中黄芪、白及、五味子和陈皮的成分,并将药动学参数中的口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥ 30%和类药性(drug-likeness, DL)≥ 0.18 作为筛选条件。数据集的建立还参考并查找国内外文献中记录的具有活性且未包含在数据库内的成分,得到符合条件的目标成分,形成白及五味子颗粒目标成分数据集。通过检索TCMSP数据库和Drugbank数据库对成分对应靶点进行注释,得到目标成分作用靶点数据集。
1.3.2 功效成分与共同作用靶点的获取
对疾病作用靶点及目标成分作用靶点信息进行韦恩图分析,取交集后,得到白及五味子颗粒发挥保胃护肝功效的共同作用靶点。利用PPI网络对上述靶点进行筛选,将其信息导入STRING数据库,设置物种为人(homo sapines),获取靶点蛋白的最高置信度>0.9的交互作用关系。根据STRING数据库获得蛋白互作关系,在Cytoscape 3.8.2 软件中构建靶点蛋白的交互作用(PPI)网络。使用“cytoHubba”和“CytoNCA”插件进行分析,并根据度值(Degree)、中介中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)等信息筛选核心靶点[6]。Degree值、BC值和CC值进行分析、排序。z-score计算如公式(1)所示:
(1)
式中:z,z-score值;xi,该蛋白的Degree值、BC值和CC值;μ,该项下所有数据的均值;σ,该项下所有数据的方差。
通过“成分-靶点-疾病”网络来获取白及五味子颗粒护胃保肝功效的功效成分,从而便于从潜在药效成分中更快速地确定功效成分。根据白及五味子颗粒中成分与其作用靶点的对应关系及String数据库中得到的共同作用靶点的PPI信息,将目标成分、核心靶点和疾病进行关联,构建白及五味子颗粒保胃护肝的“成分-靶点-疾病”网络。利用Cytoscape 3.8.2软件将以上网络进行可视化分析。通过CytoNCA插件对网络的Degree值、BC值和CC值进行分析。根据公式(1)选取可作为白及五味子颗粒保胃护肝功能的功效成分。
1.3.3 共同作用靶点的GO和KEGG富集分析
将1.3.2节中得到的共同作用靶点录入至GOplot包中进行GO和KEGG富集分析,预测白及五味子颗粒潜在的作用机制,用以指导其功效成分的选择。
1.4 分子对接验证
利用Discovery Studio 4.0软件(以下简称“DS 4.0”)构建核心靶点的分子对接模型,进而与白及五味子颗粒及保胃护肝功效成分和阳性药分子(水飞蓟宾、奥美拉唑)进行分子对接,分析对接结果并验证网络分析结果的可靠性。
在PDB数据库(http://www.rcsb.org)中下载“2.1.1.2”中获得的核心靶点的蛋白晶体结构。通过数据库获得成分结构信息。采用DS 4.0中Clean Protein工具对PDB中下载的蛋白进行预处理,根据PDB晶体的原配体的空间位置定义活性口袋,将Conformation Method参数设置为“BEST”,Docking Preferences参数设置为“High Quality”,其余参数为默认。将原配体抽出后重新对接到蛋白的活性口袋中,根据对接后的配体分子与原配体分子的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)大小判断对接程序参数设置的合理性以及对该晶体复合物的实用性,一般认为当RMSD≤2 Å时说明分子对接模型能够较好地重现原配体与蛋白的结合模式,对接结果有较高的可靠性。随后,将“2.1.1.3”中筛选得到功效成分及阳性药分子导入DS 4.0 中进行分子对接,计算对接打分值(-CDOCKER NERGY)。当-CDOCKER ENERGY值高于原配体时,可认为功效成分与核心靶点具有较高的结合活性,以此作为标准对分子对接结果进行评价,并与阳性药分子对比分析对接结果。选择与阳性药分子有对接结果的蛋白作为可能靶标与核心成分进行分子对接。
1.5 含量测定方法的建立
1.5.1 色谱条件
Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),以乙腈为流动相A,以0.2%甲酸水为流动相B,梯度洗脱程序:0～10 min 20%～28% A,10～12 min 28%～50% A,12～25 min 50%～75% A,25～40 min 75%～85% A,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长250 nm(检测芒柄花素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素)和283 nm(检测橙皮苷),进样量10 μL。
1.5.2 对照品溶液的制备
分别称取各对照品适量,精密称定,分别置于量瓶中配置成母液;分别精密等比吸取上述各母液,配置成橙皮苷、芒柄花素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的质量浓度分别为0.730、0.304、0.294、0.314、0.270、0.236 mg/mL的混合对照品溶液,摇匀、备用。
