牡蛎别名海蛎、蛎蛤、牡蛤、蛎子、蚝等,是世界上第一大养殖贝类[1]。我国是牡蛎生产大国,2020年广西牡蛎66.2万t,占广西贝类总产量的62.8%,占全国牡蛎总产量的8.06%[2]。牡蛎味鲜美,富含蛋白质,是制备活性肽的良好原料。酶解技术具有反应条件温和、安全可控、选择性高等优点,已成为活性肽制备的重要技术手段[3]。牡蛎酶解液具有抗氧化、抗肿瘤和降血压等生理活性,牡蛎活性肽的制备与生产已然成为国内外研究的热点[4]。但牡蛎固有的腥味及酶解过程中产生的异味严重阻碍了其在食品加工领域中的应用[5]。
高温酶解过程中的脂肪氧化生成了醛类、酮类、醇类等挥发性风味物质,是导致酶解后牡蛎海腥味及哈喇味的主要原因[6-7]。目前针对酶解液风味改善研究主要集中于酶解后处理,如在酶解液中添加姜汁掩蔽[8]、酵母发酵、活性炭吸附[9]或加入还原糖进行美拉德反应[10]。但这些方法或导致营养物质的损失,或影响酶解液的生理活性,或产生一些有害物质。因此,研究一种安全有效的异味去除方法,消除牡蛎酶解液异味,生产兼具营养、生理活性与美味的牡蛎制品成为牡蛎加工亟待解决的问题。
茶多酚又称茶单宁或茶鞣质,是从茶叶中提取的天然小分子多酚类物质,是儿茶素、黄酮、花青素和酚酸等多酚类物质的总称,具有抗氧化、防腐保鲜、抑菌除臭及抗衰老等多种生理活性,在食品工业中具有良好的前景。据报道,添加1%～2%的绿茶提取物可以减少碎牛肉中的脂肪氧化[11],0.3 g/kg的茶多酚可有效降低腊肉过氧化值、硫代巴比妥酸反应物值,从而改善肉制品的色泽和风味[12]。
前期研究发现,牡蛎酶解液具有较好的抗氧化作用[13],但其本身的异味严重影响了产品的推广与应用。基于此,本研究在探讨牡蛎酶解过程中风味变化的基础上,探索茶多酚对牡蛎酶解液风味的改善作用,运用感官评价法、电子鼻技术及GC-MS技术探讨不同处理方法对牡蛎酶解液的制备效率、感官风味及其中主要风味成分的影响,旨在寻求一种安全、经济、有效改善牡蛎酶解液风味的方法,从而为推动牡蛎深加工利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜香港牡蛎于2021年10月购于钦州市东风市场,并用破碎匀浆机搅碎,得到的牡蛎匀浆放于-18 ℃冰箱冷冻备用;茚三酮、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、甘氨酸、牛血清白蛋白、NaOH、CuSO4、无水乙醇等试剂均为分析纯,上海国药制药集团;茶多酚(食品级),安徽红星药业股份有限公司;碱性蛋白酶(活力8 000 U/g),广西庞博生物科技有限公司。
GJJ-05/25高压均质机,诺尼轻工机械(上海)有限公司;840-210800紫外分光光度计,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;HT-110X30水浴恒温振荡器,金坛区金城春兰实验仪器厂;PEN3电子鼻,德国AIRSENSE公司;7890B GC System,美国安捷伦科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 牡蛎酶解液的制备
牡蛎酶解液的制备参考ZHANG等[13]的方法操作,具体如下:取牡蛎肉匀浆100 g,调节pH至8.0,加入质量分数1%的碱性蛋白酶,于50 ℃水浴恒温振荡锅中酶解,100 ℃水浴灭酶10 min。冷却至室温后,使用高速离心机5 000 r/min 离心 10 min,取上清液即为牡蛎酶解液,密封,于-18 ℃冰箱中保存备用。
1.2.2 茶多酚处理方式对酶解液风味的影响
