活性氧(reactive oxygen species,ROS)是细胞氧化呼吸过程中产生的代谢产物,ROS自由基由于外层轨道有不成对的电子而具有较高反应活性[1]。ROS自由基在生物体内有着双重作用,在正常生理浓度下,ROS自由基参与调节细胞周期和细胞内信号传导途径,又充当基因表达的信号分子[2]。然而,在病理或衰老等条件下,ROS不受控的产生和大量积累,高浓度的ROS使细胞氧化还原失衡,称之为“氧化应激”。过量的ROS会对细胞脂质、蛋白质、DNA等物质造成伤害,研究表明持续的氧化损伤与衰老、癌症、心脑血管疾病、阿尔茨海默氏症、帕金森等神经性退行疾病的发生息息相关[3]。因此,消除 ROS自由基被认为是生物体对抗不同疾病的重要防御机制之一[4]。
抗氧化化合物具有清除自由基、金属离子(Fe2+/Cu2+)螯合和抑制脂质过氧化的能力,可以用于功能性食品或营养品的配方中[5]。饮食中摄取天然抗氧化物质已被证明是减轻ROS的有害作用及对人体氧化负荷的有效方法[6]。因此,对具有抗氧化特性的食物来源的蛋白质水解物研究越来越多。XU等[7]对高粱蛋白水解物及其超滤组分的抗氧化活性进行了研究,结果表明中性蛋白酶水解后超滤获得的3～10 kDa组分具有更高的自由基清除、金属螯合及还原能力。GU等[8]发现最佳条件下用胰酶处理获得的脱脂核桃蛋白水解物具有较高的金属离子螯合及自由基清除能力,可以通过不同机制发挥抗氧化作用。
豌豆蛋白是一种优质植物蛋白,其营养均衡、具有较低的致敏性,富含赖氨酸,除蛋氨酸外其余必需氨基酸均能达到FAO/WHO推荐评分模式的标准值[9]。豌豆蛋白既能够提供营养,同时通过酶解获得的豌豆蛋白水解物(pea protein hydrolysates,PPH)还具有原蛋白所不具备的多种生物活性,如抗氧化活性。POWNALL等[5]研究发现PPH超滤后经反相色谱分离获得的各组分较谷胱甘肽具有更好的抑制亚油酸氧化及离子螯合能力。张秋萍[10]研究发现先后使用中性及胰蛋白酶水解获得的PPH有更高的DPPH自由基清除能力。
目前对于酶法制备PPH的抗氧化活性研究仅限于体外化学方法的评价,鲜有通过细胞模型在细胞水平上对抗氧化效果的评价。基于此,本研究首先对碱性蛋白酶和复合蛋白酶协同水解豌豆蛋白制备的PPH及其超滤组分的体外化学抗氧化活性进行评价,优选出活性高的组分,采用生物相关性高的细胞模型对细胞抗氧化能力进行考察,并在H2O2诱导的HepG2 应激细胞体系探究对细胞的保护作用,为PPH作为天然源抗氧化剂的应用提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
豌豆蛋白粉,江苏华启有限公司;碱性蛋白酶、复合蛋白酶,Novozymes公司;DPPH、ABTS,Biotopped公司;双抗、DMEM高糖培养基、胰酶(0.25%),Gibco公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]、PBS,上海生工生物工程股份有限公司;实验室制超纯水,其他试剂均为市售分析纯。
1.2 仪器与设备
LYOQUEST-85冷冻干燥机;二氧化碳培养箱,无锡沃信;超净工作台,山东博科;荧光倒置显微镜,奥林巴斯;全波长多功能酶标仪,PerkinElmer;天平,北京赛多利斯有限公司;96孔细胞培养板、细胞培养瓶,美国Corning公司。
1.3 实验方法
1.3.1 PPH及其超滤分离组分的制备
称取一定质量的豌豆蛋白粉配制成底物质量浓度70 g/L的蛋白溶液,调节溶液pH至 8.5加入碱性蛋白酶(添加量为900 U/g),50 ℃水解3 h后温度保持不变,调节pH至7.0后添加复合蛋白酶(添加量为700 U/g)继续水解3 h,整个水解过程中始终用1 mol/L NaOH溶液维持体系的pH恒定。反应结束后沸水浴灭活,冷却后离心取上清液为PPH。收集上清液经超滤膜截留分子质量<3 kDa(PPH1),3～5 kDa(PPH2),>5 kDa (PPH3)3个组分,分别冻干后进行抗氧化能力测定。
1.3.2 抗氧化活性测定