1.5.3 供试品溶液的制备
称取白及五味子颗粒约0.2 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇5 mL,称重后超声30 min(功率40 kHz,频率200 W),补重,过滤得续滤液。临用前过0.45 μm微孔滤膜,即得。
1.5.4 含量测定方法的建立及方法学考察
1)检测限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)。以3倍的信噪比(s/n=3)为检测限,10倍的信噪比(s/n=10)为定量限。
2)线性关系考察。精密量取混合对照品溶液,分别稀释一定倍数后,按设定的色谱条件进样测定,以质量浓度为横坐标(X),对照品的峰高为纵坐标(Y),绘制标准曲线,计算回归方程。
3)精密度试验。精密称取样品,进行供试品溶液的制备并连续进样6次,计算供试品溶液中的橙皮苷、川陈皮素、芒柄花素、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的峰高RSD。
4)重复性试验。精密称取样品6份,进行供试品溶液的制备并进行测定,计算供试品溶液中的橙皮苷、川陈皮素、芒柄花素、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的质量分数RSD。
5)稳定性试验。精密称取样品,进行供试品溶液的制备,分别在0、2、4、8、12、24 h进行测定,计算供试品溶液中橙皮苷、川陈皮素、芒柄花素、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的保留时间及峰面积的RSD结果。
6)加样回收率试验。取已知含量的同一批样品约0.1 g,精密称定6份,分别按已知指标成分含量的100%加入橙皮苷、芒柄花素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素混合对照品溶液,制备供试品溶液并进行测定,计算以上各成分平均加样回收率。
1.5.5 样品含量测定
依据设定的含量测定方法进行测定。
2 结果与分析
2.1 白及五味子颗粒保胃护肝功效成分与核心靶点
在GEO数据库中得到基因表达谱芯片GSE29279,GSE54129和GSE28619,分别筛选得到268、1 793和104个与肝损伤和胃黏膜损伤有关的差异基因,与Genecards数据库中搜集到的基因合并去重后得到胃黏膜损伤相关基因共3 666个,肝损伤相关基因共3 230个。通过TCMSP数据库对原料成分信息进行检索筛选,最终得到白及五味子颗粒中目标成分59个,去重后共得到146个目标对应靶点。
通过对疾病靶点及成分靶点信息进行韦恩图分析,共得到74个共同作用靶点,结果如图1-a所示。这些共同作用靶点可能是白及五味子颗粒发挥保胃护肝功效的作用靶点,用于后续进一步PPI分析。
a-白及五味子颗粒中目标成分靶点与胃黏膜损伤、肝损伤疾病作用靶点交集韦恩图;b-交集作用靶点PPI网络分析图;c-“药物-靶点-疾病”网络图
图1 网络药理学预测白及五味子颗粒中功效成分及核心靶点结果
Fig.1 The prediction of functional components and core targets in Baiji Wuweizi Granule based on network pharmacology
靶点互作关系结果如图1-b所示。其中颜色越红证明其度值相对越高,是核心靶点的可能性越大,颜色越黄表示其度值相对较低,是核心靶点的可能性也越小。靶点中Degree值大于中位数2倍的靶点作为白及五味子颗粒保胃护肝功效的主要靶点,其中选择BC值和CC值均大于中位数的节点蛋白作为白及五味子颗粒保胃护肝的核心靶点。共筛选得到11个核心靶点,结果如表1所示。
表1 白及五味子颗粒保胃护肝的核心靶点相关拓扑参数
Table 1 The topological parameters of core target of Baiji Wuweizi Granule with protection of gastric mucosa and liver injury
蛋白靶点名称度值(Degree)中介中心性(BC)接近中心性(CC)AKT154612.266 50.793 478JUN42260.522 70.682 243PTGS240148.417 90.675 926CASP340126.146 10.675 926MAPK838115.356 40.663 636CAT37304.936 60.669 725EGFR37192.524 40.669 725MAPK13671.802 30.646 018HSP90AA135149.746 40.651 786ESR135133.806 10.651 786MMP935194.452 60.640 351
根据公式(1)在“成分-靶点-疾病”网络中选择白及五味子颗粒保胃护肝功能的功效成分。z-score得分排名前20的潜在功效成分信息如表2所示,构建的“成分-靶点-疾病”网络图如图1-c所示。
