我国是斑点叉尾鮰(Ietalurus punetaus)养殖大国,2020年产量达到30.85万t。与鲤鱼、鳙鱼、鲢鱼、青鱼等几种常见淡水鱼相比,斑点叉尾鮰因脂肪含量相对较高,没有肌间刺,食用方便且味道鲜美而深受消费者喜爱[1]。近年来,随着国内市场的有效开发,鮰鱼主要以内销为主,70%的鮰鱼以烤鱼、冷冻调理产品、水煮鱼片等形式在餐饮渠道被消费,且近年保持着持续增长的态势。目前,国内外关于鮰鱼加工的研究主要还是集中在冷冻鮰鱼片、鮰鱼休闲食品开发、副产物的综合利用等方面[2-4]。相关研究主要集中在产品感官、质构、风味特性的变化等方面。

近年来,随着我国经济水平的不断提高,国家提出了《“健康中国2030”规划纲要》,同时消费者对食品的关注点除了“吃得好”以外,还要“吃得健康”。抗氧化一直是人们重点关注的话题,而直接从膳食来源获取抗氧化物质也正成为消费者追求的方向[5]。研究表明,很多动物组织(如牛肉、鸡肉和鱼肉等)食用后具有显著的抗氧化活性,其中鱼肉的抗氧化活性更强[6]。已有研究通过模拟体外消化模型对草鱼肉以及休闲鱼肉粒消化产物的抗氧化活性进行了研究[7-8],表现出较好的体外抗氧化活性,但关于鮰鱼尚未见相关研究报道。

因此,本研究以斑点叉尾鮰为原料,比较常见的热加工方式(蒸、煮、烤)对鮰鱼肉体外消化产物抗氧化活性的影响,并对消化产物进行肽的分子质量测定和游离氨基酸分析,探索鮰鱼肉在胃、肠道环境下的抗氧化活性变化机理,从而为开发更具健康消费属性的鮰鱼产品及加工(热加工)方式提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

鲜活斑点叉尾鮰鱼,质量(1.5±0.2) kg,购于无锡欧尚超市雪浪店。

胃蛋白酶(3 000 U/mg)、胰蛋白酶(2 500 U/mg,生化试剂)、菲洛嗪-钠盐、ABTS、DPPH,均为分析纯,上海源叶生物科技有限公司;丝氨酸、细胞色素C、抑肽酶、杆菌肽、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT),美国Sigma公司;还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH),上海百灵威化学技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

THZ-82型恒温振摇水浴锅、ZBRTD-211型恒温水浴锅,上海力辰邦西仪器科技有限公司;4K-15型冷冻离心机,德国Sigma公司;高效液相色谱仪,美国Waters公司;G2000SWXL凝胶色谱柱(7.8 mm×300 mm),美国Thermo Fisher Scientific公司;AS887型温度探头,香港Smart Sensor公司;SCIENTZ 10-ND型冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;UV-1800型紫外分光光度计,上海天美科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鱼肉样品制备

鲜活鮰鱼经现场宰杀后于30 min内运送至实验室。鮰鱼去头、尾、内脏和皮后取背部肉,切成3 cm×1.5 cm×1.5 cm块状。随即将所有样品分成4组,具体如下:

对照组:生肉;

水煮组:未经包装的鱼肉样品置于(72.0±0.2) ℃的恒温水浴锅中,煮至中心温度(70.0±0.2) ℃,迅速置于冰水中冷却至室温;

蒸制组:待蒸锅中的水持续沸腾1 min后,放入鱼肉样品蒸至中心温度(70.0±0.2) ℃,迅速置于冰水中冷却至室温;

