传统奶豆腐,蒙语“胡乳达”,是传统游牧民族的一种即食性传统乳制品,是人类公认的可提供人体所需蛋白的重要来源[1]。传统奶豆腐独特风味,可以直接食用或者制成拔丝奶豆腐,也可泡在奶茶中食用[2]。风味来源主要与氨基酸代谢、分解有关,其次与原料乳的乳糖、脂肪和蛋白质含量有关。牛奶的蛋白质被氧化或水解,产生氨基酸与其他风味物质,增加悦人的奶香[3]。其风味还与发酵菌株特性、原料乳中酶的含量息息相关[4]。传统奶豆腐是利用自身携带和环境中微生物发酵,具有一定的地域特色[5-6]。

辅助发酵剂是一种复合型菌株或单一菌株发酵剂,发酵过程中添加单一或混合的益生菌菌种,有利于产品感官品质的提升[7]。ZARAVELA等[8]研究发现添加辅助发酵剂可以改善传统羊奶酪品质特性。添加辅助发酵剂的试验组明显发现pH值的下降速率加快,在发酵过程中加入辅助发酵剂的产品菌量也出现了显著的上升趋势[9]。ZHOU等[10]研究发现添加辅助发酵剂试验组的发酵时间大大缩短,并提高了产品中菌株的潜在风味品质特性。罗天淇等[11]研究同样也发现,添加辅助发酵剂对发酵时间与产酸速率有明显的提高。

本试验是采用辅助混合菌株发酵传统奶豆腐,通过单因素、正交试验进而改善产品的感官品质与风味,因此选取优势乳酸菌进行发酵传统奶豆腐的技术至关重要,本研究为了进一步探究辅助发酵剂对传统奶豆腐的影响并且为传统乳制品的加工与发展提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌株,内蒙古农业大学民族特色乳制品实验室,菌株编号分别为D655、686、NDF10-4、NDF9-3、CH3-1、MN1-1、MN1-4、MN1-5、MN1-7,9株菌。原料乳,内蒙古农业大学益得乳制品厂。对照组样品,商店市售的传统奶豆腐。MRS 固体培养基、液体培养基,脱脂乳培养基。

1.2 仪器与设备

DHP-9052电热恒温培养箱,上海一恒科技有限公司;HH-6数控精密恒温水浴锅,上海福玛实验有限公司;FDU-2200真空冷冻干燥机,日本Eyela公司;TA.XT Express质构仪,英国StableMicroSystem公司;7820紫外分光光度计,美国Agilent公司;XL30电子舌,日本Insent公司;7890B-5977B气相色谱-质谱联用,美国Agilent公司;PEN3电子鼻,德国Airsense 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 传统奶豆腐的制备

原料乳→过滤→自然发酵→酸乳→添加辅助发酵剂→加热→去除脂肪→切割搅拌→加热排乳清→压缩成型→传统奶豆腐。

1.3.2 辅助发酵剂菌株的初筛、复筛

将9株乳酸菌分别接种至MRS肉汤培养基,37 ℃ 24 h恒温培养,接种3代。随后将MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)肉汤菌液接种至灭菌的脱脂乳培养基中发酵至凝乳状态。将发酵脱脂乳按3%(体积分数)接种至自然发酵的全脂牛奶中25 ℃进行发酵,通过凝乳性、产酸、产香、排乳清能力及奶香风味等对菌株进行筛选,经过初筛选后得到的优势菌株,测定其脱脂乳中生长能力与单菌株发酵奶豆腐的质构特性。

生长能力:将菌株活化2代,按3%(体积分数)接种至脱脂乳培养基中25 ℃培养条件下,测定0、3、6、9、12、24 h酸度,测定方法参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》,酚酞指示剂法测定酸度值。

质构特性:将单一菌株发酵奶豆腐,用质构仪进行测定硬度、弹性、内聚性、咀嚼性、胶着度和回复性。

1.3.3 辅助发酵剂菌株鉴定

将复筛得到的菌株活化3代后委托上海凌恩生物科技有限公司进行PCR扩增及测序分析,结果在NCBI基因数据库中进行BLAST比对,分析菌株的同源性,用MEGA5.0软件NJ法构建系统发育树。

1.3.4 辅助发酵剂最佳配比

将试验筛选出的菌株进行1∶1复配,按体积分数3%的接种量接种至灭菌全脂牛奶中,25 ℃发酵。当pH 4.6时达发酵终点制作奶豆腐,并测定奶豆腐酸度和质构。筛选出发酵时间短、酸度适中、质构适宜的菌株配比比例进行配比。按配比比例进行奶豆腐发酵,测定发酵时间、酸度及质构,最终确定传统奶豆腐辅助发酵剂的菌株配比,进行后续试验。

