浓香型白酒是中国白酒的典型代表之一,以其醇香浓郁、甘冽清爽、饮后尤香、回味悠长的特点[1-3],深受人们欢迎,产销规模一直保持较高水平。多样的风味成分是影响浓香型白酒整体风格的重要因素,其中,4-甲基愈创木酚(4-methyl guaiacol,4-MG)和4-乙基愈创木酚(4-ethyl guaiacol,4-EG)不仅是浓香型白酒的重要风味化合物,同时也是其重要的健康因子[4-5]。作为浓香型白酒的古井贡酒,其中4-MG含量可达1 575.41 μg/L、4-EG含量可达1 707.50 μg/L;其他香型白酒中4-MG含量基本低于50.00 μg/L,4-EG含量基本低于20.00 μg/L[6]。作为健康因子,4-MG和4-EG均有体外抗氧化活性,并且4-EG在体外化学评价中表现更强;同时,4-MG、4-EG可以改善细胞内的抗氧化体[7-8]。因此,4-EG除了贡献了白酒酒体的对酒体贡献水果香和甜香、花香和烟熏味和橡胶臭之外,其也具有酚类物质的普遍特性——良好的自由基清除剂,抗氧化、抗肿瘤,阻断致癌物的形成,提高身体免疫力[9]。但是,目前对浓香型白酒发酵过程中4-MG、4-EG及其前体物质的变化规律尚不清晰,制约了白酒“风味”与“健康”双导向研究的发展。
针对4-MG和4-EG的研究主要集中于分析方法构建、香气贡献分析和体外活性评价等方面[6,9-13]。目前,对饮料酒(白酒、啤酒和葡萄酒等)中4-MG和4-EG采用的分析方法主要有GC-MS、气相色谱-闻香法(gas chromatography-olfactometry, GC-O)、HPLC等;在此基础上,香气活性分析实验揭示,4-MG对饮料酒酒体贡献酱油香和熏制食品香,4-EG会贡献饮料酒的水果香、甜香、花香以及烟熏味和橡胶臭,而当4-EG含量超过一定值则会在饮酒中呈现辛香、烟味和皮革气味;通过细胞内外实验[7-8,14],对其功能评价进行研究,揭示了该类化合物还具有抗氧化性、抗炎性,在浓香型白酒中该类化合物的贡献尤为突出。虽然4-EG的香气特征(烟熏味、橡胶臭)、生理活性和合成途径[4-EG的形成途径主要是阿魏酸(ferulic acid,FA)经过脱羧酶的作用生成4-乙烯基愈创木酚(4-vinyl guaiacol,4-VG),4-VG经过还原酶的作用生成4-EG[15]]较为清晰,但是在饮料酒发酵过程中其主要来源途径和代谢规律尚不清晰,严重制约了以提高饮料酒的风味与健康活性为目的的4-MG、4-EG调控方案的设计。
本文以五粮酿造的浓香型白酒为研究对象,即以高粱、大米、小麦、糯米、玉米、稻壳为辅料,中高温大曲为糖化发酵剂酿造的白酒。针对饮料酒发酵过程中4-MG、4-EG代谢规律不清晰等问题,本文首先采用真空辅助吸附萃取分析法(vacuum assisted adsorption extraction,VASE)结合GC-MS、HPLC建立4-MG、4-EG、4-VG、FA的分析方法;然后,解析白酒酿造过程原料、大曲、稻壳、蒸后酒醅、出池酒醅以及窖池发酵过程酒醅中FA、4-MG、4-EG、4-VG的变化规律;以期系统解析白酒酿造过程中4-EG及其中间产物和前体物质的变化规律,为探究浓香型白酒中4-MG、4-EG等健康因子的来源和生产过程提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验材料
原料:粮食(liang)、稻壳(daoke)、大曲(daqu);混合入池酒醅(JP-ru)、窖池发酵5 d酒醅(JP-5)、窖池发酵10 d酒醅(JP-10)、窖池发酵15 d酒醅(JP-15)、窖池发酵20 d酒醅(JP-20)、窖池发酵40 d酒醅(JP-40)、窖池发酵50 d酒醅(JP-50)、窖池发酵60 d酒醅(JP-60)、窖池发酵70 d酒醅(JP-70)、窖池发酵出池酒醅(JP-chu)。以上原料均取自山东某酒厂。
1.1.2 试剂
无水乙醇(色谱纯),北京伊诺凯科技有限公司;4-甲基愈创木酚(4-MG)、4-乙基愈创木酚(4-EG)、4-乙烯基愈创木酚(4-VG)(均为色谱纯),德国Dr.Ehrenstorfer公司;阿魏酸(色谱纯),日本东京化成工业株式会社。甲醇、甲酸、4-辛醇(内标)、乙酸乙酯,美国Sigma Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