参照文献[11-14]分别对PPH及其超滤分离组分的DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力、氧自由基清除能力(oxygen radical absorbance capacity, ORAC)、亚油酸自氧化抑制能力进行测定。
1.3.3 氨基酸组成分析
参考POWNALL等[5] 的方法称取等量的样品分别加到安瓿管中,加入 6 mol/L的HCl溶液,用氮吹仪氮气保护10 min后酒精喷灯封管,在110 ℃水解14～24 h。反应结束后将水解液冷却,用NaOH溶液将pH调至2.2并用柠檬酸钠缓冲溶液定容,上清液过 0.22 μm滤膜后用氨基酸自动分析仪进行分析。
1.3.4 细胞培养及PPH1对 HepG2细胞存活率的影响
参照张倩等[15] 的方法进行细胞培养,每隔2～3 d进行一次传代,待HepG2细胞处于对数生长期时用于实验。
为确定后续细胞实验的样品浓度且保证样品对细胞无毒性作用,参照FELICE等[16] 的方法将HepG2细胞计数并配制成1×105 cells/mL的细胞悬液,每孔加入100 μL 细胞悬液贴壁培养 24 h后弃去旧培养基,实验组每孔加入 100 μL质量浓度为50、100、200、250、500、750、1 200、1 500 μg/mL 的 PPH1培养液并设置6个复孔,正常对照组加入相同体积的完全培养基,继续培养24 h 后每孔加入终质量浓度为0.5 mg/mL 的 MTT溶液4 h后弃上清液,每孔再加入150 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),微孔板振荡仪振荡 10 min后放于酶标仪490 nm测定 OD 值,计算细胞存活率。
1.3.5 PPH1细胞抗氧化实验(cellular antioxidant activity,CAA)
参照SONG等[17] 的方法用CAA法测定细胞内抗氧化活性。
1.3.6 H2O2氧化损伤模型的建立和PPH1对HepG2细胞的保护作用
按1.3.4中的方法进行细胞培养后建立损伤模型组:即各孔加入100 μL浓度为2、5、10、20、50、100 mmol/L的H2O2溶液,各设6个平行孔,继续培养2 h 后MTT法测定细胞存活率。
在上述模型建立的预实验的基础上,筛选出2个浓度的H2O2:10和20 mmol/L分别对细胞作用2 h确定最佳损伤条件后,选择1.3.4确定的对细胞无明显毒性的PPH1浓度按如下操作实验。
空白组:未经PPH1样品和H2O2处理的细胞悬液;实验组:先后经过PPH1样品和H2O2处理的细胞悬液;模型组:仅经过H2O2处理的细胞悬液。
96孔板中,每孔加入100 μL密度为1×105cells/mL的细胞悬液,于恒温培养箱中培养24 h后弃去孔内培养基,实验组每孔分别加入相应浓度的PPH1溶液,每孔100 μL。空白组和模型组分别加100 μL无血清培养基孵育24 h后弃去培养基,实验组和模型组每孔加100 μL H2O2溶液(10、20 mmol/L),空白组加入100 μL无血清培养基孵育2 h。孵育结束后MTT法测定细胞存活率。
1.3.7 PPH1对HepG2细胞内ROS水平的影响
参照LU等[18] 的方法按照1.3.6分组方法处理细胞,对细胞内的ROS荧光强度进行测定。
1.3.8 统计学分析
所有实验至少重复 3 次,实验数据以平均值±标准差表示,Origin Pro 8.5 软件作图, 半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect,EC50)值计算及数据显著性分析使用 SPSS 21.0 软件。
2 结果与分析
2.1 PPH及其超滤分离组分的体外抗氧化活性分析
2.1.1 DPPH和ABTS阳离子自由基清除能力