1.4 传统奶豆腐工艺优化实验

1.4.1 单因素实验设计

根据辅助发酵剂添加量、发酵温度和排乳清温度进行单因素试验,研究不同因素对奶豆腐品质的影响。以酸度、弹性和感官评分为指标,进行正交试验确定传统奶豆腐的最佳工艺流程。

(1)发酵剂添加量单因素试验:发酵剂分别以1%、2%、3%、4%和5%(体积分数)的比例接入灭菌的全脂牛奶中,发酵温度为25 ℃、排乳清温度为65 ℃进行试验,确定传统奶豆腐发酵剂添加量。

(2)发酵温度单因素试验:选择21、23、25、27、29 ℃为发酵温度进行产品发酵,发酵剂添加量为3%(体积分数),排乳清温度为65 ℃,确定传统奶豆腐发酵温度。

(3)排乳清温度单因素试验:以55、60、65、70、75 ℃为排乳清温度,发酵剂添加量3%,发酵温度25 ℃,确定传统奶豆腐排乳清温度。

(4)传统奶豆腐感官评定:本试验感官评定是由9名接受过训练的感官人员进行打分,评定指标按照感官评分评定表对传统奶豆腐评定。

1.4.2 正交试验设计

在1.4.1试验结果上,以传统奶豆腐的酸度、弹性、感官评分为指标。设计以发酵剂添加量、发酵温度与排乳清温度为工艺试验变量因素,按4因素3水平进行L9(34)正交试验设计见表1。

1.5 传统奶豆腐风味特性

滋味:采用电子舌测定,参考丛艳君等[12]的方法进行修改。称取待测样品5 g,置于100 mL超纯水中,进行超声处理,使其充分溶解,将其5 500 r/min,离心15 min取上清液过滤,进行测定。

气味:采用电子鼻测定,参考田佳乐[13]的方法进行修改。取5.0 g干燥样品置于顶空瓶中,密封,利用装有10个便携式电子鼻传感器装置进行检测,记录1 min内的响应。

1.5.1 样品准备

取3 g样品加入20 mL顶空瓶中,加盖密封进行测定。

1.5.2 SPME 条件

纤维萃取头:50/30 μm DVB/CARonPDMS;温度:50 ℃;时间:振荡15 min,萃取30 min;振荡速度:250 r/min;解析时间:5 min;GC循环时间:50 min。

1.5.3 GC-MS条件

色谱柱:DB-wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样温度260 ℃;载气He(99.999%);流量1 mL/min;柱温40 ℃保持5 min,以5 ℃/min 升至220 ℃,20 ℃/min升至250 ℃,保持2.5 min;接口温度260 ℃;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;电离方式:EI+,70 eV;扫描方式:全扫描;质量范围20～400。

1.6 数据统计与分析

数据分析汇总使用Excel进行统计。SPSS 21软件对数据显著性分析及数据表示方法。统计结果的可视化采用Origin 2021进行实现。

2 结果与分析

2.1 辅助发酵剂菌株的筛选

发酵性能、发酵风味良好的菌株作为辅助发酵剂重要特性[14],同样也影响产品的品质特性[15]。由表2可知,凝乳性最佳的菌株是D655与NDF9-3,菌株CH3-1、MN1-5、MN1-7的凝乳性较差。产酸能力最佳的为D655、NDF9-3、CH3-1、MN1-1、MN1-7,其余菌株凝乳能力不及以上5株菌。

由图1可知,各菌株发酵后的pH值与凝乳时间具有显著性差异,9株菌株中MN1-1与MN1-7的pH分别为4.75,与4.98,其次为D655,其余菌株的酸度值均较低。MN1-1与MN1-7、D655的菌株具有较强的产酸性能。凝乳时间最长的为NDF10-4与CH3-1。菌株凝乳时间体现菌株的生长与产酸速率[16],凝乳时间短则可以说明菌株的生长与产酸较强。本试验是用来选取发酵传统奶豆腐辅助发酵的菌株,时间不宜过长且需发酵风味良好,否则影响产品质量。最终表2与图1综合分析,根据发酵性能初步筛选菌株D655、686、NDF9-3和MN1-7进行后续试验。