烤制组:将鱼肉样品置于烤箱中(上火200 ℃,下火180 ℃,预热20 min)烤至中心温度(70.0±0.2) ℃,迅速置于冰水中冷却至室温。

1.3.2 体外模拟消化

参考MINEKUS等[9]的方法进行模拟体外消化。将5 g鱼肉和5 g水置于绞肉机中高速搅打10 s,以模拟口腔咀嚼,然后全部转移至锥形瓶中,与模拟胃消化液1∶1(质量比,下同)混合,置于恒温振荡水浴锅中升温至37 ℃后以150 r/min的速度模拟胃消化2 h,然后用0.1 mol/L NaOH溶液迅速调整体系pH至7.0终止胃消化,再加入模拟肠消化液(1∶1)混合,置于恒温振荡水浴锅中升温至37 ℃后150 r/min模拟肠消化2 h,分别在30、60、90、120 min取样。消化结束后,迅速置于冰水中冷却至4 ℃,在冷冻离心机中以4 ℃、10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液于-20 ℃冷冻保存备用。

1.3.3 消化上清液水解度的测定

样品的水解度测定采用O-邻苯二甲醛(O-phthaleldehyde, OPA)法。根据涂丹等[10]的方法,以100 mg/mL丝氨酸溶液作标准曲线。将样品蛋白质量浓度稀释至0.5 mg/mL后进行测定,根据标准曲线计算上清液中游离氨基含量,进而计算水解度。

1.3.4 消化上清液中肽含量的测定

参考CHURCH等[11]的方法略有修改,以GSH浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。分别向试管中加入1 mL质量浓度为:0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的GSH标准溶液,与4 mL双缩脲试剂混匀后室温静置30 min,测定540 nm下的吸光值。标准曲线为:Y=0.093 9X-0.000 1,R2=0.999 9。

参考唐开永等[12]的方法略作修改,使用双缩脲法测定粗肽含量。向2.5 mL消化液加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,摇匀后静置5 min,以7 000 r/min冷冻离心10 min,转移上清液至50 mL容量瓶中定容。取1.0 mL溶液,加入4.0 mL双缩脲试剂,摇匀后室温放置30 min后,测定540 nm处的吸光度值,根据标准曲线计算消化液中的肽含量。

1.3.5 抗氧化活性测定

DPPH自由基清除率的测定参考王乐等[13]的方法。将模拟体外消化后的上清液冻干后配制成10 mg/mL的粗肽液,将粗肽液与0.2 mmol/L DPPH自由基溶液以体积比1∶1混匀,室温避光放置30 min后测517 nm处的吸光度As。DPPH自由基清除率计算如公式(1)所示:

(1)

式中:R1,DPPH自由基清除率,%;Ac,DPPH溶液加蒸馏水的吸光度(对照);Ab,样品溶液加无水乙醇的吸光度Ab(空白)。

ABTS阳离子自由基清除率的测定参考涂宗财等[7]的方法。ABTS溶液的配制:配制7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L K2S2O8溶液,混匀后避光放置12～16 h后,用0.2 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液将ABTS溶液稀释至734 nm处吸光度为(0.70±0.02)。取20 μL 10 mg/mL粗肽液样品加入20 μL蒸馏水后与4 mL ABTS溶液混匀,暗处反应10 min后,于734 nm处测其吸光度As。ABTS阳离子自由基清除率计算如公式(2)所示:

(2)

式中:R2,ABTS阳离子自由基清除率,%;Ac,ABTS阳离子自由基溶液加蒸馏水的吸光度(对照);Ab,样品溶液加磷酸盐缓冲液的吸光度(空白)。

Fe2+螯合力的测定参考LEE等[14]的方法。向1 mL 10 mg/mL粗肽液中加入0.05 mL 2 mmol/L的FeCl2溶液,振荡混匀后再加入0.2 mL 5 mmol/L菲洛嗪溶液剧烈混匀反应,室温下静置10 min后于562 nm下测定吸光度As。Fe2+螯合率计算如公式(3)所示:

(3)