DPPH自由基是一种稳定的自由基,DPPH自由基清除能力表明化合物(如抗氧化剂)提供电子的能力,从而将自由基转化为更稳定的物质,它被广泛用于评估天然化合物的抗氧化活性[5,19]。由图1-a中可知,PPH及其超滤分离各组分都具有较高的DPPH自由基清除能力,且随着组分浓度的增加而增加,呈现浓度依赖效应。在超滤的3个组分中,PPH1表现出最强的DPPH自由基清除能力,其次是PPH3和PPH2。在1 mg/mL时,超滤各组分DPPH自由基清除能力高于大麻籽蛋白水解物各超滤组分[20]。这表明食源性蛋白水解物的DPPH自由基清除活性可能取决于其组成的分子质量大小[21]。这与前人对花生蛋白水解产物[22]、小麦胚芽蛋白水解物[23]研究结果一致。
a-DPPH自由基;b-ABTS阳离子自由基
图1 各组分自由基清除能力
Fig.1 Free radical scavenging ability of each component
ABTS阳离子自由基是一种有色的阳离子自由基,也是评价蛋白水解物自由基清除能力的有效方法之一[24]。由图1-b可知,在实验浓度设定的范围内PPH及其超滤膜分离各组分都具有较高的ABTS阳离子自由基清除能力。4 mg/mL时PPH1的ABTS阳离子自由基清除率为最高(74.90±1.03)%,高于PPH3和PPH2,但低于同浓度下的阳性对照还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的清除率。
同时, EC50值越小表明物质的自由基清除能力越好。由表1可知各超滤组分的DPPH自由基清除能力的EC50为2.57～3.48 mg/mL, PPH1的EC50值高于阳性对照GSH的EC50值,显著低于其他超滤组分,也低于王赛等[25]制备的豌豆低聚肽DPPH自由基清除能力的EC50值(4.65 mg/mL)。
表1 PPH及各超滤组分自由基清除能力 单位:mg/mL
Fig.1 Free radical scavenging ability of PPH and each ultrafiltration component
组分DPPH自由基ABTS阳离子自由基GSH0.05±0.07a0.03±0.12aPPH3.48±0.33d4.91±1.20ePPH32.97±1.14c1.94±1.52cPPH23.45±0.66d2.00±1.21dPPH12.57±0.36b1.32±1.05b
注：同一列内不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
对于ABTS阳离子自由基,各组分的EC50值在1.32～4.91 mg/mL,PPH1相比于其他各超滤组分有更低的EC50值,为1.32 mg/mL,也低于WANG等[24]从金枪鱼蛋白水解物中得到的序列为Gly-Ala-Ala(217.3 Da)ABTS阳离子自由基的EC50值(1.754 1 mg/mL);高于FENG等[26]从板栗蛋白水解物中纯化鉴定2种肽ABTS阳离子自由基的EC50值,VYTE 和VSAFLA 的EC50值分别为 (0.13±0.01)和(0.28±0.04) mg/mL。
以上结果表明PPH1中存在电子供体,可以捕获DPPH和ABTS阳离子自由基将其转化为更稳定的产物并终止自由基链式反应。
2.1.2 氧自由基清除能力
ORAC可以直接反映待测物质阻断自由基链式反应的能力,作为一种量化抗氧化能力的方法广泛应用于食品行业中[27]。ORAC值的计算首先需要求得待测样品(抗氧化剂)存在下荧光衰退曲线的面积AUC样品和自然衰退(无抗氧化剂存在条件下)荧光衰退曲线的面积AUC空白之差,即抗氧化剂作用下的保护面积,将此保护面积与标准物质Trolox保护面积之比即为ORAC值。相同条件下组分的净面积越大,表明荧光衰退的越慢,相应的ORAC值越大。
计算标准物质Trolox的净面积NetAUC得到标准曲线为y=0.746 2 x+8.837,R2=0.999 7,待测物质的ORAC以标准物质Trolox当量(μmol TE/g)表示,结果见表2。
表2 各组分氧自由基曲线净面积(NetAUC)及ORAC值
Table 2 Net area of oxygen radical curve (NetAUC) and ORAC value of each component