为考察茶多酚添加时机对酶解液风味的影响,分别在酶解前或酶解后添加同等剂量的茶多酚,制备酶解液,同时制备牡蛎酶解液对照组。具体操作如下:
茶多酚预处理牡蛎酶解液组(oyster enzymatic hydrolysates with tea polyphenols pretreatment,OEH-TP-P)的制备:于新鲜牡蛎肉匀浆中加入匀浆质量0.2%的茶多酚,参照1.2.1,加入碱性蛋白酶酶解4 h,制备酶解液,于4 ℃冰箱保存备用。
茶多酚后处理牡蛎酶解液组(oyster enzymatic hydrolysates with tea polyphenols after treatment,OEH-TP-A)的制备:另取同等质量的新鲜牡蛎肉匀浆,参照1.2.1制备酶解液,于牡蛎肉酶解液中加入匀浆质量0.2%的茶多酚,摇匀,于4 ℃静置4 h,保存备用。
牡蛎酶解液对照组(oyster enzymatic hydrolysates,OEH)的制备:再取等质量的新鲜牡蛎肉匀浆,参照1.2.1制备酶解液,记为OEH。
1.2.3 茶多酚添加量对牡蛎酶解液风味的影响
在常温条件下,于新鲜牡蛎肉匀浆中放入0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%(质量分数)的茶多酚;然后参照1.2.1酶解4 h,灭酶,冷却,离心得到酶解液,于4 ℃冰箱中保存备用。
1.2.4 水解度的测定
采用茚三酮法测定水解度[14]。取0.5 mL待测样品,加入蒸馏水补足至2.0 mL,加入茚三酮试剂1.0 mL,立即摇匀,沸水浴15 min,冷却至室温,然后加入5.0 mL 40%乙醇,摇匀后,立刻于570 nm处测定吸光度值,使用蒸馏水为空白参比。采用甘氨酸制作标准工作曲线。水解度计算如公式(1)所示:
(1)
式中:Ch,酶解液中的氨基含量,μmol/L;Cm,原料蛋白质中游离氨基的含量,mmol/g;N,酶解液蛋白含量,mg/mL;6.25,蛋白换算系数;牡蛎的htot=7.94 mmol/g[15]。
1.2.5 感官评定
由10名经过系统培训、具备一定感官经验的感官评定员组成评定小组,参照表1进行感官评定。提前打印好感官评定表格,根据牡蛎酶解液色泽、澄清度、鲜味、腥味和苦涩味特征进行评价。
表1 感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation criteria
项目标准色泽(5分)无色或浅黄淡黄色黄色黄色较深深黄色澄清度(5分)澄清较澄清浑浊较浑浊十分浑浊鲜味(5分)突出较突出一般较淡无鲜味腥味(5分)几乎无较淡明显较重重苦涩味(5分)几乎无较淡明显较重重合计(25分)21～2516～2011～156～101～5
1.2.6 电子鼻分析
取10 mL酶解液于50 mL顶空瓶中,密封,在50 ℃水浴锅中加热10 min后采用顶空吸气法进行电子鼻检测分析。电子鼻分析参数设置为:采样时间间隔为1 s/组,传感器自动清洗时间为100 s,样品测试分析时间为100 s,进样流量400 mL/min。取80～89 s的10秒数据,采用电子鼻自带的WinMuster软件完成主成分分析(principal component analysis,PCA)。
1.2.7 挥发性风味物质的测定
参考BALCERZAK等[16]的方法,采用气质联用仪分析挥发性风味成分,并作修改。准确量取6 mL样品,放入20 mL顶空瓶中,密封后置于50 ℃水浴锅中加热平衡10 min,再插入经260 ℃老化处理30 min的50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头吸附30 min后,迅速将萃取头插入GC-MS中,解析5 min后取出,样品重复两次。
