随着人们生活水平的不断提高,食品安全问题日渐成为人们关注的焦点。其中,肉及肉制品是人类饮食不可或缺的部分,可以为人体提供必要的氨基酸和蛋白质,肉制品安全与人类生命健康直接相关。近年来,接连发生了许多严重的肉制食品掺假的问题,如“马肉风波”、“羊肉卷添加猪肉鸭肉”等[1]。这些掺假行为不仅使消费者的权益受到了侵害,而且对消费者的健康也造成了危害,同时也侵犯了部分民族及信仰宗教的消费者权益。因此,建立快速、准确和灵敏的动物源性食品掺假核酸扩增技术具有重要意义。
目前,常用的核酸检测方法有感官鉴别技术、电泳分析、核酸扩增技术、免疫学技术、光谱技术以及色谱与质谱技术[2],以上核酸检测技术的研究和应用大大地提高了检测的准确性。通过核酸检测技术将商家想要在肉中掺假的想法及时地扼杀在摇篮中,有利于打击掺假市场,同时也可以保护消费者的生命健康。目前的检测方法主要以在实验室检测为主,可用于快速、便携和现场检测动物源性食品掺假的方法比较少。因此,本课题组在动物源性食品掺假检测技术中以提高检测灵敏度和设备便携化为主,取得了相应的研究进展,包括样品上样[3]、液滴生成[4]、荧光检测[5]等相关研究工作。本文将对各类核酸扩增技术的原理及在动物源性食品掺假检测中的应用进行综述。讨论了各类核酸扩增技术的关键优势和局限性,为后续完善核酸扩增技术提供理论依据,提高社会效益与经济效益,同时也简要介绍了现有的挑战和进一步的研究进展。
1 动物源性食品掺假核酸扩增技术概况
在动物源性食品掺假检测中,核酸扩增技术可分为热循环扩增技术和恒温扩增技术。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种常见的热循环扩增技术。该技术是一种周期性温度循环变化的DNA扩增技术,常用的主要包括凝胶电泳PCR、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)、多重PCR(multiplex PCR, MPCR)、数字液滴PCR(droplet digital PCR, dd PCR)等。该技术具有高灵敏度、简单快速、操作方便等特点,但是由于热循环阶段需要精准的温度控制,所以往往需要使用大型设备和复杂精密的实验仪器。因此,该技术大多数应用于环境较为固定的科研院所和高校实验室。
恒温扩增技术区别于传统的方法,摆脱了对大型设备和精密仪器的依赖。该技术是一种在恒定温度下扩增核酸的技术,由于温度恒定,因此只需要在恒温仪器中进行扩增反应即可,例如,可以采用水浴锅加热、加热块加热等方式。该技术不需要PCR技术所需要的复杂精密的温控设备,不仅降低了检测成本,而且也简化了实验的操作流程,完全可以满足户外非科研人员的现场即时检测的需求。常用的恒温扩增技术主要包括环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、交叉引物扩增(cross prime amplification,CPA)、滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)、链替代扩增(strand displacement amplification,SDA)、解旋酶依赖性扩增(helicase-dependent amplification,HDA)等技术。在动物源性食品掺假现场即时检测中,为消费者对肉源保真鉴别的知情权提供了便利,同时也保障了消费者的生命健康。
2 核酸扩增技术在动物源性食品掺假检测中的应用
2.1 热循环扩增技术