超滤组分(0.05 mg/mL)NetAUCORAC值(μmol TE/g)PPH3140.01a131.37±3.41aPPH2140.18a131.60±0.95aPPH1710.84b896.35±1.33b
由表2可知,PPH不同超滤组分呈现出不同氧自由基清除能力。其中PPH1的ORAC值最高,为(896.35±1.33) μmol TE/g,显著高于PPH2和PPH3组分。张晶等[28]对菜籽多肽超滤得到的不同分子质量组分的抗氧化活性进行研究,发现RPH-P4(分子质量<3 kDa)的ORAC值显著高于其他超滤组分,为(1 547.89±34.57) μmol TE/g。张羽等[29]对麦胚清蛋白抗氧化肽抗氧化活性的研究中发现抗氧化活性与分子质量呈负相关性,分子质量小的组分WGAH-Ⅲ抗氧化活性最高,其ORAC值为1 258.98 μmol TE/g。
2.1.3 亚油酸自氧化抑制能力
亚油酸结构中有2个不饱和双键,极易被氧化成过氧化自由基(ROO·),再经过一系列连续反应使脂肪不断氧化,并且这种氧化是在室温下就能够自发进行的氧化反应,亚油酸氧化程度通过500 nm处吸光度的增加来衡量颜色的显影程度,吸光度增加表明亚油酸氧化增加,因此抗氧化剂对于食品是否具有抗氧化作用常用亚油酸自氧化来检验。
由图2可知,7 d内豌豆原蛋白没有水解组分对亚油酸氧化几乎没有抑制作用,与空白对照相当。其他各组第1天时PPH1、PPH2、PPH3抑制亚油酸氧化能力相似,且都好于PPH和化学合成的抗氧化剂丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)。随着时间的延长,各组抑制能力逐渐区分开来,BHT一直保持较低的吸光值,其他各组分吸光值上升明显。PPH1在前3天具有较好的抑制能力,抑制效果好于LI等[11]研究鹰嘴豆蛋白水解物凝胶分离的各组分。第4天后吸光值极剧增加,抑制能力降低,但仍好于PPH2、PPH3和PPH。有研究表明疏水性氨基酸对阻断脂质自由基链式反应有贡献作用[5],因此推测PPH超滤组分PPH1中具有一定比例的疏水性氨基酸。
图2 各组分在亚油酸模型中脂质氧化抑制能力
Fig.2 Lipid oxidation measured in linoleic acid model system in the presence of different fraction
2.2 氨基酸组成分析
食源性蛋白质的酶法水解被证明可以释放出多种生物活性肽,而这些活性肽特殊的氨基酸组成及排列顺序对其发挥多种功能具有重要影响[5]。在对氨基酸与ROS或活性氮(reactive nitrogen species,RNS)反应机制的研究中发现,组氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸是典型的反应性氨基酸。此外,酸性氨基酸、碱性氨基酸具有金属离子螯合能力,疏水性氨基酸的存在可以增强肽在脂质中的溶解度,促进它们进入靶器官,从而导致体外抗氧化活性增加[30]。
由化学抗氧化活性指标评价的结果可知,PPH超滤组分PPH1具有更好的抗氧化能力,对其进行氨基酸组成分析,结果如表3所示。
表3 PPH1氨基酸组成
Table 3 Analysis of amino acid composition of PPH1
氨基酸种类含量/(g/100 g)氨基酸种类含量/(g/100 g)Ala(丙氨酸)2.54Lys(赖氨酸)4.70Val(缬氨酸)2.95His(组氨酸)1.51Leu(亮氨酸)5.25Arg(精氨酸)5.50Ile(异亮氨酸)2.78Glu(谷氨酸)11.19Pro(脯氨酸)7.17Asp(天冬氨酸)7.40Met(甲硫氨酸)0.58Phe(苯丙氨酸)3.29Gly(甘氨酸)2.46总氨基酸(%)65.19Ser(丝氨酸)3.20疏水氨基酸(%)27.02Tyr(酪氨酸)2.27碱性氨基酸(%)17.96Thr(苏氨酸)2.24酸性氨基酸(%)18.59Cys(半胱氨酸)0.16必需氨基酸 (%)18.84