色谱条件:色谱柱为Agilent 122-5532UIHP-INNOWAX(60 m×250 μm,0.25 μm),不分流进样,进样口温度为250 ℃。柱温:初温40 ℃恒温3 min,6 ℃/min升至250 ℃,再以10 ℃/min升至250 ℃,该温度下保持10 min。
质谱条件:电离源为EI,电子能量为70 eV,离子阱温度为150 ℃,GC-MS传输线温度为250 ℃。
1.2.8 牡蛎酶解液挥发性成分相对气味活度值(relative odor activity value,ROAV)分析方法
为更全面地分析牡蛎风味化合物组成变化,采用刘登勇等[17]提出的 ROAV法对添加茶多酚前后的牡蛎酶解液关键性风味化合物进行分析。计算如公式(2)所示:
(2)
式中:Cri,各化合物的相对浓度;Ti,各化合物的的感觉阈值;Cmax,对总体风味贡献最大的组分的相对浓度;Tmax,对总体风味贡献最大的组分的感觉阈值。
1.3 数据分析与处理
所有待测样品均进行3次平行试验。采用Origin软件对数据进行分析处理以及图表的制作;采用SPSS 17.0软件对数据进行误差与显著性分析。
2 结果与分析
2.1 牡蛎酶解过程中的风味变化
图1显示,酶解后,牡蛎风味发生了很大的变化,感官评分总体呈现显著下降的趋势(P<0.05),这与张洁等[10]的研究结果相一致。牡蛎含有不饱和脂肪酸,在酶解过程中易发生氧化与酸败,产生多种挥发性物质,从而增加了其哈喇味和腥味,这是造成酶解液风味变化的重要原因[5]。在2～8 h酶解过程中,酶解液的感官评分呈现先上升后下降的趋势,在4 h时达到最大值(12分),但仍显著低于酶解前(13分)(P<0.05)。由此可见,酶解处理会使得牡蛎的风味变差,这严重限制了其推广应用。
a-感官评分;b-雷达图
图1 酶解时间对牡蛎酶解液风味的影响
Fig.1 Enzymatic hydrolysis time on the flavor of oyster hydrolysates
注:标注不同符号者之间存在显著性差异(P<0.05),下同。
2.2 茶多酚对牡蛎风味及水解度的影响
2.2.1 茶多酚处理方式对牡蛎风味的影响
图2显示,酶解前加入茶多酚,可显著提升牡蛎酶解液的感官品质(P<0.05),而酶解后添加对酶解液的风味无显著影响(P>0.05)(图2-a)。
a-感官评分;b-雷达图
图2 茶多酚处理方式对牡蛎酶解液风味的影响
Fig.2 Effect of tea polyphenol treatment on the flavor of oyster hydrolysates
牡蛎富含不饱和脂肪酸,在酶解过程中易发生酶促氧化或自动氧化分解成许多挥发性的小分子醛、酮、酸等,而这些次级氧化产物的形成是致使酶解液的腥味和哈喇味加重的主要原因[6]。茶多酚作为天然的抗氧化成分,可以有效抑制脂肪氧化,目前在食品保藏及风味改善方面具有良好的应用。如干贝表面添加茶多酚,可有效延长干贝的氧化诱导时间,降低不饱和脂肪酸的含量损失,提升干贝的氧化稳定性[18]。另外,茶多酚本身的茶香味可以掩盖酶解液的腥味和异味[12]。图2-b显示,酶解前添加茶多酚可以增强牡蛎酶解液的色泽、提升鲜味、减弱不良气味,从而有效提升产品的感官品质。因此,本研究选择酶解前添加茶多酚的处理方式作进一步分析。
2.2.2 茶多酚添加量对牡蛎风味及水解效果的影响
随着茶多酚添加量的增加,牡蛎酶解液的感官评分呈现先上升后下降的趋势,如图3所示。
a-感官评分和水解度;b-雷达图