表2 白及五味子颗粒中功效成分信息表
Table 2 The functional components in Baiji Wuweizi Granule
成分名称药味来源DegreeBetweennessClosenessz-scoreKaempferol黄芪34.00 4 022.89 0.36 9.83 Naringenin陈皮25.00 3 457.67 0.33 6.63 Nobiletin陈皮19.00 1 349.57 0.36 4.56 3,9-di-O-methylnissolin黄芪19.00 1 266.29 0.33 3.21 Schisandrin五味子13.00 283.90 0.37 2.81 7-O-methylisomucronulatol黄芪13.00 329.63 0.36 2.51 Gomisin J五味子6.00 71.17 0.36 1.30 Calycosin黄芪11.00 121.05 0.34 1.25 Formononetin黄芪16.00 686.90 0.31 1.24 Schisanhenol五味子9.00 117.14 0.33 0.66 Tangeretin陈皮14.00 956.56 0.29 0.58 Hederagenin陈皮5.00 466.44 0.34 0.57 1-(4-hydroxybenzyl)-4-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-2,7-diol白及12.00 372.53 0.31 0.49 Bifendate黄芪5.00 308.53 0.34 0.39 4,7-dihydroxy-1-p-hydroxybenzyl-2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene白及12.00 210.54 0.31 0.11 Arnebin 7五味子8.00 308.89 0.29 -0.76 Hesperidin陈皮6.00 139.44 0.30 -0.88 3,5,6,7,8,3′,4′-heptamethoxyflavone陈皮8.00 100.06 0.29 -1.00
在2.1节中的“成分-靶点-疾病”网络分析结果显示综合评分大于0的共有15个成分,得分排名前5位的成分分别为山奈酚、柚皮素、川陈皮素、3, 9-di-O-methylnissolin、五味子醇甲、7-O-methylisomucronulatol。白及五味子颗粒中原料白及、黄芪、五味子和陈皮中成分在上述15个成分中各占2、6、3和4个,主要原料白及排名靠前的成分少、排名较低。其中载于《中国药典》(2020年版)中的质量控制成分1, 4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine)未出现在排名中,可能是因现有研究多关注白及的多糖组分,少有关注其他组分,另其公共数据平台上相关参数表征不足且目前研究不够深入使得其用于筛选的吸收代谢特征值不符合要求[7]。综合来看,在15个成分中,山奈酚、芒柄花素、柚皮素、川陈皮素,以及五味子醇甲等成分的综合评分较为靠前,提示其作为功效成分的可能性高。
我国中药类保健食品质量控制标准提升中很大程度上借鉴了中药复方质量控制的思路和方法体系,即多成分整体质量控制,以保证产品的真实性。同时,多个功效成分的选择也应尽可能覆盖配方内原料中药,全面监控配方各原料。
山奈酚、柚皮素广泛地存在于药材中且功能多样,用于后续质控专属性不强,难以准确指征白及五味子颗粒的质量,因此不将其列入功效成分的候选[8-9]。芒柄花素和川陈皮素分别是黄芪、陈皮中主要活性化合物之一,具有较为明确的保胃护肝功能,在中药成方的质量控制中常作为指标成分[10-13],在“成分-靶点-疾病”网络图中的拓扑结构提示其对组方发挥功能的贡献较大。橙皮苷是最常用于监控陈皮质量的关键功效成分之一,虽然综合评分为负,但也在其中排在第17位,从网络拓扑结构分析的角度上评价与排名10位以后的成分对组方的贡献差距不大,因此一并列入质量控制考察范围内。五味子的主要特征活性成分类别之一是木脂素类成分。五味子醇甲是五味子中木脂素类含量最高的成分,属于五味子质量控制的关键活性成分,同时在网络分析结果中排名较为靠前,是可用来监控五味子质量的最理想选择成分。在含有五味子的保健食品和药品中,五味子甲素和五味子乙素常与五味子醇甲一同控制产品质量,共同监控五味子的木脂素类成分[14-15]。白及作为产品中的主要原料和名贵中药应在产品质量控制过程中重点关注,浸出物、多糖含量、Militarine含量和总酚含量等常被用于对白及的质量评价[16]。但浸出物和总酚用于质量控制专属性不强,Militarine对照品的价格昂贵,因此多糖含量是实际生产中最常见的质量控制指标。又限于研究手段和方法,难以将多糖含量与芒柄花素和五味子醇甲等成分共同列入网络分析和进行含量的共同测定,因此本文集中于讨论网络药理学分析的结果并对其建立含量测定方法用于质量控制,对产品内多糖的含量测定与功能评价将在未来的研究工作中进行。