PPH1中富含谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、精氨酸。疏水性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸比例较高,分别占总氨基酸含量的41.44%、28.51%、27.55%,这些氨基酸都有助于PPH1发挥抗氧化功能。此外,谷氨酸、天冬氨酸还是甜鲜氨基酸,可以赋予PPH鲜味,必需氨基酸含量占总氨基酸含量的29.90%,说明水解物PPH1还具有较高的营养价值。
2.3 PPH1的细胞抗氧化活性评价
基于体外化学评价抗氧化活性的方法具有成本低、高通量的优点,然而抗氧化作用不仅局限于清除自由基,还包括氧化还原细胞信号传导和基因表达的调节,有必要通过细胞模型的研究评估化合物或提取物的潜在抗氧化活性。由体外化学抗氧化活性评价的结果可以得出PPH超滤组分PPH1活性更好,因此采用细胞模型进一步考察该组分钠滤脱盐后细胞抗氧化活性。
2.3.1 PPH1对 HepG2细胞存活率的影响
如图3所示,PPH1在实验设定质量浓度750 μg/mL以内,细胞存活率与对照组比增长不明显,样品质量浓度>1 200 μg/mL时可促进细胞增殖但仍对细胞无明显毒性,样品在50～1 500 μg/mL时都对细胞无明显毒性作用,可以在此区间选定实验样品质量浓度,最终选定质量浓度为:50、100、500、1 000 μg/mL。
图3 PPH1浓度对HepG2细胞存活率的影响
Fig.3 Effect of PPH1 on the survival rate of HepG2 cells
2.3.2 PPH1细胞抗氧化实验
在CAA法中,2′,7′-二氯二氢荧光素(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein,DCFH)用作 HepG2 细胞中的探针,当被来自2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐[2,2′-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride, AAPH]或其他 ROS/ RNS 产生的过氧自由基ROO·氧化时发出强烈荧光,最终形成二氯荧光素 (dichlorofluorescein,DCF)。抗氧化剂可以减少DCF的形成,荧光物质的减少量可以反应抗氧化剂的抗氧化能力[31]。如图4和图5 所示,Trolox和PPH1不同质量浓度样品在60 min内可以不同程度地降低 HepG2 细胞系中荧光水平,抑制DCFH氧化成DCF,从而有效降低细胞内由于过氧自由基或ROS/RNS形成的氧化态。PPH1质量浓度为1 mg/mL时,细胞内荧光强度最低,此时PPH1具有最强的细胞内抗氧化能力。
图4 Trolox对细胞内荧光增长的抑制作用
Fig.4 Trolox’s inhibitory effect on intracellular fluorescent growth
图5 PPH1对细胞内荧光增长的抑制作用
Fig.5 PPH1’s inhibitory effect on intracellular fluorescent growth
通过计算阳性对照Trolox的时间-荧光变化曲线下的积分面积EC50值为(0.16±0.13) mg/mL,同理计算样品的EC50值为(3.97±0.63)mg/mL,折算成CAA值为(101.36±3.45)μmol QE/ g peptide。有研究表明在加入AAPH前未经PBS清洗细胞的EC50值小于经PBS清洗的EC50值,可能是由于AAPH除进入细胞内部外还残留一部分在细胞膜外,这一部分产生的自由基被具有抗氧化功能的物质清除从而减少了进入细胞内的自由基[32]。本实验中在加入AAPH之前用PBS清洗了细胞,减少了AAPH 在细胞膜外的残留,因此CAA值低于相关文献中的报道,但发现PPH1仍具有较好的CAA活性,具有一定的清除细胞内自由基的能力。
2.3.3 H2O2氧化损伤模型的建立和PPH1对HepG2细胞的保护作用