Agilent GC 7890-5975 MSD气相色谱-质谱联用仪、高效液相色谱,美国安捷伦公司;DB-FFAP毛细管柱(60 m×250 μm×0.25 μm),美国Supelco公司;真空辅助吸附萃取装置、振荡仪,Entech公司;XDS5复合分子涡轮泵,英国Edwards公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司;BL-2200H电子分析天平,岛津国际贸易(上海)有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 VASE法对酒醅中挥发性成分分析前处理
参考文献[16-17]报道的VASE方法并进行改良。准确称取固体样品2.00 g置于40.00 mL吸附笔特定玻璃瓶中,加入4-辛醇作为内标,使用Teenax TA 35/60型号吸附笔,将真空吸附装置抽至真空静置2 min,置于20 ℃,80 r/min振荡器中孵育10 min,再次抽至真空静置2 min,吸附后用于进样。装置与使用方法如图1所示。
图1 真空辅助吸附萃取分析过程
Fig.1 Vacuum assisted sorption extraction analysis process
1.3.2 气相色谱-质谱条件
气相色谱条件:DB-FFAP型毛细管柱(60 m×250 μm×0.25 μm),载气为He,流速为1 mL/min;不分流模式,进样量1 μL,平衡时间1 min,进样口温度250 ℃;柱流速1 mL/min;升温程序:起始温度40 ℃,保持0 min;以15 ℃/min 升温至200 ℃,恒温6 min;再以50 ℃/min升温至250 ℃,保持10 min。
质谱条件:电子轰击离子源,电子能量为70 eV;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;传输线温度280 ℃,溶剂延迟8 min。定性采用全扫描模式(full scan),扫描范围:45.00～350.00 amu,驻留时间0.2 s。定量采用选择离子扫描模式(selected ion monitor,SIM),SIM参数见表1。
表1 选择离子检测模式参数
Table 1 The parameters of SIM
酚类保留时间/min定性离子定量离子4-甲基愈创木酚14.70138,123,95,771384-乙基愈创木酚15.65137,152,122,911374-乙烯基愈创木酚17.89150,135,107,77150
挥发性成分的定性分析由GC-MSD化学工作站完成。定量分析通过建立标准曲线:取一定量标准品,用色谱级乙醇配成单标,混合成混标,将标准溶液稀释成5个梯度备用。采用内标法定量,以待定量物质的峰面积/标品峰面积(y)为纵坐标,以待定量物质的质量浓度/标品浓度为横坐标(x)建立标准曲线,计算酒醅生物活性成分的含量。其中,酒醅基质和乙醇基质测定的内标回收率达80%。上述均进行3次平行实验。
1.3.3 阿魏酸测定前处理
烘干样品,将其粉碎后过80目筛备用。称取不同样品0.5 g于试管中,加入5.00 mL 2.00 mol/L NaOH溶液,60 ℃反应2 h。pH调至7以下,使用乙酸乙酯萃取,取有机相于培养皿中,烘干后用甲醇2 mL溶解,过膜,高效液相色谱仪测定阿魏酸。
1.3.4 高效液相色谱条件
色谱柱为Bridge Peptide BEH-C18柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm)。以含0.1%甲酸的水(A)和甲醇(B)进行梯度洗脱(0～12 min,72%A→64%A,28%B→36%B),流速1 mL/min。柱温25 ℃,进样量5 μL,柱温30 ℃;VWD检测器:检测波长323 nm;采用外标法定量。
1.3.5 统计分析
所有实验均重复3次,用Excel 2021和SPSS 26.0进行数据处理,用Origin 2021b软件绘图。
2 结果与分析