PCR是美国科学家MULLIS于1985年发明的一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝[6]。其中,1个扩增循环需要经变性、退火、延伸3个不同温度阶段,理论上,经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1,考虑到扩增效率达不到100%,所以通常经25～30次循环可扩增至106倍,足够满足后续核酸检测分析实验的要求。下面就凝胶电泳PCR、qPCR、MPCR、ddPCR等技术的原理及其在动物源性食品掺假检测中的应用进行综述。
2.1.1 凝胶电泳PCR技术
凝胶电泳PCR是DNA体外扩增的第一代PCR技术,又称传统PCR。其原理是利用DNA聚合酶和DNA寡聚引物对DNA模板进行复制扩增。该技术引物的设计较为复杂,根据实验要求不同,长度一般在150 bp至几千bp不等[7]。凝胶电泳PCR技术在动物源性食品掺假检测中非常常见,可以检测出含量极低的肉源成分。SAFDAR等[8]开发了一种六重传统PCR测定法,可同时鉴定马肉、大豆、绵羊、家禽、猪肉和牛肉,该方法的检测限为0.01%,表明了传统PCR具有较好的灵敏度。将传统PCR和qPCR进行了对比,其检测结果表明,qPCR比传统PCR的检测限更低[9]。MATSUNAGA等[7]通过对正向引物的设计,并针对6种肉类分别设计反向引物,使用凝胶电泳PCR鉴定6种肉类(牛、猪、鸡、绵羊、山羊和马)检测限均为0.25 ng。凝胶电泳PCR的特点是特异性强、灵敏度高、应用广泛,同时PCR的产物可用于其他分子生物学研究。但是实验操作繁琐,即使是专业的科研人员在操作过程中也容易造成污染。
2.1.2 qPCR技术
凝胶电泳PCR大多通过测量产物的积聚量定性分析结果,仅适用于对扩增要求不高的反应实验。而qPCR可以通过荧光强度曲线定量分析扩增反应的结果[10]。其中,LI等[11]开发了一种使用熔融曲线分析的六相qPCR测定法,可同时准确识别11种常见肉类,绝对检测限为0.01～0.1 ng DNA,相对检测限为0.1%～1%的肉类混合物,提高了实用性和降低了经济成本。在该研究基础上,他们又开发了一种三相qPCR和熔融曲线分析相结合的方法[10],以0.001～0.1 ng DNA的灵敏度同时检测3种肉源,提高了检测的灵敏度。将qPCR技术与其他技术相结合,可以提高检测的灵敏度,比如有学者对基于荧光染料的qPCR做了相关的研究。AMARAL等[12]开发了一种使用EvaGreen荧光染料的对生/熟猪肉中目标肉源进行检测的qPCR系统,该系统针对肉类混合物进行了有效验证,其检测结果表现出足够的真实性和可重复性参数。KANG等[13]利用基于SYBR Green染料的qPCR首次比较和评估了5种不同的定量方法,得出了牛肉中掺杂猪肉的检出限为0.01%。另外还有学者对基于TaqMan的qPCR进行了研究,SARLAK等[14]开发了4种定量方法能可靠地量化鸡肉-牛肉混合物中鸡肉的百分比,检测结果表明可以在定量检测肉制品中的未申报物种时获得更高的准确性和敏感性,并减少时间和经济成本。该技术相较于凝胶电泳PCR,虽然可以通过荧光强度曲线定量分析扩增反应的结果,但是该技术引物和探针的成本要高很多。另外,用于PCR的DNA聚合酶中的污染物造成的抑制可能产生假阴性结果。
2.1.3 MPCR技术
MPCR是指通过一次PCR反应同时对多个靶标进行扩增,结合一定的检测手段对扩增产物进行检测,从而实现对多个靶标进行诊断的技术[15]。由于该技术具有高效率、高通量、低成本的特点而被科研工作者进行深入研究。LIU等[15]使用通用引物开发了一种MPCR方法,以同时检测狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸和兔肉,灵敏度低至0.05 ng/μL。该研究结果表明MPCR技术可以通过设计通用引物来完成,并且检测的灵敏度也相对较高。还有学者针对基于DNA的MPCR检测技术也进行了相应的研究,LIU等[16]在鉴定肉类中掺有鸡肉、鸭肉和鹅肉时,开发了一种改进的三重qPCR,在掺假模拟实验中可以检测0.1%的家禽掺假。