应用微生物制剂缓解高草酸尿症的研究进展

近几十年来,由于脂肪吸收不良的消化系统疾病,如克罗恩病、肝纤维化、慢性胆道疾病、胰腺疾病和短肠综合征,常伴有高草酸尿症,致使肠源性高草酸尿症的患病率有所增加[1]。高草酸尿症会增加患肾结石的风险,可能发展为慢性肾脏病,甚至造成肾功能衰竭[2-3]。肾结石是一种常见的泌尿系统疾病,男性和女性终生患病率约为10%和6%,许多发达国家的患病率仍在上升。该病症的高复发率给世界各地的患者带来了沉重的经济负担。究其原因是体内的草酸盐产生过多或肠道吸收过多,因此,如何降低机体草酸浓度是解决高草酸尿症的关键。

许多具有草酸降解特性的细菌(以下简称“草酸降解菌”)可以预防高草酸尿症的形成。例如,产甲酸草酸杆菌可促进肠道草酸分泌,减少肠道内草酸吸收,降低尿液中草酸含量,从而预防草酸钙结石的形成。益生菌能够调节肠道菌群平衡,减少肠道对草酸的吸收,改善高草酸尿症,这对许多临床疾病具有重要的治疗或辅助治疗意义。基于此,本文综述了高草酸尿症的特征、具有降解草酸作用的益生菌以及肠道微生物与肾病的关系。并详细论述了活体微生物制剂在高草酸尿症的应用,有望为益生菌治疗肾脏疾病的研究提供参考。

1 高草酸尿症

原发性高草酸尿症是一种罕见的常染色体隐性遗传病,由乙醛酸盐和草酸盐先天性代谢异常引起肝脏产生内源性草酸盐过多而导致。肠源性高草酸尿症是由胃肠道疾病引起的,由于肠道对脂肪吸收不良而过度吸收膳食中草酸,进而导致尿中草酸增加的一种疾病。

草酸是一种代谢终产物,由于人体缺乏降解草酸的酶类,其在体内较难被消除。草酸代谢的途径如图1所示,人体主要通过3种途径将草酸排出体外:与肠道中的钙结合形成不溶性草酸钙,随粪便排出;被肠道中的微生物降解;经肠道吸收进入血液,经过肾脏,随尿液排出。在正常个体中,人体内的草酸来自肠道吸收的膳食草酸与肝脏合成的内源性草酸,体外摄入的膳食草酸约30%～40%,其余草酸来自于体内肝脏的合成[4]。由于胃肠道对草酸盐的吸收率较低(<15%),人体内约90%的草酸随尿液排出。

当人体内草酸代谢紊乱时,尿草酸排泄量增加,超过45 mg/d时可被定义为高草酸尿症。该症是肾结石的一个重要诱因,由于草酸盐随尿液排出过程中流经肾脏,形成的难溶草酸钙晶体易导致草酸钙肾结石。肾结石是公认的肠源性高草酸尿症的并发症,患者尿草酸含量是影响肾结石形成的关键因素,因为尿草酸对草酸钙结石的影响是尿钙的5～20倍[5-7]。肾结石包括草酸钙结石、磷酸钙结石及尿酸结石等,其中草酸钙结石是肾结石的主要类型,约占80%[8-9]。其他类型的结石成因明确,预防和治疗方法明晰,然而草酸钙结石至今缺乏特效药物治疗,必须通过手术碎石的方法才能有效消除。因此,草酸钙结石成为肾结石研究的重点和难点。导致肾结石的因素主要有代谢异常[10]、饮食不合理[11]、尿路因素等,其中代谢异常是形成肾结石的主要原因。代谢异常包括草酸代谢异常、钙代谢异常、尿酸代谢异常、镁离子代谢异常等。肠道对草酸吸收增加异常可能导致高草酸尿,并显著增加结石形成的风险[7]。研究表明,高草酸尿症与肠道菌群存在紧密联系,降解草酸的微生物不仅能够降低肠道草酸浓度还能通过肠道菌群调节该症[12],因此,降解草酸的微生物成为近年研究的热点。