式中:R3,Fe2+螯合率,%;Ac,FeCl2溶液和菲洛嗪直接反应后的吸光度(对照);Ab,将粗肽液换为去离子水反应后的吸光度(空白)。

1.3.6 消化产物分子质量的分布。

依据GB/T 22492—2008《多肽相对分子质量分布的测定方法》测定并进行改进。取100 mg冻干鮰鱼消化产物于10 mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度后超声5 min,离心并经微孔过滤膜过滤后进样。采用TSK2000凝胶柱(G2000SWXL分析柱,7.8 mm×300 mm);流动相V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=40∶60∶0.1;流速0.5 mL/min;进样量10.0 mL;柱温30 ℃;紫外检测波长220 nm。分子质量标准品为细胞色素C(MW 12 384)、抑肽酶(MW 6 500)、杆菌肽(MW 1 422)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW 451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW 189)。根据标准品的出峰时间,拟合标准曲线,并计算消化产物的分子质量分布。

1.3.7 消化产物中游离氨基酸分析

将一定量冻干消化产物溶解于20 mL去离子水中,加入20 mL 10%三氯乙酸,振荡均匀,4 ℃反应15 h,使大分子蛋白质沉淀后于4 ℃离心 (12 000×g,20 min),取上清液经0.22 mm微孔滤膜过滤,以备上机分析。

1.3.8 数据处理

以上实验均重复进行3次。结果以平均数±标准差表示,用SPSS 19.0统计软件进行方差分析(ANOVA),用Duncan多重比较法进行显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同热加工方式下鮰鱼消化产物抗氧化能力

2.1.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基是一种很稳定的脂溶性自由基[15],其清除率与抗氧化能力呈正相关。由图1可知,随着消化的进行,各消化阶段消化产物的DPPH自由基清除能力逐渐增强。只经过胃消化的各组消化产物的自由基清除能力较弱,且各组之间差异不显著(P>0.05);但进入肠消化阶段后,消化产物的DPPH自由基清除能力随着消化时间的延长(消化阶段2和5)显著提高(P<0.05)。对比各组相同浓度的消化粗肽液,生肉组消化终产物的DPPH自由基清除率仅23.83%,而经热加工处理后的鱼肉消化粗肽液的DPPH自由基清除率均有所提高。不同热加工方式下消化终产物(消化阶段5)的DPPH自由基清除率也有明显差异,蒸制处理组DPPH自由基清除率高达31.35%,而水煮、烤制处理组的DPPH自由基清除能力略强于生肉(对照)组,分别为26.70%和26.26%。

消化结束后的终产物具有较强的DPPH自由基清除能力,可能和其中存在的氨基酸和抗氧化肽的种类及数量有关。王乐等[13]研究发现,清酱肉经模拟消化后,粗肽中疏水性氨基酸含量较多,因此具有较强的DPPH自由基清除效果。与另外2种热加工方式相比,蒸制组DPPH自由基清除率更高,说明蒸制后的鱼肉经模拟消化后,可能会产生更多的疏水性氨基酸,并有助于促进疏水性较强的抗氧化肽形成。

2.1.2 ABTS阳离子自由基清除率

ABTS阳离子自由基是一种水溶性自由基,常用来表征亲水性物质的抗氧化能力[13]。由图2可知,随着消化的进行,消化产物的ABTS阳离子自由基清除能力逐渐增强,到消化后期逐渐趋于平稳,各组肠消化终产物的ABTS阳离子自由基清除能力均显著强于仅经过胃消化的产物(P<0.05),相同的变化趋势在对猪肉和牛肉模拟消化产物的研究中也有发现[16]。生肉、蒸制和水煮组在肠消化30 min后,ABTS阳离子自由基清除能力显著升高;烤制组在肠消化30、60 min后均显著提高,随后变化不明显。与生肉相比,熟制后鱼肉的消化终产物(消化阶段5)ABTS阳离子自由基清除能力更强,其中蒸制处理组高达到64.79%,显著高于生肉组(P<0.05),这可能是因为热加工后鱼肉更易消化,从而产生更多亲水性氨基酸和肽段。

不同处理方式下鮰鱼肉消化粗肽的ABTS阳离子自由基清除率的变化趋势与DPPH自由基清除率相似,可能是因为在胃肠两步消化过程中,蛋白质逐渐降解,亲水性的小分子肽和氨基酸在消化产物中积累,导致ABTS阳离子自由基清除能力逐渐增强。