通过预实验对H2O2浓度和时间的初步筛选,确定了作用时间为2 h。从图6可以看出,通过10、20 mmol/L H2O2来诱导细胞氧化损伤,随着H2O2浓度的升高,模型组的细胞存活率呈下降趋势。当H2O2浓度为20 mmol/L时,细胞存活率低于50%,存活率太低不适合选为模型浓度。因此,选择H2O2浓度10 mmol/L,对细胞作用2 h为氧化损伤条件。
图6 PPH1对HepG2细胞氧化损伤的保护作用
Fig.6 Protective effect of PPH1 on oxidative damage in HepG2 cells
注:*表示与模型组相比有显著差异(P<0.05),**表示与模型组相比有极显著差异(P<0.01),+表示添加,-表示未添加。
通过图6还可以看出当10 mmol/L H2O2对细胞作用2 h后,不同质量浓度的PPH1预先作用24 h下的细胞存活率与模型组相比,低质量浓度(0.05、0.1 mg/mL)存活率低于模型组,说明此浓度下的PPH1没有抵御H2O2对细胞氧化损伤的能力;高浓度(0.5、1 mg/mL)剂量下,细胞存活率分别显著高于模型组(P<0.05、P<0.01),说明在此质量浓度下,PPH1能够有效降低H2O2对细胞的氧化损伤,对HepG2细胞氧化损伤有明显的保护作用。
2.3.4 PPH1对H2O2氧化应激HepG2细胞内ROS的影响
采用DCFH-DA 探针进一步检测细胞内 ROS 的水平。由图7可以看出,与空白对照组相比,模型组内的ROS荧光强度显著提高(P<0.01),加入了不同质量浓度的PPH1预处理后的荧光强度与模型组相比均有所下降,分别下降了17.2%、40.5%、50.7%、70.0%,呈浓度依赖趋势。其中,1 mg/mL处理的细胞内ROS荧光强度与模型组相比极显著下降(P<0.01)。ROS水平是细胞损伤的重要标志,因此可以得出PPH1能够在一定浓度范围内抑制细胞内ROS大量积累,缓解由此造成的细胞损伤。
图7 PPH1对细胞内ROS荧光强度的影响
Fig.7 Effects of PPH1 on intracellular ROS fluorescence intensity
注:与对照组相比,##P<0.01;与 H2O2 诱导氧化损伤组相比,*P<0.05,**P<0.01,+表示添加,-表示未添加。
3 结论与讨论
本研究中发现PPH及其超滤截留得到的不同分子质量的组分都具有一定的体外自由基清除及抑制脂质氧化能力。同一样品实验设定的浓度范围内随着浓度的增加抗氧化能力也增加,呈剂量-效应关系;相同浓度下不同样品的比较中,超滤获得的组分PPH1(分子质量<3kDa)具有更好的体外化学抗氧化能力,DPPH自由基清除力的EC50值为(2.57±0.36),ABTS阳离子自由基清除的EC50值为(1.32±1.05);氧自由基的ORAC值为(896.35±1.33)μmol TE/g;在7 d内能一定程度上抑制亚油酸的自氧化;其组成中具有高比例的抗氧化功能特征的疏水性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸。
在此基础上通过HepG2 细胞模型对细胞内抗氧化能力、氧化应激胞内ROS水平进一步研究PPH1对氧化应激损伤细胞的保护作用。结果表明PPH1能够有效降低HepG2细胞内荧光水平;0.5、1 mg/mL PPH1作用24 h的细胞存活率显著高于H2O2诱导的损伤模型组,同时能够显著抑制应激HepG2细胞内ROS的积累,说明在实验设定的浓度下,PPH1能够提高细胞内抗氧化防御能力,中和细胞中ROS,减少细胞膜脂质过氧化引起细胞的损伤或凋亡,这也说明自由基淬灭并不是抗氧化防御的全部作用,为了保护细胞免受氧化应激,抗氧化化合物还可能上调抗氧化酶、调节基因表达或改变细胞信号传导,这些还需进一步的实验探究。总之,实验结果表明PPH及其超滤分离组分是良好的天然抗氧化剂来源。
[1] ALKADI H.A review on free radicals and antioxidants[J].Infect Disord Drug Targets.2020;20(1):16-26.