2.1 4-MG、4-EG、4-VG和FA分析方法的构建
本文采用内标法对4-MG、4-EG、4-VG三种挥发性化合物进行定量,采用外标法对非挥发性FA进行定量。4-MG、4-EG、4-VG和FA定量分析的标准曲线如表2所示,所有化合物的标准曲线相关系数R2均>0.99,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)<10%,均满足分析要求。
表2 不同样品中生物活性成分的定量结果
Table 2 Quantitative results of bioactive ingredients in different samples
化合物线性方程相关系数(R2)4-甲基愈创木酚y=0.26x+0.050.998 34-乙基愈创木酚y=0.36x+0.010.995 64-乙烯基愈创木酚y=0.72x+0.030.999 5阿魏酸y=0.04x+1.160.999 7
将已经配制好的混合标准溶液按照1.3.2节的分析条件[3]进行全扫描分析。全扫描模式下,4-MG、4-EG、4-VG的总离子流图(total ion chromatogram,TIC)如图2所示。将制备好的FA标准溶液按照1.3.4的分析条件[11,18]进行分析,得到如图3所示的FA标准品液相色谱图,上述化合物对应色谱峰的分离度(R≥1.5)、信噪比(S/N>10)均满足定性定量分析的要求。
图2 三种酚类化合物的典型总离子流图
Fig.2 Typical TIC chromatogram of three phenols
图3 阿魏酸标准品HPLC图
Fig.3 HPLC of ferulic acid
2.2 发酵过程中4-MG、4-EG及前体分析
2.2.1 白酒酿造过程目标产物及前体物质变化
为解析4-MG、4EG及其前体物质的变化规律,本研究分别测定相同干重的酿造原料(粮食、大曲、稻壳)、入池酒醅、发酵酒醅以及出池酒醅中的目标产物及前体物质的含量,其中酿造原料、入池酒醅和出池酒醅的分析结果如图4所示。
a-白酒生产中FA的含量差异;b-白酒生产中4-MG、
4-EG、4-VG的含量差异
图4 白酒生产过程中4-MG、4-EG、4-VG、FA的含量
Fig.4 Contents of 4-MG, 4-EG, 4-VG and FA during Baijiu production
在同等干重下,不同阶段的目标产物差异明显:粮食中FA的含量为57.94 mg/kg,大曲中为98.91 mg/kg,稻壳中为48.50 mg/kg,入池酒醅中为253.47 mg/kg,出池酒醅中为162.79 mg/kg。粮食中4-VG的含量为29.10 μg/kg,大曲中为48.97 μg/kg,稻壳中达5 948.00 μg/kg,入池酒醅中为108.69 μg/kg,出池酒醅中为147.66 μg/kg。4-EG在粮食中为10.10 μg/kg,大曲中为14.20 μg/kg,稻壳中达35.10 μg/kg,入池酒醅为13.14 μg/kg,出池酒醅为53.98 μg/kg。4-MG在粮食中为49.03 μg/kg,大曲中为62.23 μg/kg,稻壳中达92.54 μg/kg,入池酒醅为53.63 μg/kg,出池酒醅为93.78 μg/kg。
2.2.2 发酵过程中4-MG、4-EG及其前体物质的变化
2.2.2.1 前体变化规律
入池酒醅入窖池后进行无氧发酵,本研究进一步追踪了窖池酿造过程——发酵酒醅中4-EG的前体物质FA和中间产物4-VG的含量变化,其变化规律如图5所示。FA随发酵时间呈现先降低后增加再减少的趋势,在窖池发酵第20天含量最少,为137.49 mg/kg,在第40～50天FA含量迅速升高达到271.88 mg/kg,之后再逐步降低。4-VG的含量呈现先减少后增加的趋势,在窖池发酵第50天含量最低为42.72 μg/kg,之后随发酵时间的增加4-VG含量增加,在出池当天含量达到最大值为192.65 μg/kg。
图5 窖池发酵过程FA和4-VG的动态变化
Fig.5 Dynamic changes of ferulic acid and 4-vinyl guaiacol during pit fermentation