2.1.3 Fe2+螯合力

很多氧化反应的发生都需要金属离子催化[13],而过多的游离金属离子会给人体造成一些不利影响[17]。作为金属离子中最强的促氧化剂,Fe2+螯合力与抗氧化活性密切相关。由图3可知,与DPPH自由基以及ABTS阳离子自由基清除力类似,Fe2+螯合能力也随着消化的进行而逐渐增强。在肠消化120 min后,除生肉外,各处理组鱼肉消化终产物(消化阶段5)的Fe2+螯合力均大于80%,其中蒸制处理组的鱼肉消化产物Fe2+螯合力最强,高达86.69%,显著高于生肉组消化终产物7.62%(P<0.05)。

氨基酸侧链的残基可对肽螯合金属离子的能力产生影响。葛晓鸣等[18]对海马水解蛋白的研究发现,肽链的酸性与碱性氨基酸残基均能促进对Fe2+的螯合,疏水氨基酸也更易于和金属离子螯合。因此本研究将对鮰鱼消化终产物中的粗肽和氨基酸做进一步研究。

2.2 消化终产物水解度及肽含量测定

消化液中蛋白的水解程度和多肽含量变化可以在一定程度上反映鮰鱼的消化程度,并与抗氧化活性密切相关[17]。由图4可知,与生肉相比,热加工后的鮰鱼消化终产物中蛋白水解度和多肽含量均提高。对比各热加工方式可以看出,蒸制处理的鱼肉消化程度最高,经胃肠两步消化后其终产物的蛋白水解度为47.97%,多肽含量为2.03 mg/mL,分别比生肉组高15.98% 和14.04%,因此,熟制的鱼肉更易被消化酶水解,其中蒸制>水煮>烤制,且可以产生更多具有抗氧化活性的物质。此结果一定程度上解释了熟制后的鱼肉经消化后产物的抗氧化能力更强的原因。WANG等[19]的研究也发现,热加工后的宣威火腿经胃肠消化后可以产生更多有抗氧化能力的小生物活性肽,增强了宣威火腿的营养品质。

此外,先前已通过实验测定各组蛋白体外消化率发现,经胃肠两步消化后,对照组、水煮组、蒸制组和烤制组的蛋白消化率分别为58.50%、60.10%、66.78%和62.70%,与肽含量的差异相似。结果表明热加工可能有利于鮰鱼的消化,可能是因为一定程度的热处理使蛋白结构展开,更易和消化酶结合,消化程度增强。

2.3 消化终产物分子质量分布

不同热加工方式下鮰鱼消化终产物的分子质量分布情况如表1所示。经胃肠两步消化后,消化终产物的分子质量主要分布在1 kDa以下,王辉等[20]对金枪鱼多肽抗氧化能力的研究表明,消化产物的抗氧化能力主要来自于分子质量<1 kDa的肽,其中分子质量<500 Da的组分抗氧化能力更强。

由表1可知,与生肉相比,热加工之后鱼肉消化终产物中分子质量>3 kDa的组分显著减少 (P<0.05),而分子质量处于500～1 000 Da的组分显著增加,最大提高了7.36%,进一步说明热加工后的鱼肉更易被消化成小分子肽,这也与SAYD等[21]对热加工前后的肉在消化后肽释放量变化的研究结果一致。对比各热加工组消化终产物的分子质量分布情况可知,蒸制组消化产物分子质量<500 Da 的组分含量最多,且肽含量最高,这可能是导致蒸制处理组具有最佳抗氧化活性的原因。

2.4 消化终产物游离氨基酸分析

氨基酸的组成和含量对消化产物抗氧化活性具有重要作用[22]。相关研究表明,酸性氨基酸和碱性氨基酸使肽具有较强的Fe2+螯合能力和自由基清除能力;疏水性氨基酸使肽具有较强的抗氧化活性的同时,也更易与金属离子螯合[20]。由表2可知,与生肉相比,热加工后鱼肉消化产物中氨基酸含量更高,且具有抗氧化能力的氨基酸占比更高,进一步解释了其抗氧化能力更强的原因。这可能是因为热处理使蛋白变性的同时,有更多疏水性氨基酸暴露,更易于消化酶接触[8],同时也增加了消化产物中疏水性氨基酸的含量。