2 肠道微生物与草酸代谢

2.1 具有降解草酸的微生物

结肠中特定细菌的存在可促进草酸排泄到肠道中[13-14],草酸在结肠中被微生物群进一步代谢,未被微生物群降解的草酸可被宿主通过粪便或尿液排出,或以草酸钙晶体的形式积聚在肾小管中,这些晶体可以聚集形成肾结石。在正常生理状况下,可以通过上文所述3种途径维持机体内草酸的动态平衡。当草酸的摄入量过多或草酸代谢紊乱时,尿草酸的排泄量随之升高,引发草酸钙结石形成的风险增高,而粪便仅能排泄少量草酸,因此增加肠道中的草酸降解菌可能是降低尿草酸水平的有效手段。

MIKAMI等[15]发现,健康成人肠道中草酸降解菌的定植显著高于草酸钙结石患者,分别为82%和45%。人体内缺失草酸降解菌会导致尿草酸排泄量增加,膳食中大部分草酸被肠道吸收,从而增加患高草酸尿症的风险。益生菌,特别是产甲酸草酸杆菌、乳酸菌和双歧杆菌可以降低胃肠道中的草酸,继而有助于降低机体尿草酸水平。

2.1.1 产甲酸草酸杆菌

人体肠道菌群中存在降解草酸的微生物,其中产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)是被首次发现能够有效降解草酸的一种专性厌氧菌。产甲酸草酸杆菌可以减少肠道对草酸的吸收,迅速降低尿液中的草酸水平[1, 14, 16-17]。研究表明,产甲酸草酸杆菌在肠道中的定植与年龄相关,儿童的肠道中均检出该菌,然而随着年龄的增长,人体肠道内该菌逐渐减少。该菌以草酸盐为唯一碳源[18],需要口服草酸盐才能完成在肠道中定植,此方法会使高草酸尿患者病情加重的风险提升。

定植于胃肠道中的草酸降解菌是维持机体内草酸平衡的重要因素。其中,产甲酸草酸杆菌作为机体内降解草酸的主要细菌,通过草酸/甲酸逆向转运蛋白(oxalate/formate antiporter, OxlT)、甲酰辅酶A转移酶(formyl-CoA transferase, FRC)和草酰辅酶A脱羧酶(oxalyl-CoA decarboxylase, OXC)进行草酸代谢,代谢终产物为甲酸和CO2。该降解途径如图2 所示:草酸杆菌通过OxlT摄取草酸,在FRC的作用下将草酸分解为草酰辅酶A(Oxaly-CoA)和甲酸;草酰辅酶A在OXC的作用下脱羧,生成甲酰辅酶A(Formyl-CoA)和CO2,Formyl-CoA 作为第一个反应的底物继续进行循环,CO2排出细胞。OXC和FRC的基因变体已在其他细菌中被发现,包括乳酸杆菌属[19]、肠球菌属[20]和双歧杆菌属[21-22]。

2.1.2 粪肠球菌和雷氏普罗威登斯菌

TURRONI等[20]于2000年和2005年相继在人粪便中分离出能够降解草酸的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)[23]。粪肠球菌是首次从人体内分离到能够降解草酸的兼性厌氧菌;雷氏普罗威登斯菌是兼性厌氧革兰氏阴性菌,属于肠杆菌科,有弱毒性,会导致尿路感染、伤口感染等。粪肠球菌之所以具有降解草酸能力是因为它产生的3种蛋白质(分子质量分别为65 k、48 k和40 kDa),雷氏普罗威登斯菌可以产生其中2种蛋白质(分子质量分别为65 k和48 kDa)。其中65 kDa蛋白和草酰辅酶A脱羧酶具有较高的同源性,48 kDa蛋白和甲酰辅酶A转移酶具有较高的同源性。这3种蛋白不稳定,菌株在培养基中存放数周后,表达量逐渐降低,最终导致两种菌株失去降解草酸的能力,即草酸降解蛋白的表达受到环境的调控。综上所述,尽管粪肠球菌和雷氏普罗威登斯菌降解草酸的具体机制尚不清楚,但两者产生的蛋白与产甲酸草酸杆菌降解草酸的蛋白有较高的同源性,可以推测粪肠球菌和雷氏普罗威登斯菌降解草酸的机制可能与产甲酸草酸杆菌相似。