图3 茶多酚添加量对牡蛎酶解液风味及水解度的影响
Fig.3 Effects of tea polyphenols dosage on the flavor and hydrolysis degree of oyster hydrolysates
当茶多酚添加量为0.4%时,感官评分最高(17.5分),此时牡蛎酶解液呈淡黄色,鲜味突出,腥味和苦涩味较淡,具有浓郁的牡蛎特征性香气、无异味、澄清度高。茶多酚是茶叶香气和色泽的主要来源,其中儿茶素类化合物约占75%,是茶多酚的主体成分,具有明显的苦涩味[11]。添加量过高,酚类物质呈现的涩味和茶香味掩盖了牡蛎特有的香味,色泽会略微变深,从而导致感官变差。另外,作为反映蛋白酶解程度的重要指标,水解度与酶解液的风味、生理活性密切相关。图3-a显示茶多酚的添加对牡蛎酶解液中氨基态氮的释放无显著影响(P>0.05)。类似的,30 mg/kg茶多酚的添加未影响罗非鱼下脚料的酶解效果,且有效抑制了脂肪氧化,改善了酶解液风味[19]。综上所述,酶解前添加茶多酚可以显著改善牡蛎酶解液的风味(P<0.05),且不会改变酶解效率,其最佳添加量为0.4%。
2.3 茶多酚处理对牡蛎风味电子鼻图谱的影响
于酶解前添加0.4%的茶多酚,水解4 h,所得酶解液记为茶多酚处理组牡蛎酶解液(oyster enzymatic hydrolysates with tea polyphenolstreatment,OEH-TP)。图4显示,PCA分析中2个主成分的方差贡献率总和为98.76%,其中主成分1的贡献率为95.64%,远大于主成分2,表明2组牡蛎酶解液的差异主要在主成分1,2组风味数据无交叉,说明2个样品风味差异显著,即茶多酚对牡蛎酶解液的风味成分产生了影响。这与图2结果一致。
图4 两组牡蛎酶解液PCA结果
Fig.4 PCA plot of two groups of oyster hydrolysates
2.4 茶多酚对牡蛎酶解液风味成分的影响
表2显示,在两组样品中共鉴定出41种挥发性物质,只有13种物质在两组样品中均被检出。与OEH相比,OEH-TP的挥发性风味成分组成及相对含量都发生了较大的变化,说明茶多酚的添加对牡蛎酶解液风味产生了显著的影响。
表2 牡蛎酶解液样品中的挥发性风味物质分析
Table 2 Analysis of volatile flavor substances in oyster hydrolysates
序号化合物名称保留时间/min相对含量/%OEHOEH-TP气味特征描述[6, 21-22]1三甲胺5.16 -4.58 腥臭味2二甲基硫醚6.42 7.51 14.83 刺激的洋葱和大蒜味3丙酮7.23 0.69 -果香42-甲基丁醛8.96 -4.65 呈咖啡和可可香气,微带甜水果和巧克力似风味5异戊醛9.05 -7.71 苹果香的刺鼻气味6苯9.65 -1.16 72-乙基呋喃9.92 1.32 -豆香、焦香8甲苯12.15 0.20 0.54 芳香气味9二甲基二硫醚13.00 0.26 -强烈的洋葱味10己醛13.13 0.61 -草香、果香116,6-二甲基庚-2,4-二烯13.42 -0.76 -121,3-顺式,5-顺式-辛三烯13.55 3.12 --13庚醛15.85 3.81 -油脂味、鱼腥味143-甲基-2-丁烯醛16.33 1.01 -咖啡香152-乙基苯酚16.71 0.22 --16(E)-2-己烯醛16.81 0.39 -青草味17(Z)-4-庚烯醛17.33 7.23 -草香、脂肪香183-辛酮17.61 3.57 8.90 树脂清香19辛醛18.49 5.13 -青草味、哈喇味20(E)-2-(2-戊烯基)呋喃18.76 0.62 -焦香213-庚烯-2-酮18.81 -0.88 强烈尖刺青草气味22(Z)-2-戊烯-1-醇19.02 0.03 2.23 -23(E)-3-己烯-1-醇20.62 1.71 2.92 -243-辛醇20.68 0.21 -呈强烈油脂、果仁和草药香味252-壬酮20.86 0.51 0.54 果香、脂香、奶香26壬醛20.99 1.53 -鱼腥味、哈喇味271-辛烯-3-醇21.98 15.79 -土腥味283-甲硫基丙醛22.53 3.51 0.90 极其恶臭的和持久的气味292-(5-甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-基)丙-2-基碳酸乙酯22.72 -0.73 茶香味30苯甲醛24.17 5.05 3.88 杏仁香、樱桃及坚果香311-辛醇24.28 -0.54 强烈的油脂气息,并带有柑橘和玫瑰气味32(E,Z)-2,6-壬二烯醛25.30 1.78 -脂肪、坚果、紫罗兰、瓜果香332-十一烷酮25.40 0.95 1.20 果香34(Z)-2-辛烯-1-醇25.52 -8.17 清香、甜瓜香35苯乙醛26.59 1.24 6.77 果香36环辛二烯26.91 14.17 21.97 -37(E,Z)-3,6-壬二烯-1-醇28.24 0.99 --38水杨酸甲酯29.25 1.75 1.63 冬青味39苯甲醇30.72 -0.70 -404-甲基苯酚33.79 3.68 3.80 芳香气味41苯甲酸39.14 11.43 --
注：“-”表示未检测到。
研究普遍认为醛类、醚类、醇类、酯类和酮类的相对阈值较低,对风味的贡献较大[20]。两组样品中这4类成分组成差异较大,如表2所示。OEH中含量最高的物质为醛类31.29%,添加茶多酚后降低至23.90%。牡蛎酶解液中的醛类物质多通过脂肪氧化快速形成,阈值较低,痕量存在时即可影响总体风味,与OEH的鱼腥味、草腥味密切相关[21]。与OEH相比,OEH-TP中呈恶臭味的3-甲硫基丙醛和呈现杏仁香味的苯甲醛含量分别由3.51%和5.05%降低至0.90%和3.88%;OEH中的不愉快气味物质如己醛、庚醛、3-甲基-2-丁烯醛、(E)-2-己烯醛、(Z)-4-庚烯醛、辛醛、壬醛,在OEH-TP中未被检出;这与茶多酚的抗氧化作用不无关系。茶多酚可以通过羟基提供活泼的氢生成更稳定的酚醛自由基来清除活性氧和自由基,有效抑制脂质氧化初级产物氢过氧化物的生成,从而减少醛、酮、醇等各种次级氧化物产物的产生[18]。另外,添加茶多酚后,酶解液中呈现果香味的苯乙醛由1.24%增加至6.77%;同时,在OEH-TP中出现了两种新的醛类物质:呈现咖啡香味的2-甲基丁醛(4.65%)和呈现苹果香味的异戊醛(7.71%)。异戊醛和苯乙醛成为OEH-TP含量最大的两种醛类物质,从而使得酶解液果香味更加突出。
醚类物质多与酶解液的不愉快气味相关,如二甲基硫醚具有刺激的洋葱大蒜味,是海产品腐败的产物,也是其腥臭味的主要来源。OEH中有二甲基硫醚和二甲基二硫醚两种醚类,OEH-TP中仅检测出二甲基硫醚,相对含量增加至14.83%。类似的,添加姜汁后的牡蛎酶解液中二甲基硫醚含量增加了30.33%。这可能是OEH-TP仍具有一定腥臭味的原因。
醇类物质在OEH中的含量仅次于醛类。加入茶多酚后,酶解液中醇的种类和含量都发生了较大的变化。OEH中含量最大的1-辛烯-3-醇(15.79%),作为花生四烯酸的氧化产物,是水产品土腥味的主要来源[20],在OEH-TP中未检测到;另外,从OEH-TP中检测到呈现柑橘和玫瑰味的1-辛醇和呈现清香、甜瓜香的(Z)-2-辛烯-1-醇。