综上,选择黄芪的芒柄花素,来自五味子的五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素,以及来自陈皮的橙皮苷和川陈皮素共同作为后续白及五味子颗粒的功效成分。
2.2 白及五味子颗粒保胃护肝作用机制的预测
对白及五味子颗粒的原料药和疾病的74个共同作用靶点进行GO富集分析,体内生物学过程(biological progress,BP),细胞组分(celluar component,CC),分子功能(molecular function,MF)的条目数分别为1 294条、57条和119条。结果显示,交集靶点多与对营养水平的反应,对化学应激的反应,类固醇代谢过程,对酒精的反应,对氧化过程的反应等相关。CC主要参与膜筏、细胞膜质微区等定位。MF主要涉及核受体的活动、配体激活的转录因子活性、类固醇激素受体活性等。各项排名前10位的GO富集结果如图2-a所示。KEGG分析得到共131条通路,涉及脂质和动脉粥样硬化、IL-17信号通路等多个关于胃黏膜损伤及化学性肝损伤治疗机制中常见的脂质代谢、氧化应激和炎症反应的通路。排名前10的KEGG富集结果如图2-b所示。GO和KEGG富集结果显示,白及五味子颗粒发挥保胃护肝效果的作用机制复杂多样,多靶点、多通路的分析结果也提示其功能作用的特点。
a-GO功能富集分析结果(BP,MF,CC的前10条生物过程);b-前20条KEGG通路富集分析
图2 白及五味子颗粒GO功能和KEGG通路富集结果
Fig.2 Results of GO and KEGG enrichment of Baiji Wuweizi Granule
2.3 分子对接验证功效成分与核心靶点结合能力
分子对接是通过结构特征来预测成分与目标蛋白结合能力与非键相互作用的一种辅助发现潜在活性成分的一种手段[5]。白及五味子颗粒中活性靶点信息如表3所示,对接结果评分如表4所示。结果显示,6个成分均可与AKT1、JUN、PTGS2、EGFR有结合活性,仅橙皮苷与HSP90A1对接失败,可能是由于分子对接选择的对接模式不适合或者橙皮苷本身就与HSP90A1没有结合活性。但考虑到HSP90A1在筛选出的蛋白中相对而言重要程度并没有另几项高,配方实际通过该靶点发挥保胃护肝功能的可能性有限,因此选择保留橙皮苷作为功效成分。结果还提示,多数成分与靶点的对接都有通过Arg216进行的,说明功效成分与核心靶点的结合能力与是否存在疏水氨基酸有较强关联关系,同时,疏水氨基酸的数量与位置也一定程度上影响了结合效果[17]。Tyr147也是出现频率较高的一个氨基酸,与成分之间也形成了氢键,加强了成分与靶点之间的结合强度[18]。
表3 靶点活性口袋信息及计算结果
Table 3 Information of target activity pocket and calculation results
靶点PDB ID活性口袋半径/Å活性口袋坐标RMSD/Å原配体打分值AKT11UNQ9.6015.305 354, 24.702 586, 15.942 4731.132 5181.061JUN5FV813.0827.266 777, -2.813 462, 17.883 5601.761 919.225 9PTGS25F1911.5043.509 406, 34.899 233, 42.860 1141.622 24.182 08EGFR5UG910.30-13.813 496, 15.013 834, -26.626 8340.970 928.079HSP90A13B274.0010.401 615, 2.343 485, 13.533 7051.100 626.597 4
表4 功效成分与核心靶点对接的评分结果
Table 4 The score of the docking between functional component and core target
化合物对接分数英文名称中文名称AKT1JUNPTGS2EGFRHSP90A1Hesperidin橙皮苷55.051 235.813 735.740 259.055 6-Schisandrin五味子醇甲38.234 924.308 626.730 543.877 756.771 6Deoxyschizandrin五味子甲素38.097 722.662 724.610 639.690 547.479 9Schisandrin B五味子乙素37.194 523.055 023.842 843.222 542.948 2Nobiletin川陈皮素36.233 925.322 030.744 244.56245.521 2Formononetin芒柄花素30.114 922.182 321.318 934.187 837.467 8
注：“-”表示该成分与该蛋白对接失败,该项下评分缺失
2.4 白及五味子颗粒中保胃护肝功效成分的含量测定
6种成分线性关系、LOD与LOQ如表5所示。
表5 6种成分含量测定的回归方程、线性范围、检测限及定量限和加样回收率总结
Table 5 Summary of linear-regression data, LODs, LOQs and recovery for six components