以上研究在提取核酸时大多数都采用离心机等大型核酸提取设备,为了提高检测设备的便携化,ZHAO等[17]开发了一种不需离心机的快速核酸提取的MPCR,可在90 min内鉴定牛肉产品中的猪肉、鸡肉和鸭肉,检测灵敏度为0.1%(质量分数)。因此,在研究MPCR检测技术时与其他技术相结合,可以促进动物源性食品掺假研究不断向前发展。该技术虽然能够在同一反应体系内对多个位点进行特异性扩增,可以降低检测成本以及大幅提升检测效率,但是也有一定的不足之处,比如引物过低会抑制扩增反应,引物过高会造成引物二聚体的形成。因此,在未来的研究工作中优化反应体系以及反应条件是提高MPCR扩增效果的方向之一。
2.1.4 ddPCR技术
ddPCR是继qPCR之后发展的新型高灵敏核酸分子绝对定量分析技术[18]。该技术通过对PCR反应物进行有限稀释,将含有核酸模板的液滴分配到上万个反应器中进行PCR扩增,根据对扩增结果的荧光信号计数,进而得出核酸的拷贝数[19],扩增原理如图1所示。
图1 ddPCR的扩增原理
Fig.1 Principle of amplification by ddPCR
VISHNURAJ等[20]采用器官特异性microRNAs开发了一种检测食品中掺有鸡肉的方法,该方法的绝对检测限和相对检测限分别为2.5和0.94 copies/μL,该方法具有高灵敏度和可重复性。WEI等[21]近期提出了一种基于单层光刻的鞘流阶梯乳化ddPCR系统,可用于生成高密度液滴阵列。在传统的阶梯乳化系统中,生成的液滴体积占比在30%以下,而在该系统中液滴产物的体积占比能够达到72%。同时,该系统适用于对高浓度核酸样品进行定量检测,其检测上限可达319 213 copies/μL。此外,通过对20～50 000 copies/μL的牛源DNA核酸样本进行定量检测,结果表明,该装置能够准确定量核酸样本浓度,具有灵敏度高和动态范围宽的优势。对于反应样品的上样,HU等[3]提出了一种基于腔室的ddPCR微流控器件,该器件具有预脱气的微流控芯片,用于检测不同质量比的鸡肉和羊肉混合物,鸡肉/羊肉的质量比分别取1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000,通过电荷耦合器件相机读取荧光图像,根据阳性腔室数量可计算出拷贝数依次为2 240、79.2、7.2、1.0 copies/μL,与现有的基于腔室的ddPCR设备相比,该器件具有更简单的样品上样性能。针对ddPCR的液滴生成阶段,WEI等[4]提出了一种基于液滴旋转的微流体混合器,可以使得液滴内的反应试剂得到充分的混合,实验结果显示在12 mm的行程中混合效率可高达92%,高混合效率可为反应获得更准确的实验结果。ddPCR与凝胶电泳PCR技术相比,虽然该技术具有极高的灵敏度、特异性和准确度,不依赖Ct值进行定量,并且可以绝对定量分析扩增后的核酸分子,但是也有一些不足之处,例如,设备自动化水平较低、集成度较差,需要配备精密复杂的设备,不适用于大批量的检测等。
2.1.5 DNA条形码技术
基于DNA的检测分析方法主要是针对特定靶基因的检测,但在动物源性食品掺假检测中,肉源可能存在多种未注明的成分较难识别。针对上述情况,人们研究了一种新的非靶向检测技术,即DNA条形码技术。该技术由加拿大动物学家HEBERT等[22]首次提出,他们通过对动物界中11门13 320个物种进行分析,正式提出将一段长约710 bp的COI基因作为动物鉴定的通用条形码序列,用于物种鉴别和分类。其工作原理是利用基因组DNA中一段标准的或者被公认的基因片段,作为分子靶标来进行种级水平的种类鉴定,类似于商品外包装上的条形码。