[2] NWACHUKWU I D, ALUKO R E.Structural and functional properties of food protein-derived antioxidant peptides[J].Journal of Food Biochemistry, 2019, 43(1):e12761.
[3] EMERIT J, EDEAS M, BRICAIRE F.Neurodegenerative diseases and oxidative stress[J].Biomedicine &Pharmacotherapy, 2004, 58(1):39-46.
[4] MEMARPOOR Y M, MAHAKI H, ZARE Z H.Antioxidant activity of protein hydrolysates and purified peptides from Zizyphus jujuba fruits[J].Journal of Functional Foods, 2013, 5(1):62-70.
[5] POWNALL T L, UDENIGWE C C, ALUKO R E.Amino acid composition and antioxidant properties of pea seed (Pisum sativum L.) enzymatic protein hydrolysate fractions[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(8):4 712-4 718.
[6] ZHANG Q Z, TONG X H, SUI X N, et al.Antioxidant activity and protective effects of Alcalase-hydrolyzed soybean hydrolysate in human intestinal epithelial Caco-2 cells[J].Food Research International, 2018, 111:256-264.
[7] XU S W, SHEN Y T, CHEN G J, et al.Antioxidant characteristics and identification of peptides from sorghum kafirin hydrolysates[J].Journal of Food Science, 2019, 84(8):2 065-2 076.
[8] GU M, CHEN H P, ZHAO M M, et al.Identification of antioxidant peptides released from defatted walnut (Juglans sigillata Dode) meal proteins with pancreatin[J].LWT-Food Science and Technology, 2015, 60(1):213-220.
[9] DING J, LIANG R, YANG Y Y, et al.Optimization of pea protein hydrolysate preparation and purification of antioxidant peptides based on an in silico analytical approach[J].LWT, 2020, 123:109126.
[10] 张秋萍. 豌豆分离蛋白酶解产生物活性肽的研究[D].无锡:江南大学, 2013.
ZHANG Q P.Study on active peptides of pea protein hydrolysate[D].Wuxi:Jiangnan University, 2013.
[11] LI Y H, JIANG B, ZHANG T, et al.Antioxidant and free radical-scavenging activities of chickpea protein hydrolysate (CPH)[J].Food Chemistry, 2008, 106(2):444-450.
[12] MORENO C, MOJICA L, GONZ
LEZ DE MEJ
A E, et al.Combinations of legume protein hydrolysates synergistically inhibit biological markers associated with adipogenesis[J].Foods (Basel, Switzerland), 2020, 9(11):1678.
[13] DVALOS A, G
MEZ-CORDOVÉS C, BARTOLOMÉ B.Extending applicability of the oxygen radical absorbance capacity (ORAC-fluorescein) assay[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(1):48-54.
[14] 王惠敏, 户佩, 蔡甜甜, 等.抗氧化胡萝卜籽肽的分离鉴定及活性表征[J].食品与发酵工业, 2019, 45(2):95-100.
WANG H M, HU P, CAI T T, et al.Isolation, identification and characterization of antioxidative carrot seed peptides[J].Food and Fermentation Industries, 2019, 45(2):95-100.
[15] 张倩, 朱婷婷, 黄明泉, 等.白酒中两种萜烯类化合物的细胞内抗氧化活性[J].食品科学, 2020, 41(9):66-73.
ZHANG Q, ZHU T T, HUANG M Q, et al.Intracellular antioxidant activity of two terpenoids in Baijiu[J].Food Science, 2020, 41(9):66-73.
[16] FELICE D L, SUN J, LIU R H.A modified methylene blue assay for accurate cell counting[J].Journal of Functional Foods, 2009, 1(1):109-118.
[17] SONG W, DERITO C M, LIU M K, et al.Cellular antioxidant activity of common vegetables[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(11):6 621-6 629.