乳酸菌是一类利用碳水化合物进行发酵产生大量乳酸的细菌,属于革兰氏阳性细菌,包括乳杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属和片球菌属。这些细菌被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准为人类可食用的安全菌株,用作益生菌促进人体健康,是肠道菌群的重要组成部分,参与预防和治疗肠应激综合征[24]、炎症性肠病[25]、泌尿生殖系统[26]等疾病。

随着对相关益生菌研究的深入,同时考虑到产草酸甲酸杆菌在肠道内较难定植,学者们开始研究乳酸菌与高草酸尿症的关系。2001年,CAMPIERI等[27]对患高草酸尿症患者服用冻干乳酸菌混合制剂[嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)]进行干预,服用4周后,尿草酸含量显著下降,说明乳酸菌治疗高草酸尿症有潜在功效。此后,学者们开始尝试用乳杆菌、双歧杆菌等益生菌治疗高草酸尿症以及高草酸尿症引起的草酸钙肾结石。乳酸菌比产甲酸草酸杆菌的定植期长,并且可以减少结肠对草酸的吸收,这对因肠道疾病或手术导致的肠源性高草酸尿症患者有利。对于健康正常的个体,外源摄入草酸,同时每天补充益生菌VSL#3®,在停止服用益生菌4周后,尿草酸的排泄仍可降低44%,说明益生菌VSL#3®可长期定植并减少胃肠道草酸的吸收[28]。VSL#3®是一种商业化益生菌制剂,由1株嗜热链球菌、3株双歧杆菌、4株乳杆菌组成,其中部分菌株已被证明具有降草酸能力[19, 22, 29]。因此,学者们开始筛选降解草酸的肠源性乳酸菌,期望能外源补充这一特性益生菌以改善高草酸尿症。MURPHY等[30]从犬和猫的胃肠道中分离出一系列双歧杆菌(Bifidobacteria)和乳杆菌(Lactobacillus),体外检测显示最高降草酸能力为61%,选出其中4株灌胃到大鼠体内,可降低大鼠的尿草酸排泄量。乙二醇是肾结石动物模型常用的试剂,摄入乙二醇不仅可以诱导高草酸尿症,还会导致大鼠肠道通透性增加及肠道微生物区系结构和组成异常。通过在摄入乙二醇之前补充益生菌植物乳杆菌N-1,能够减弱乙二醇对大鼠肠道微生物区系的影响,增加高草酸尿症大鼠粪便微生物区系的α多样性,改善肠道炎症和肠道屏障[12]。因此,外源补充的益生菌不仅可以通过降低肠道中的草酸浓度来减轻高草酸尿症,同时可能通过增加肠道环境对病原微生物的定植阻力以预防肠道微生物区系紊乱与肠道屏障损伤。

2.2 肠-肾轴

肠道是人体受神经支配的第二器官,肠道复杂的血管能够有效地吸收营养和水分,并保持胃肠道内氧气的梯度[31-32]。作为最早遇到食物、毒素和病原体等环境因素的主要器官之一,肠道与内分泌、循环系统、神经和免疫系统相互作用对宿主的生理反应有重大影响[33]。人体肠道中存在一个多样且复杂的微生物群,肠道健康与肠道微生物群变化交织在一起保持动态平衡。当人体出现异常代谢时,肠道菌群也会发生变化。肠道菌群在维持人体健康方面发挥着重要作用,包括免疫系统的调节、维生素和营养物质的合成以及多糖的消化等。随着研究的深入,学者们发现肠道菌群可以改善多种疾病,如肠炎、结肠癌、糖尿病、神经系统疾病、心血管疾病和骨代谢等[33-34]。