2.2.2.2 4-MG、4-EG变化规律
浓香型白酒发酵过程中(5～70 d)4-MG和4-EG变化规律如图6所示。经分析发现,4-MG和4-EG在50 d之前的变化幅度较小,而在窖池中发酵50 d之后,4-MG和4-EG的含量显著增加。出池酒醅中4-MG的含量达到93.78 μg/kg,此时相较入池第1天的53.63 μg/kg增长74.86%。而4-EG相较入池第1天13.14 μg/kg的含量,在出池达到最大值为53.98 μg/kg,含量增长超过300%。
图6 窖池发酵过程4-MG和4-EG的变化趋势
Fig.6 Dynamic changes of 4-methyl guaiacol and 4-ethyl guaiacol during pit fermentation
3 结论与讨论
3.1 4-EG的前体物质来源分析
混合入池酒醅(JP-ru)由粮食、大曲、稻壳和上餷蒸后酒醅混合而成,除去上餷蒸后酒醅,粮食的占比为70%、大曲和稻壳分别约占15%。去除上餷蒸后酒醅的贡献,根据粮食、大曲和稻壳等原料比例不同,入池酒醅中FA含量约为253.47 mg/kg,根据原料配比,粮食FA贡献约为65.13%、大曲贡献20.69%、稻壳贡献14.18%;入池酒醅4-VG含量约为108.69 μg/kg,稻壳对4-VG贡献值最大约为98.29%、大曲贡献0.28%、粮食贡献1.33%;入池酒醅中4-EG的含量为13.14 μg/kg,粮食贡献34.68%,大曲贡献6.8%,稻壳贡献最大约为58.51%;入池酒醅中4-MG的含量为53.63 μg/kg,其中粮食贡献最大约为48.40%,大曲贡献9.7%,稻壳贡献41.91%。
比较一个发酵周期的白酒酿造原料、大曲、稻壳、入池酒醅以及出池酒醅中的目标产物及前体物质含量发现:出池酒醅与入池酒醅相比,FA的含量降低,4-VG的含量略有增加,4-EG和4-MG的含量均升高,表明4-EG和4-MG均在窖池发酵过程中产生。根据白酒酿造原料和辅料中的含量及酿造原料的比例表明FA主要来自于粮食(贡献率超过60%),4-VG主要来源于辅料中的稻壳(贡献率超过90%)。
3.2 4-MG、4-EG的变化规律分析
由2.2.2节结果分析可知,浓香型白酒发酵过程中,4-MG和4-EG的变化规律可以分为2个阶段:第一阶段(0～50 d),4-MG和4-EG含量增长不显著;第二阶段(50 d-出池),4-MG含量从53.63 μg/kg急剧增长到93.78 μg/kg,4-EG含量从13.14 μg/kg急剧增长到53.98 μg/kg。由此可以看出,4-MG、4-EG的前体物质在发酵前期逐步积累,进入发酵后期4-MG、4-EG开始迅速生成。而相关报道显示,4-EG的形成主要与酵母菌、戴尔福特菌、枯草芽孢杆菌等微生物相关[19-20]。同时,浓香型白酒发酵过程中微生物群落由发酵前期的真菌和酵母,逐步演替为发酵后期细菌占据主导地位[21-23]。据此推断,浓香型白酒发酵前期,以酵母菌为代表的真菌转化FA转化成4-VG;进入发酵后期,相关细菌转化4-VG生成4-EG。此外,我们在可培养分析中从发酵前期样品分离获得1株产4-VG异常威克汉逊酵母(保藏编号为CGMCC No.25203),在发酵后期样品分离获取了多株可代谢生成4-EG的细菌;此结果也验证了上述猜想。综上分析,我们推测:在浓香型白酒发酵过程中,发酵前期真菌和酵母转化FA生成4-VG,进入发酵后期,功能细菌催化4-VG生成4-EG。
本研究初步探究了浓香型白酒生产过程中4-MG和4-EG的代谢规律:4-MG和4-EG主要在发酵后期产生;4-EG首先由发酵前期真菌和酵母转化FA生成得到4-VG;随即进入发酵后期由功能细菌催化代谢4-VG生成4-EG;而4-MG的代谢规律还需要进一步探讨。本研究为揭示白酒发酵过程中4-MG和4-EG代谢机制提供重要理论支撑,同时为定向调控提高4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚的含量提供重要指导,对推动白酒基于风味与健康双导向的品质发展有重要意义。
[1] 胡景辉, 陈禹锜, 薛新新, 等.浓香型白酒发展概述[J].中国酿造, 2022, 41(6):24-30.