XING等[23]提出了一种对相同16S rRNA基因的短片段进行测序的DNA元条形码方法,测序的27个样品(67%)中有18个标记错误或潜在标记错误,该项研究表明DNA元条形码的高灵敏度在检测无意掺假方面起着重要作用。在该研究基础上又提出了一种采用16S rRNA(～220 bp)迷你长度的条形码替代全长COI(～650 bp)条形码的方法[24],通过对国内市场的各种动物肉源检测,结果表明,含未申报肉类成分的检测样本为23%。虽然该技术测序成本高和待测样品消耗大,但是作为一种操作便捷、准确性高以及样本部分受损也不会影响识别结果的新型肉制品质量检测技术,在今后的动物源性食品掺假检测分析技术研究中还是极具有潜力的。
2.2 恒温扩增技术
恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。该技术的原理是在恒定温度下通过对靶序列的特异性扩增,使其产生大量拷贝,以达到检测水平。目前主要的恒温扩增技术包括LAMP、CPA、RCA、RPA、SDA、HDA等技术。以上所有的技术都具有恒定温度、灵敏度高、特异性强、不需要特殊的仪器设备等特点。下面就以上几种恒温扩增技术的原理及其在动物源性食品掺假检测的应用进行综述。
2.2.1 LAMP技术
LAMP技术是目前较为常用的等温扩增方法之一。日本学者NOTOMI等[25]在2000年首次提出了这项技术,其原理为针对靶基因上的6个区域设计4条引物,短时间内在恒定温度(60～65 ℃)下完成扩增反应,反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀,大多数通过肉眼观测来判断靶基因是否存在。与PCR技术相比,LAMP技术具有反应速度快、设备便携化和不需要复杂的温度控制等优点,解决了因PCR设备复杂精密仅适用于实验室和科研院所等较为稳定的环境下检测的问题。得益于以上优点,该技术广泛应用于动物源性食品检测领域。QIN等[26]提出了一种LAMP耦合荧光各向异性的方法,用于鉴别牛肉产品中的猪肉掺假,实现了0.01%(质量分数)的检测限,但是受复杂的核酸提取步骤(1.5 h)的限制,检测需要2 h才能完成。THANGSUNAN等[27]以中性红作为颜色指示剂,提出了一种比色LAMP的新型检测平台,可加工肉制品中二元肉类混合物的鸡肉含量低至0.01%(质量分数),该结果表明LAMP技术具有高特异性和高灵敏度。然而,LAMP技术也存在着许多缺点,比如,引物的设计难度较大,引物的相互作用易导致副产物的出现,扩增反应仅仅适用于短片段扩增,操作过程中容易受到污染而造成假阳性结果等。
2.2.2 CPA技术
CPA是由Ustar Biotechnologies公司独立研发成功的一种新型核酸恒温扩增技术,也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术[28]。该技术可以在63 ℃左右进行高效、快速、高特异地扩增靶序列。该技术可分为单交叉和双交叉扩增2种。目前,CPA技术主要用于检测转基因作物、致病菌等,在动物源性食品掺假检测中应用相对较少。ZHENG等[29]开发了一种采用胶体金核酸试纸条与CPA技术相结合的方法,在肉类混合物中检测到北极狐肉时的检测限为1%。FENG等[30]提出了一种用于检测肉类中掺有羊肉的CPA方法。在该方法中,将CPA与核酸试纸耦合,用于检测测试线上的扩增产物,选择Cytb基因作为靶标,在63 ℃下进行扩增60 min,核酸条带能够在5 min内显示相应的测试线,其检出限为1%。研究结果表明,CPA技术的灵敏度与LAMP技术相比效果较差。但是通用引物的设计能够简化反应体系,可应用于多种动物源性食品掺假的现场分析检测。
2.2.3 RCA技术