自发现可以降解草酸的产甲酸草酸杆菌后,学者们推测肠道微生物和草酸钙结石存在紧密联系。“肠-肾轴”概念的提出解释了肠道微生物通过调节代谢物来影响肾病[35],人们对肠道菌群和草酸钙结石的研究随之深入。STERN等[36]为了探究结石患者肠道微生物的特征,利用16S rRNA对比分析了23名结石患者和6名健康成人的肠道菌群,发现结石组中拟杆菌属(Bacteroides)是对照组的3.4倍,对照组的普氏杆菌(Prevotella)是结石组的2.8倍。然而,这次研究尚存在不足,因饮食是人体代谢的决定因素,代谢引起的病理变化又对肾结石的发展起关键作用[4],此外,抗生素也能够改变肠道微生物的组成[37],但这项研究没有考虑饮食与抗生素的影响。TICINESI等[38]对52名结石患者和48名健康志愿者的肠道微生物进行分析,结果显示两组之间的肠道微生物多样性显著不同。16S rRNA基因测序表明结石组的粪便微生物多样性显著低于对照组;鸟枪法宏基因组学表明对照组草酸降解菌的相对丰度显著高于结石组。这表明肾结石和肠道菌群密切相关,肠道中草酸降解菌越多,尿草酸排泄量越少,由此可以推测,肠道中的草酸降解菌的增加可以减少尿草酸排泄或改善和预防肾结石疾病。TANG等[39]也有相似的发现,肾病患者的肠道微生物群的微生物多样性、分类组成和功能潜力与健康对照组之间有显著差异。综上所述,肠道菌群与肾结石的发病机制呈现出极强的相关性,未来可能成为缓解和治疗肾结石及相关疾病的新靶点。

目前,肾结石和肠道菌群关联性研究不断深入,有研究通过调节肠道菌群的治疗策略来寻求新的突破。益生菌可以通过调节肠道菌群及其代谢产物,间接改善肾脏损伤水平。ZHU等[40]的研究表明,小鼠双侧肾缺血-再灌注引起的肠道微生物失调在干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)预处理后得到了恢复,并且与产生单链脂肪酸的细菌数量增加有关。此外,干酪乳杆菌预处理对肾缺血-再灌注所致的肠道炎症和肠黏膜屏障损伤具有明显的改善作用。干酪乳杆菌可以通过肠道微生物区系代谢产物有益地影响免疫,调节巨噬细胞和肾小管上皮细胞的炎症反应,从而预防急性肾损伤并减缓慢性肾脏病的发展。益生菌是调节肠道菌群的良好策略,但将益生菌用于治疗肾结石的研究仍处于初步阶段。在过去几年中,许多研究利用宏基因组学评估肾结石患者的肠道微生物群,以探究更全面的肠道菌群和肾结石形成的联系。尽管学者一直致力于通过调节肠道菌群来减少尿草酸的排泄,但仅得出了健康人群与结石患者之间肠道微生物组成存在较大差异,而此差异与肾结石形成方面有无确切关联,至今未给出明确解释。基于肠道菌群的复杂性,肠道微生物区系的组成和功能如何影响肾结石疾病还需要进一步探索。

3 基于活体微生物制剂对高草酸尿症的调控

3.1 菌群疗法对高草酸尿症的调控

通过上述肠道微生物与肾结石的阐释可以说明,肠道菌群是介导肾脏疾病发生的关键因素。最近有研究发现,慢性肾脏病患者体内的益生菌丰度降低、病原菌增加,菌群的失调破坏肠道屏障,导致细菌易位,进一步激活了炎症、氧化应激和肾脏纤维化途径,从而加重肾损伤[41]。同时,过多的代谢废物无法被肾脏充分排出而重新进入肠腔,进一步加剧肠道菌群紊乱,导致恶性循环[42],此外粪便细菌移植(fecal microbiome transplantation, FMT)可以通过逆转肠道菌群失调改善慢性肾脏病[43-44]。将野生食草哺乳动物白喉林鼠的粪便移植到大鼠体内,9个月后,仍可以观察到草酸降解能力显著增加。HAN等[45]探索发现丹参(Salvia miltiorrhiza, AS)可以通过肠道菌群来调节慢性肾毒性对人体的损害作用。将丹参治疗组小鼠的粪便进行移植,得到FMT-AS治疗组。AS组和FMT-AS组肠道屏障相关基因(如紧密连接蛋白ZO-1)的表达增高,恢复了小鼠肠道通透性。通过分析各组小鼠的肠道菌群结构,AS组和FMT-AS组中产丁酸和乳酸的益生菌含量增加,尤其是阿克曼菌(Akkermansia)和乳杆菌。丁酸作为短链脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFAs)的主要成分之一,可以改善肠道屏障功能[46]。因此,菌群疗法作为调节肠道菌群的有效手段,可以成为一种治疗高草酸尿症的有效方法。