HU J H, CHEN Y Q, XUE X X, et al.Overview of development of strong-flavor Baijiu[J].China Brewing, 2022, 41(6):24-30.
[2] 吴继红, 黄明泉, 郑福平, 等.健康白酒的研究进展[J].食品科学技术学报, 2019, 37(2):17-23.
WU J H, HUANG M Q, ZHENG F P, et al.Research progress of healthy Baijiu[J].Journal of Food Science and Technology, 2019, 37(2):17-23.
[3] 张杰, 程伟, 潘天全, 等.浓香型白酒风味成分研究现状及展望[J].酿酒, 2019, 46(1):29-32.
ZHANG J, CHENG W, PAN T Q, et al.Research progress about flavor substances of strong flavour Chinese spirits[J].Liquor Making, 2019, 46(1):29-32.
[4] 孙宝国, 吴继红, 黄明泉, 等.白酒风味化学研究进展[J].中国食品学报, 2015, 15(9):1-8.
SUN B G, WU J H, HUANG M Q, et al.Recent advances of flavor chemistry in Chinese liquor spirits(Baijiu)[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2015, 15(9):1-8.
[5] 孙宝国, 黄明泉, 王娟.白酒风味化学与健康功效研究进展[J].中国食品学报, 2021, 21(5):1-13.
SUN B G, HUANG M Q, WANG J.Research progress on flavor chemistry and healthy function of Baijiu[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2021, 21(5):1-13.
[6] 史冬梅, 王松, 赵东瑞, 等.GC-MS/SIM法检测103种白酒中6种酚类化合物[J].中国食品学报, 2019, 19(4):235-248.
SHI D M, WANG S, ZHAO D R, et al.Determination of 6 phenols in 103 kinds of Chinese Baijiu by GC-MS/SIM[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2019, 19(4):235-248.
[7] JIANG Y S, ZHAO D R, SUN J Y, et al.Analysis of antioxidant effect of two tripeptides isolated from fermented grains (Jiupei) and the antioxidative interaction with 4-methylguaiacol, 4-ethylguaiacol, and vanillin[J].Food Science &Nutrition, 2019, 7(7):2 391-2 403.
[8] ZHAO D R, JIANG Y S, SUN J Y, et al.Anti-inflammatory mechanism involved in 4-ethylguaiacol-mediated inhibition of LPS-induced inflammation in THP-1 cells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(4):1 230-1 243.
[9] 姜利, 刘国英, 王志强, 等.白酒中挥发性酚类化合物馏出规律与含量水平探究[J].酿酒, 2019, 46(2):115-117.
JIANG L, LIU G Y, WANG Z Q, et al.Study on the distillation regularity and content level of volatile phenol compounds in liquor[J].Liquor Making, 2019, 46(2):115-117.
[10] 王松, 史冬梅, 刘国英, 等.液液微萃取分析不同层酒醅原酒的挥发性成分[J].精细化工, 2020, 37(5):1 010-1 017.
WANG S, SHI D M, LIU G Y, et al.Analysis of volatile components of base distillates from different layers of Jiupei via liquid-liquid microextraction[J].Fine Chemicals, 2020, 37(5):1 010-1 017.
[11] 孙金沅, 王松, 陈璐, 等.SAFE法结合GC-MS定量酒醅中39种挥发性生物活性成分[J].中国酿造, 2019, 38(12):140-147.
SUN J Y, WANG S, CHEN L, et al.Quantification of 39 volatile bioactive components in Jiupei by SAFE combined with GC-MS[J].China Brewing, 2019, 38(12):140-147.