水产品酶解液中的酮类物质来自不饱和脂肪酸的热氧化降解、微生物的发酵作用以及氨基酸分解作用[8]。酮类物质多具有使人愉快的香味,如果香、青草香味。与OEH相比,OEH-TP中除了呈现辛辣气味的丙酮未检测到,其余酮类物质都有了不同程度的增加,整体酮类含量增加至11.52%。
此外,添加茶多酚后,酶解液中未检测出呋喃类物质和苯甲酸,检测到具有茶香味的酯类物质乙基-2-(5-甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-烯)丙基-2-烯碳酸酯,这种酯类来源于茶多酚。
2.5 茶多酚对牡蛎酶解液关键风味化合物成分的影响
某种挥发性化合物对于样品总体风味的贡献不仅与其浓度有关,还与其阈值密不可分。由表3可知,OEH中的关键风味化合物(ROAV≥1)有8种,同时有6种化合物对总体风味起到修饰作用(0.1≤ROAV<1)。其中,关键风味化合物中,二甲基硫醚、1-辛烯-3-醇、辛醛、壬醛和庚醛具有腥臭味、哈喇味,(Z)-4-庚烯醛、2-乙基呋喃和苯乙醛具有一定的草香、果香味,从而使得牡蛎酶解液同时具有浓郁的腥味和一定的清香味,这与感官评定结果一致。
表3 牡蛎酶解液中关键风味化合物分析
Table 3 Analysis of key flavor compounds of the oyster hydrolysates
OEH香气成分气味阈值[6, 21]/(μg·kg-1)ROAVOEH-TP香气成分气味阈值[6, 21]/(μg·kg-1)ROAV关键风味化合物二甲基硫醚0.3100.00 三甲胺24.63 2-乙基呋喃22.63 二甲基硫醚0.3100.00 庚醛35.07 2-甲基丁醛19.40 (Z)-4-庚烯醛0.836.09 异戊醛0.438.97 辛醛0.729.25 苯乙醛43.42 壬醛16.10 1-辛烯-3-醇163.08 苯乙醛41.24 修饰风味化合物己醛4.50.55 3-辛酮380.47 (E)-2-己烯醛170.09 苯甲醛3500.02 3-辛酮380.37 (Z)-2-辛烯-1-醇400.41 (E)-2-(2-戊烯基)呋喃60.41 水杨酸甲酯400.08 2-壬酮2000.01 苯甲醛3500.06 潜在风味化合物丙酮500 000<0.01苯3 630<0.01甲苯1 550<0.01甲苯1 550<0.013-辛醇110<0.012-壬酮200<0.011-辛醇125.8<0.01
与OEH不同,OEH-TP中的关键风味化合物有5种,同时4种化合物对总体风味起到修饰作用。虽然,三甲胺和二甲硫醚这两种不愉快气味仍是酶解液的主体风味成分,但其余的关键风味化合物都呈现脂肪香味和果香味,从而使得酶解液具有腥味的同时,具有突出的脂肪香味和果香味。
以上结果表明,茶多酚改变了牡蛎酶解液中关键性风味化合物的组成及修饰风味化合物的组成及各个组分的贡献值。结合表2可知,茶多酚从整体上减弱了酶解液中呈现腥臭味的风味化合物的种类和含量,增加了香气成分的相对含量,从而实现改善酶解液风味的效果。
3 结论
酶解会引起牡蛎风味劣化,酶解前添加茶多酚可显著改善牡蛎酶解液的感官品质,同时不影响酶解效率;茶多酚预处理可改变酶解液中挥发性成分的组成与相对含量以及关键风味化合物和修饰风味化合物的组成;酶解液中腥臭味物质的减少和香味物质的增加是茶多酚添加后牡蛎酶解液风味改善的主要原因。本研究为水产品酶解液风味的改善及活性肽产品的推广应用提供了理论参考。
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