RCA在20世纪90年代中期被美国卡内基研究所的FIRE团队[31]以及耶鲁大学医学院的DAVID团队[32]先后所描述。该技术是以环状DNA为模板,通过一个短的DNA引物,在phi29 DNA聚合酶催化下将dNTPs转变成单链DNA,扩增原理如图2所示。目前,该技术在动物源性食品掺假检测领域的研究相对较少。胡学佳等[33]建立了一种基于SYBR Green I染料的跨越式等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)用来检测肉类混合物中掺有猪肉的方法,该方法的灵敏度为6.5 fg/μL。继而,通过研究鼠肉掺假验证了SRCA技术的准确性[34]。同时还研究了牛肉产品中的马肉[35],结果表明与凝胶电泳PCR方法相比,SRCA测定的灵敏度和检测限可分别达到100倍和10倍以上。虽然许多研究已经证明了该技术在检测领域的优越性,但是由于缺少紧凑、体积小、重量轻核酸检测仪器,造成了技术推广应用的局限性。因此,开发便携式、集成化、简单快速的RCA生物分析系统是未来研究工作的主要方向。
图2 RCA示意图
Fig.2 Schematic diagram of rolling circle amplification
2.2.4 RPA技术
RPA被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。该技术是在恒温(37～42 ℃)的条件下,在模板、3种酶等物质作用下进行目标基因序列的扩增反应,能在30 min内完成检测[36]。通过结合其他技术,不仅可以提高灵敏度,而且也可以缩短检测时间。最常与该技术相结合的是与试纸条相结合的方法,LIN等[37]开发了一种基于RPA和侧流层析试纸条的视觉方法,可检测出掺假率为1%的鸭/牛肉、鸭/羊、鸡肉/猪肉、猪肉/牛肉混合物。类似的,LIU等[38]开发了一种使用鸡特异性RPA与核酸杂交侧向流试纸条结合的方法用于快速检测鸡肉掺假,检测限为肉类混合物中鸡肉掺假的0.01%,该检测过程可在20 min内完成,与试纸条的结合极大地缩短了检测时间。李婷婷[39]开发了一种基于RPA可肉眼检测羊肉成分的胶体金试纸条,该试纸条可在30 min内对羊肉成分进行定性检测,检测限为0.002 ng/μL,与该试纸条的结合虽然没有缩短检测时间,但是灵敏度获得了较大的提升。
RPA技术对扩增反应的温度要求不高,与凝胶电泳PCR技术相比,凝胶电泳PCR必须经过变性、退火、延伸3个步骤,而该技术的扩增反应在常温下即可进行,由于不需要精准的温控设备,因此,在降低了成本的基础上实现了真正的便携式核酸检测。但是RPA反应的关键在于扩增引物和探针的设计,目前引物和探针的设计并不像凝胶电泳PCR那样成熟。随着该技术不断地深入研究,未来将朝着更加快速、便携、可靠和灵敏的方向发展,为动物源性食品掺假的现场检测带来新的曙光。
2.2.5 SDA技术
SDA是WALKER等[40]在1992年首次提出的一种新型的恒温体外DNA扩增的方法。与PCR相比而言,不需要耐高温的Taq DNA聚合酶和多次变性、退火、延伸3个不同温度阶段的热循环步骤。SDA技术从最初主要应用于细菌检测、病毒体外进化研究[41]发展到应用于食品安全检测。LI等[42]研究了一种鉴别肉制品中猪肉成分掺假的SDA的检测方法,该方法通过使用荧光检测装置,可以在20 min内鉴定出猪肉DNA,此外,该方法可以敏感地检测出每个反应中1 pg的猪肉DNA。ZHANG等[43]将均相电化学方法和双输出SDA扩增相结合,对牛特异性DNA序列进行了高效、特异的检测,研究结果表现出令人满意的传感性能,具有高灵敏度和良好的选择性。不难看出,SDA以其本身特有的优势加上与其他先进技术的结合,使其操作更加简单、应用范围也在不断扩大,相信在未来SDA技术在动物源性食品掺假检测方面将有较好的应用前景。
2.2.6 HDA技术