[12] 孙啸涛, 王宗元, 刘淼, 等.涡旋辅助液液微萃取结合GC-MS法检测67种白酒中四甲基吡嗪、4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚[J].食品科学, 2017, 38(18):73-79.
SUN X T, WANG Z Y, LIU M, et al.Determination of tetramethylpyrazine-4-methyl guaiacol and 4-ethyl guaiacol in 67 Chinese Baijiu samples by vortex assisted liquid-liquid microextration combined with gas chromatography-mass spectrometry[J].Food Science, 2017, 38(18):73-79.
[13] 吴子阳, 何菲, 李贺贺, 等.采用固相萃取结合高效液相色谱测定清香型白酒中酚类活性化合物[J].分析化学, 2020, 48(10):1 400-1 408.
WU Z Y, HE F, LI H H, et al.Determination of phenolic active compounds in light-aroma Baijiu by solid phase extraction-high performance liquid chromatography[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2020, 48(10):1 400-1 408.
[14] ZHAO D R, JIANG Y S, SUN J Y, et al.Elucidation of the anti-inflammatory effect of vanillin in Lps-activated THP-1 cells[J].Journal of Food Science, 2019, 84(7):1 920-1 928.
[15] BOUDAOUD S, AOUF C, DEVILLERS H, et al.Sourdough yeast-bacteria interactions can change ferulic acid metabolism during fermentation[J].Food Microbiology, 2021, 98:103790.
[16] TRUJILLO-RODR
GUEZ M J, PINO V, PSILLAKIS E, et al.Vacuum-assisted headspace-solid phase microextraction for determining volatile free fatty acids and phenols.Investigations on the effect of pressure on competitive adsorption phenomena in a multicomponent system[J].Analytica Chimica Acta, 2017, 962:41-51.
[17] CHEN L, WANG Z, LIAO P F, et al.The effect of saliva on the aroma release of esters in simulated Baijiu under the impact of high ethanol concentration[J].Journal of Food Composition and Analysis, 2021, 104:104134.
[18] 阿迪拉·吐尔逊塔依, 田永芝, 何诗冰, 等.响应面法优化新疆阿魏中阿魏酸的提取工艺及其抑制酪氨酸酶活性研究[J].化学与生物工程, 2021, 38(3):33-39.
TUERXUNTAYI A, TIAN Y Z, HE S B, et al.Optimization in extraction process of ferulic acid from ferula sinkiangensis K.M.Shen.by response surface methodology and its inhibition of tyrosinase activity[J].Chemistry &Bioengineering, 2021, 38(3):33-39.
[19] 肖澎, 袁华伟, 何桂强, 等.4-乙基愈创木酚转化菌的筛选、鉴定及转化性能的研究[J].食品与发酵工业, 2014, 40(6):44-49.
XIAO P, YUAN H W, HE G Q, et al.Screening identification and the conversional properties of a Bacillus subtilis strain producing 4-ethylguaiacol[J].Food and Fermentation Industries, 2014, 40(6):44-49.
[20] 周金虎, 李良, 方尚玲, 等.窖泥中高产愈创木酚类功能菌的筛选与鉴定[J].食品与发酵工业, 2019, 45(3):64-70.
ZHOU J H, LI L, FANG S L, et al.Screening and identification of functional boateria with high yield guaiacol in the mud[J].Food and Fermentation Industries, 2019, 45(3):64-70.
[21] XU S S, ZHANG M Z, XU B Y, et al.Microbial communities and flavor formation in the fermentation of Chinese strong-flavor Baijiu produced from old and new Zaopei[J].Food Research International, 2022, 156:111162.
[22] WU Q, ZHU Y, FANG C, et al.Can we control microbiota in spontaneous food fermentation?—Chinese liquor as a case example[J].Trends in Food Science &Technology, 2021, 110:321-331.
[23] 韩兴林, 崔磊, 常强, 等.浓香白酒发酵过程中酒醅微生物结构分析[J].酿酒, 2021, 48(1):81-86.
HAN X L, CUI L, CHANG Q, et al.Structural analysis for microorganisms in fermented grains of Chinese strong-flavor Baijiu fermentation[J].Liquor Making, 2021, 48(1):81-86.