3.2 益生菌对高草酸尿症的调控

益生菌可以通过降低肠道草酸浓度、调节肠道菌群和缓解肾脏氧化损伤3个方面改善高草酸尿症。

3.2.1 降低肠道草酸浓度

目前,筛选草酸降解菌是益生菌改善高草酸尿症的研究热点。在培养基中加入定量草酸钠或草酸铵,发酵结束后测定培养基中剩余草酸钠或草酸铵含量,以此来评价草酸降解菌的降解率,从而筛选出能够高效降解草酸的菌株[30, 47-48]。

2006年,KWAK等[49]从31株乳酸菌中筛选到2株高效降解草酸的干酪乳杆菌HY2743和干酪乳杆菌HY7201,将其应用到3%草酸钠饮食诱导的大鼠中,发现可以减少大鼠尿草酸的排泄,以此推测乳酸菌在肠道的定植减少了草酸在肠道的吸收。该研究是乳酸菌应用到动物高草酸尿症及泌尿系统结石的首次报道。FEDERICI等[22]在乳酸双歧杆菌DSM 10140中发现了草酸降解的OXC,并将该酶成功表达。OXC是降解草酸的关键酶,催化草酰辅酶A脱羧为甲酰辅酶A,可以使草酸的降解率达到60%,这是双歧杆菌属中发现的第一个草酸降解酶。此外,该团队又发现能高效降解草酸的嗜酸乳杆菌LA14,通过对嗜酸乳杆菌LA14中的草酸降解酶进行基因克隆和测序以及毛细管电泳法测重组酶活性,证明了嗜酸乳杆菌LA14中存在OXC和FRC,并且参与了草酸的分解代谢[19]。体内研究表明,具有降草酸能力的乳酸菌能够改善高草酸尿症。GOMATHI等[50]从人的粪便和发酵食品中分离到能降解草酸的唾液乳杆菌AB11(Lactobacillus salivarius AB11)、发酵乳杆菌TY5(Lactobacillus fermentum TY5)和发酵乳杆菌AB1,并将这些乳杆菌与具有抗氧化作用的槲皮素灌胃到5%草酸钾饮食诱导的草酸钙结石大鼠中,与喂养草酸钾饲料的大鼠相比,乳杆菌组和乳杆菌加槲皮素组大鼠的尿草酸水平明显降低;结合组织病理切片,草酸钙晶体明显减少;在转录组学方面,骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、肾素(renin)和血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)等表征草酸钙结石严重程度的相关基因表达下调以及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等抗氧化基因的表达上调。唾液乳杆菌可以作为益生菌添加到功能性食品以减轻氧化应激,减少尿草酸排泄,防止草酸钙结晶沉积。MEHRA等[51-52]同样发现,将含有OXC和FRC的副乳杆菌UBLG-36(Lactobacillus paragasseri UBLG-36) 应用到草酸钠饮食诱导的大鼠体内,能够有效预防高草酸尿症并减轻肾脏损害。更多关于益生菌治疗高草酸尿症的实例见表1。综上,体外研究表明乳酸菌具有降解草酸的能力,并且这种能力与菌中含有的草酸降解基因有关,体内研究表明,乳酸菌可以缓解大鼠的尿草酸水平,具有临床应用潜力,有望用于降解人体肠道中的草酸。