成分名称回归方程线性范围/(μg·mL-1)rLOQ/(μg·mL-1)LOD/(μg·mL-1)加样回收率/%橙皮苷Y=16 134X+87 16924.33～730 0.999 120.857 17.300 099.57芒柄花素Y=58 569X+182 3457.60～304 0.999 43.040 00.675 6101.39川陈皮素Y=25 619X+34 8217.35～147 0.997 45.653 82.940 0103.18五味子醇甲Y=18 012X-31 15610.467～157 0.999 910.466 73.925 092.18五味子甲素Y=3 736.9X+10 82813.5～225 0.999 113.500 02.842 192.69五味子乙素Y=2 890.7X-5 221.839.33～19 6670.996 218.153 82.950 0103.94
测得功效成分橙皮苷、芒柄花素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面积RSD分别为0.19%、2.47%、0.69%、0.22%、1.36%、1.46%,仪器精密度良好。6种成分在样品中的含量RSD分别为2.26%、2.83%、2.32%、2.1%、2.61%、2.31%,结果表明实验方法重复性良好。6种成分的峰面积RSD分别为2.58%、1.83%、2.82%、2.02%、1.90%、1.05%,结果表明实验方法稳定性良好。加样回收率在92.18%～103.94%,回收率良好,说明实验方法准确率高。
2.4.2 样品测定
取3批白及五味子颗粒样品,制备供试品溶液进行峰面积的测定,计算6个功效成分的含量并计算均值。其中橙皮苷、芒柄花素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量分别为2.306 4、0.086 06、0.220 3、1.390 3、0.077 5、0.124 3 mg/g。含量测定色谱图如图3所示。
a-6个成分混合标准品(250 nm);b-白及五味子颗粒供试品(250 nm);c-黄芪药材供试品(250 nm);d-五味子药材供试品(250 nm);e-6个成分混合标准品(283 nm);f-白及五味子颗粒供试品(283 nm);g-陈皮药材供试品(283 nm) 1-橙皮苷;2-芒柄花素;3-川陈皮素;4-五味子醇甲;5-五味子甲素;6-五味子乙素
图3 白及五味子颗粒6个功能性成分含量测定HPLC图
Fig.3 HPLC figure of content determination of six functional components of the Baiji Wuweizi Granule
3 讨论
保胃护肝可分别对应保健食品中的对化学性肝损伤有辅助保护作用和辅助保护胃黏膜功能。化学性肝损伤和胃黏膜损伤的发病机制均可与炎症反应、脂质代谢紊乱、氧化应激等过程有关[19]。白及是一种重要的药食同源类中药,可通过抗炎、抗氧化等作用来预防和治疗胃黏膜损伤,同时也有研究显示白及可通过降脂来治疗肝脏损伤[20-22]。基于此,课题组前期以白及为核心原料,组成以白及、黄芪、陈皮、五味子为原料的保胃护肝双功能保健食品配方,即白及五味子颗粒的主要原料配方[23]。白及五味子颗粒中白及、黄芪、陈皮、五味子的药材或其中的成分均被证实对这些通路有影响作用,一定程度上缓解肝胃损伤,体现了中药多成分、多靶点、多通路的作用特点,初步证明筛选得到的白及五味子颗粒的功能有效性,并通过分子对接对筛选得到的功效成分的功能性做配体-受体层面的验证。利用HPLC建立的多成分含量测定方法也为后续白及五味子颗粒在生产中的质量控制提供参考依据。
本研究采取了现有中药成分数据库辅以文献补充的方法建立组方成分库。对已有报道的成分尽可能地纳入考察范围进行分析。通过“成分-靶点-疾病”网络对功效成分进行辨别的过程中,参考网络特征参数进行综合分析,全方位考察潜在功效成分节点对疾病的重要程度,筛选功效成分,确定可用于质量控制的成分。虽然利用现有成分数据库极大地方便了筛选工作,但依旧局限于发表文献的数据更新延迟或成分结构、性质研究不充分等情况,导致黄芪多糖和白及多糖等一系列功能成分无法直接通过数据筛选被纳入至网络药理学分析评价中[24-27]。同时,也有类似白及中Militarine的成分,虽然专属性强可用于质量控制,但对照品价格昂贵,不宜用于实际生产中。因此,本文在每一步研究工作中基本都会从现有文献中再挖掘补充自建成分库以求分析结果可靠,同时对于多糖等难以用网络药理学和分子对接的方法进行研究的功能成分而言,将直接采用含量测定等方法对其进行研究,从而整体、全面、经济地评价产品质量。
综上所述,本研究在借鉴中药质量控制方法和研究思路的基础上,使用网络药理学和分子对接的技术手段,成功筛选了白及五味子颗粒中具有保胃护肝功能的功效成分并预测功能作用机制,建立了筛选中药复方的综合评价方法,为中药类保健食品中功效成分的选定提供新的思路,为其质量控制奠定基础。
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