[18] LU C R, LI C, CHEN B, et al.Composition and antioxidant, antibacterial, and anti-HepG2 cell activities of polyphenols from seed coat of Amygdalus pedunculata Pall[J].Food Chemistry, 2018, 265:111-119.
[19] BOUGATEF A, HAJJI M, BALTI R, et al.Antioxidant and free radical-scavenging activities of smooth hound (Mustelus mustelus) muscle protein hydrolysates obtained by gastrointestinal proteases[J].Food Chemistry, 2009, 114(4):1 198-1 205.
[20] GIRGIH A T, UDENIGWE C C, ALUKO R E.In vitro antioxidant properties of hemp seed (Cannabis sativa L.) protein hydrolysate fractions[J].Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2011, 88(3):381-389.
[21] UDENIGWE C C, LU Y L, HAN C H, et al.Flaxseed protein-derived peptide fractions:Antioxidant properties and inhibition of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in murine macrophages[J].Food Chemistry, 2009, 116(1):277-284.
[22] ARISE A K, ALASHI A M, NWACHUKWU I D, et al.Antioxidant activities of Bambara groundnut (Vigna subterranea) protein hydrolysates and their membrane ultrafiltration fractions[J].Food &Function, 2016, 7(5):2 431-2 437.
[23] ZHANG J X, WEN C T, LI C Z, et al.Antioxidant peptide fractions isolated from wheat germ protein with subcritical water extraction and its transport across caco-2 cells[J].Journal of Food Science, 2019, 84(8):2 139-2 146.
[24] WANG B, GONG Y D, LI Z R, et al.Isolation and characterisation of five novel antioxidant peptides from ethanol-soluble proteins hydrolysate of spotless smoothhound (Mustelus griseus) muscle[J].Journal of Functional Foods, 2014, 6:176-185.
[25] 王赛, 李慧, 孙婉婷, 等.豌豆肽抗氧化性机制评析[J].食品科技, 2019, 44(10):306-310.
WANG S, LI H, SUN W T, et al.Evaluation on antioxidant mechanism of pea peptide[J].Food Science and Technology, 2019, 44(10):306-310.
[26] FENG Y X, RUAN G R, JIN F, et al.Purification, identification, and synthesis of five novel antioxidant peptides from Chinese chestnut (Castanea mollissima Blume) protein hydrolysates[J].LWT-Food Science and Technology,2018,92:40-46.
[27] HUANG D J, OU B X, PRIOR R L.The chemistry behind antioxidant capacity assays[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(6):1 841-1 856.
[28] 张晶, 张怡一, 徐斐然, 等.菜籽多肽体外和细胞内抗氧化性评价及氨基酸分析[J].食品科学, 2016, 37(13):36-41.
ZHANG J, ZHANG Y Y, XU F R, et al.Antioxidant activities in vitro and in cells and amino acid composition of rapeseed peptides[J].Food Science, 2016, 37(13):36-41.
[29] 张羽, 汪芳, 翁泽斌, 等.麦胚清蛋白抗氧化肽的筛选及对细胞氧化损伤的保护作用[J].食品科学, 2021, 42(17):10-18.
ZHANG Y, WANG F, WENG Z B, et al.Screening of wheat germ albumin-derived antioxidant peptides and its protective activity against cellular oxidative damage[J].Food Science, 2021, 42(17):10-18.
[30] WALSH C T, GARNEAU-TSODIKOVA S, GATTO G J Jr.Protein posttranslational modifications:The chemistry of proteome diversifications[J].Angewandte Chemie (International Ed.in English), 2005, 44(45):7 342-7 372.
[31] KELLETT M E, GREENSPAN P, PEGG R B.Modification of the cellular antioxidant activity (CAA) assay to study phenolic antioxidants in a Caco-2 cell line[J].Food Chemistry, 2018, 244:359-363.
[32] 王丽英. 玉米抗氧化肽活性氧清除作用与抗氧化基因表达调节作用研究[D].长春:吉林大学, 2018.
WANG L Y.Study on scavenging effect of active oxygen of corn antioxidant peptide and regulation of antioxidant gene expression[D].Changchun:Jilin University, 2018.