3.2.2 调节肠道菌群

高草酸尿症患者肠道微生物失调,这部分内容在上文“肠-肾轴”中有详细的阐述,然而益生菌如何通过干预其肠道菌群失衡来改善高草酸尿症的研究较少。益生菌主要通过增加肠道菌群的多样性、增加产SCFAs菌群、改善肠道屏障等方面干预高草酸尿症。肠道菌群中以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主,占所有微生物的90%以上,高草酸尿症大鼠粪便微生物中的拟杆菌门和厚壁菌门比率显著升高,表明高草酸尿能诱导炎症反应[57]。高草酸尿症大鼠α多样性降低,补充植物乳杆菌可以通过增加变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和软壁菌门(Tenericutes)丰度来增加α多样性, 保持微生物的多样性对于维持足够的草酸代谢非常重要[12, 37]。此外,植物乳杆菌可以上调结肠紧密连接蛋白Claudin-2,改善肠道炎症和屏障功能,以及增加SCFAs的产生并增加产生SCFAs的有益细菌的数量[12]。SCFAs通过减少肾脏中巨噬细胞和中性粒细胞的浸润,减轻急性肾损伤和慢性肾脏病[39]。干酪乳杆菌也能够提高SCFAs水平,通过肠道微生物改善了肠道炎症和肠道屏障[58]。

3.2.3 缓解肾脏氧化损伤

在动物受到内、外部环境刺激时,会引起机体的应激反应。机体的氧化还原平衡被破坏是动物处于应激状态的典型特征,这时体内活性氧的产生速率超过了清除速率,氧自由基会大量积累,过量的氧自由基与脂质、蛋白质的DNA反应,损坏生物分子,导致细胞损伤或死亡,破坏机体的免疫功能,导致炎症的发生[59]。氧化应激是导致衰老和疾病的重要因素,动物体内的抗氧化系统会维持机体的氧化还原平衡,缓解氧化应激,从而恢复机体的炎症反应。抗氧化系统主要包括两类:酶抗氧化系统,包括超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GPx和过氧化氢酶CAT、辅酶Q等,当机体受到氧化应激时,将上调这些抗氧化酶的表达;非酶抗氧化系统,包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽、类胡萝卜素、微量元素铜、锌、硒等,高浓度草酸或不溶性草酸钙通过引起机体氧化应激致使肾小管上皮细胞损伤,从而导致草酸钙结晶在肾脏大量沉积[60-61]。草酸钙晶体增加了大鼠近端和远端肾小管上皮细胞线粒体超氧化物的产生,产量是正常大鼠的3～6倍,降低了谷胱甘肽总和以及脂质过氧化水平升高,机体受到氧化损伤[62]。一些抗氧化物的使用可以缓解机体的氧化损伤从而减少晶体在高草酸大鼠肾脏中的沉积。例如,体外细胞实验发现,N-乙酰半胱氨酸可以稳定草酸钙结晶诱导的肾小管上皮细胞LLC-PK1的细胞活力,降低脂质过氧化水平,上调谷胱甘肽相关酶活力[61];体内动物实验表明,具有抗氧化活性的绿茶和牛磺酸可以减少大鼠肾脏草酸钙结石的形成,提高超氧化物歧化酶的活性[63-64]。大量研究表明,乳酸菌在体内和体外都表现出显著的抗氧化能力[65-66]。饲喂高草酸饲料后,大鼠体内的丙二醛水平显著增加, CAT、SOD和GPx活性显著降低,在灌胃乳酸菌后脂质过氧化明显改善,抗氧化酶的水平得到提高[67]。综上,高浓度草酸引起的肾小管上皮细胞氧化应激能够通过抗氧化活性物质得到改善,乳酸菌已被证明具有显著的抗氧化能力,可以降低体内的过氧化水平,提高抗氧化酶活性,因此乳酸菌可能通过降低高草酸尿症患者体内氧化应激反应缓解高草酸尿症。

3.3 基因工程菌对高草酸尿症的调控

由于草酸是形成高草酸尿症的主要诱因,大量摄入高草酸的食物将导致尿草酸含量升高,增加患草酸钙结石的风险,因此减少草酸在肠道的吸收对于缓解该症具有重要意义。通过上文阐述,不是所有益生菌都具有降解草酸的能力,凡是含有一种或几种草酸降解酶[如,草酸脱羧酶(oxalate decarboxylase, OxdC)、甲酰辅酶A转移酶(formyl-CoA transferase, FRC)、草酰辅酶A脱羧酶(oxalyl-CoA decarboxylase, OXC)]会具有较强的草酸降解能力。然而,益生菌中含有草酸降解酶的菌株较少,需要大量工作筛选;另一方面,降低尿草酸不是缓解高草酸尿症的唯一方法,抑制炎症因子生成和减轻氧化应激也能减轻症状。因此,将草酸降解酶与具有抗炎、抗氧化的乳酸菌结合起来是一种新的治疗策略。