HDA技术是利用DNA解旋酶在恒温下解开双链DNA生成单链模板,再由单链模板结合蛋白使单链保持稳定状态,随后通过DNA聚合酶引物延伸生成新的双链DNA。该技术由新英格兰生物实验室在2004年模拟体外DNA扩增机制时所设计的一种新型DNA体外扩增技术[44]。作为最简单的恒温扩增技术之一,HDA的反应原理非常简单,反应过程中不需要复杂的引物设计。但是与PCR方法相比,HDA技术引物的相互作用是造成检测结果假阳性的原因。这些问题大多发生在低浓度靶标的扩增过程中,也发生在多重的HDA反应中。因此,在未来的研究中仔细优化(添加剂、酶等因素)是成功开发HDA技术的主要研究方向。同时,未来也应该开展HDA技术在动物源性食品掺假检测中的应用研究,扩展该技术的应用领域。
在过去的科学研究中,动物源性食品掺假的核酸扩增技术发展迅速,取得了很大的技术性进展,现对技术总结如表1所示。
表1 常用核酸扩增技术的对比
Table 1 Comparison of common nucleic acid amplification techniques
技术类型技术名称提出时间靶标引物数量/条酶数量/种扩增温度/℃扩增时间/min优点缺点热循环扩增凝胶电泳PCR 1985年MULLIS首次提出[6]DNA/RNA21多温区120～180特异性强、引物和所需酶类简单、应用广泛反复升降温、耗时长、仅适用于定性分析qPCR1996年Applied Biosys-tems公司首次提出DNA/RNA21多温区90～120可定量分析结果易造成假阳性结果MPCR1988年CHAMBEHIAN提出DNA/RNA多个多个多温区75～90可同时扩增多种靶标引物过低会抑制扩增,引物过高会造成引物二聚体的形成ddPCR20世纪末VOGELSTEIN提出[18]DNA/RNA21多温区60～120可绝对定量分析扩增结果设备自动化水平低、集成度差DNA条形码技术加拿大动物学家HEBERT等首次提出[22]DNA/RNA21多温区120～180操作便捷、准确性高测序成本高、样品消耗大恒温扩增LAMP技术2000年日本学者NOT-OMI提出[25]DNA4160～6560～90特异性高、扩增结果可肉眼观测引物设计复杂、易产生非特异性扩增CPA技术2009年Ustar Biotechnolo-gies公司独立研发[28]DNA4或5158～6340～60反应速度快、通用引物设计可简化检测体系与LAMP技术相比灵敏度较差、易造成假阳性RCA技术20世纪90年代中期[31-32]单链DNA1或多13760高通量、产物为单链DNA要求模板为环状、耗时费力RPA技术2006年英国公司Twist-Dx Inc研发DNA4237～4220～40反应条件温和、速度快扩增引物和探针的设计复杂SDA技术1992年WALKER等首次提出[40]DNA423715～20效率高、反应时间短不能扩增长片段HDA技术2004年新英格兰生物实验室提出[44]DNA233730引物设计简单只能扩增短片段
3 总结与展望
不同的扩增技术也展现了各自的优缺点,如qPCR技术,由于其本身特异性强、灵敏度高、定量准确等优点,目前已经广泛应用到了动物源性食品掺假检测中。但是该技术需要离心机等大型设备,并且需要昂贵精密的热循环仪,不适用于非实验室环境的检测。因此,未来的方向应该侧重于研究操作简单、成本低廉的恒温扩增技术。如可视化的LAMP检测技术,该技术摆脱了对大型设备和精密仪器的依赖,并且其温度要求单一,只需要在恒温仪器中进行扩增反应即可,但是恒温扩增技术主要是对动物源性成分定性的检测,在定量检测上研究还远远不够,因此,开发精确定量检测、现场操作、成本低的动物源性食品掺假检测设备将是未来研究的主要发展方向。其中如何利用恒温扩增技术精确定性定量检测分析动物源性成分,如何建立低成本和高通量的多重检测方法将是动物源性食品掺假检测的关键。
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