但总体来看,与肽含量相比,氨基酸含量较低,并非消化终产物中的主要成分,因此影响抗氧化能力的主要因素还是肽的组成和分子质量分布。

3 结论

本文利用体外模拟消化模型处理鮰鱼肉,发现与生肉相比,热加工后的鮰鱼更好消化,且随着消化的不断进行,消化产物的抗氧化能力逐渐增强。与对照组相比,各处理组消化终产物的DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力和Fe2+螯合能力均有所增强,消化终产物的抗氧化能力均呈现蒸制>水煮>烤制的结果。其中,蒸制处理组DPPH自由基清除能力是生肉组的1.32倍,差异最显著。热加工后的鮰鱼肉经模拟消化的终产物中,分子质量<3 kDa的肽含量增多,抗氧化氨基酸所占比例也有所升高(P<0.05),其中蒸制处理组变化最大。低分子质量肽和抗氧化氨基酸的增多可能是蒸制处理的鱼肉消化后抗氧化能力更强的原因。综上可见,与生肉相比,热加工后鮰鱼肉的可消化性提高,进而增强了消化产物的抗氧化能力。

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Effects of thermal treatment on antioxidant activity of in vitro digestion products of channel catfish (Ietalurus punetaus)

ZHANG Zhiyun1,2, JIANG Qixing1,2*, GAO Pei1,2, YU Dawei1,2, YANG Fang1,2, XU Yanshun1,2, XIA Wenshui1,2

1(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Quality Control, Wuxi 214122, China)

ABSTRACT In vitro simulated gastrointestinal two-step digestion was performed on raw and cooked channel catfish Ietalurus punetaus meat under different thermal processing methods, and the differences in antioxidant capacity of the digested products at different phases of digestion were compared, and the peptide concentration, degree of hydrolysis, molecular weight, and amino acid composition of the final digested products were studied. Results showed that with the extension of digestion time, the antioxidant capacity of the digested products gradually increased. The cooked channel catfish had a higher degree of hydrolysis after digestion, and the content of peptides in the digestive juice increased significantly. The steamed group had the most significant change (P<0.05), the degree of hydrolysis of the digestive juice was 47.97%, and the peptide content was 2.03 mg/mL, which were 15.98% and 14.04% higher than those in the raw meat group, respectively. The antioxidant capacity of crude peptides obtained by digesting channel catfish after cooking was higher than that of raw meat. The steamed group had the strongest antioxidant capacity, with DPPH free radical and ABTS cationic radical scavenging rates of 31.35% and 64.79%, respectively, and Fe2+ chelation capacity was as high as 86.69%. In addition, in the digested products of cooked channel catfish, the molecular weight of peptides was reduced, and the proportion of peptides with molecular weight <1 kDa in the steamed group was as high as 80.86%. The content of amino acids related to antioxidant activity reached 84.22%. Cooking is beneficial to the digestion of channel catfish meat, and the digested products obtained by steaming have the highest antioxidant activity and are more beneficial to digestive health.

Key words channel catfish; thermal processing method; in vitro digestion; antioxidant capacity; amino acid analysis; molecular weight

第一作者：硕士研究生(姜启兴副教授为通信作者,E-mail:qixingj@163.com)

基金项目：江苏现代农业(大宗鱼类)产业技术体系项目(JATS[2021]508)

收稿日期：2022-04-15,改回日期：2022-06-05

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031993

引用格式：张芷芸,姜启兴,高沛,等.热加工方式对斑点叉尾鮰鱼肉体外消化产物抗氧化活性的影响[J].食品与发酵工业,2023,49(11):163-169.ZHANG Zhiyun, JIANG Qixing, GAO Pei, et al.Effects of thermal treatment on antioxidant activity of in vitro digestion products of channel catfish (Ietalurus punetaus) [J].Food and Fermentation Industries,2023,49(11):163-169.