随着基因工程的发展,将草酸降解酶相关基因整合到乳酸菌中,重组乳酸菌可以有效治疗高草酸尿症。草酸脱羧酶,一种草酸降解酶,主要存在于真菌和细菌中,其活性较好,能够适应胃肠道环境,即使在较低pH条件下,同样具有较高的草酸降解活性,并且不需要其他辅因子,能够直接将草酸降解成甲酸盐和二氧化碳。SELVAM团队致力于重组乳酸菌治疗草酸钙结石的研究[53,67-70]。2014年,其团队将重组载体pLdhl0373OxdC成功转入WCFS1中,得到重组菌WCFS1-OxdC,在重组菌培养上清液中检测到OxdC的活性,并且上清液中草酸浓度降低了70%,而野生型WCFS1的培养上清液中的草酸浓度没有任何变化[67]。将重组菌WCFS1- OxdC用于5%草酸钾饮食诱导的草酸钙结石大鼠中,重组菌能够显著降低大鼠的尿草酸水平,野生菌则没有效果[53]。2018年,该团队利用乳球菌Ⅱ类内含子Ll.LtrB开发食品级植物乳杆菌-OxdC的益生菌,动物实验表明,重组菌治疗组大鼠的尿草酸、钙、尿素氮和肌酐水平显著降低;在基因水平上,骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和肾脏损伤因子(kindey injury molecule,Kim-1)的表达下调;组织病理学分析,重组菌组大鼠的钙沉积明显比模型组少[54]。ZHAO等[55]也是相同的结果,重组后的乳酸乳球菌 MG1363-OxdC能显著降低大鼠的尿草酸排泄。将来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的草酸脱羧酶(oxalate decarboxylase,ODC)和大麦(Hordeum vulgare)中的草酸氧化酶基因分别转化乳酸乳球菌MG1363中,体外草酸降解能力和高草酸尿大鼠实验表明来自枯草芽孢杆菌中的草酸脱羧酶具有显著降草酸效果,而来自大麦草酸氧化酶对草酸的降解效率较低。更多过表达草酸降解酶菌株参见表2。

此外,除了过表达草酸脱羧酶基因, LUBKOWICZ等[71]通过基因整合,将草酸杆菌中的草酸/甲酸逆向转运体、草酰辅酶A脱羧酶和甲酰辅酶A转移酶基因整合到大肠杆菌1917(Escherichia coli Nissle 1917)上,结果同样表明,工程菌可以显著降低小鼠和非人灵长类动物的尿草酸含量。通过大量研究发现,与野生菌相比,重组草酸降解基因的益生菌在体外有显著的降草酸效果,将其应用在体内发现,能显著降低尿草酸排泄,表明益生菌通过降低胃肠道草酸浓度改善了高草酸尿症。目前,已研发出了治疗严重的高草酸尿症的口服酶制剂ALLN-177,LANGMAN等[72]将枯草芽孢杆菌中的草酸脱羧酶通过表达、纯化、包埋,得到口服剂ALLN-177(每粒胶囊含有142 mg草酸脱羧酶),该制剂从2016年进入临床试验,2022年6月份已完成第三阶段临床验证[73]。

4 结语

综合目前研究,能够缓解高草酸尿症的活体微生物包括粪便中的功能菌群、具有功能性的益生菌、降草酸的重组菌,其缓解机制为降低肠道草酸,调节肠道菌群、增加肠道屏障,改善肾脏的氧化损伤及炎症反应。筛选降解草酸的益生菌成为研究的热点,学者已从各种基质中筛选出了能够降解草酸的益生菌,但将其应用于体内的研究较少,未来还应着眼于益生菌干预高草酸尿症的体内研究。高草酸尿症以及肾结石与肠道菌群密不可分,未来对肾-肠轴的研究不应再局限于描述粪便微生物区系组成以及与健康对照人群比较分析,还应深入对益生菌作用于机体后与肠道微生物相互作用的功能研究。通过益生菌干预来调控肠道微生物组成和功能是治疗高草酸尿症与肾结石的有效方法,这具有广泛的前景。

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