2.2 辅助发酵剂的复筛

发酵过程中的乳酸菌菌株,延缓有害物的生长、降低亚硝酸盐还可增加风味[17]。4株菌在脱脂乳中的生长能力如图2所示,在发酵初期4株菌的酸度变化无显著差异。发酵3 h后菌株D655与菌株686的酸度增长较快,发酵中期菌株D655与菌株MN1-7的酸度增长较快、菌株MN1-7的发酵速度缓慢,MN1-7发酵趋势呈先上涨后下降,发酵24 h时酸度最大的为菌株D655(65 °T)。

由图3可知,单菌株MN1-7发酵奶豆腐的硬度最大,其次分别是菌株686、D655与NDF9-3。

质构是传统奶豆腐在研发与工艺研究的重点考虑测定因素之一,质构中的硬度与其他指标也相应代表在制作时内部结构的改变影响着整体的测定结果[18]。

2.3 辅助发酵剂菌株鉴定分析

测定结果在NCBI中的GenBank数据库中进行BLAST,选取参考菌株进行同源性比对,各菌株与参考菌株的同源性均达到89%及以上。结果如表3、图4所示,比对发现菌株D655与泡菜乳球菌(Lactococcus kimchii)属于同一分支并且同源性达到95%;菌株686与植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)植物乳杆菌属于同一分支,同源性高达100%;菌株MN1-7与粪肠球菌(Enterococcus faecium)属于同一分支同源性为89%;菌株NDF9-3与乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)属于同一分支同源性为100%。

2.4 辅助发酵剂配比优化

由图5-a可知,产酸能力最快的为D655∶MN1-7与D655∶NDF9-3组合,由图5-b可知,试验组D655∶686和D655∶NDF9-3组合质构最接近对照组且最优,因此选择D655∶686和D655∶NDF9-3组合进行后续试验,具体复配方式如表4所示。

由图6可知,复配c组的产酸能力适中,成熟时间最快,且质构数据中硬度最小,弹性、回复性和内聚性最大,咀嚼度显著小于对照组,胶着度最小。综合分析选择菌株配比最佳为D655∶686∶NDF9-3=5∶2∶3。

2.5 传统奶豆腐制作工艺优化

2.5.1 辅助发酵剂对传统奶豆腐的影响

由图7-a可知,随着辅助发酵剂的添加,奶豆腐的弹性与感官评分总体呈先上升后下降的趋势,当添加量为3%时感官评分最佳。图7-b可知,随着发酵温度的上升,酸度、弹性和感官评分均呈先上升后下降的趋势,发酵温度25 ℃时是菌株最适宜的生长温度。温度影响菌株的发酵速率,菌株的代谢产物也会随之发生明显变化,进而影响产品质量[19]。适宜温度发酵的产品组织状态光滑,感官品质较高[20]。图7-c可知,产品的酸度随着排乳清温度的增加而增加,酸度增加可能是温度升高加速发酵,导致发酵结束后少量营养残余,促使菌株后发酵[21],使得产品的酸度增大。弹性与感官评分的变化趋势是因为随着温度增高,水分含量减少,质构与风味变差从而影响感官品质。因此选择65 ℃时排乳清最佳。

2.5.2 传统奶豆腐制作工艺正交试验分析

在单因素的基础上,以辅助发酵剂添加量(A),发酵温度(B)和排乳清温度(C)为影响因素,以弹性、酸度和感官评分为评价指标,采用L9(34)正交设计,正交试验结果见表5。

在正交试验结果基础上,对3组最佳组合进行验证试验。由表6可知,感官评分是代表产品的风味、滋味较好。综上结果表明最佳组合为A2B2C1,弹性为0.92±0.05、酸度为(70±1.2) °T、感官评分为83±0.2。即辅助发酵剂的添加量3%、发酵温度25 ℃、排乳清温度60 ℃。

2.6 辅助发酵剂制备传统奶豆腐

2.6.1 感官评定分析

由图8可知,试验组感官评分指标均高于对照组。试验组整体得分为84.55±0.65,相比市售奶豆腐(81.56±0.52)整体提高了3%。试验组与对照组组织状态差距明显大于其他指标,说明添加辅助发酵剂对发酵产品的组织状态有显著提高,可能是发酵剂加速了产酸,导致pH值下降,胶体磷酸钙的析出加速酪蛋白的聚集使得结构致密[22],添加辅助发酵剂利于提高奶豆腐的感官。

2.6.2 滋味、气味特性

如图9所示,运用电子舌对比添加辅助发酵剂的奶豆腐与市售奶豆腐味道方面的差异。试验组与对照组的酸味、丰富度、回味-B、回味-A、甜味和咸味有显著差异。试验组酸味、丰富度、回味-B、回味-A和甜味低于对照组是由于两产品在制作过程中的微生物群落不同,导致发酵产物的不同,由于对照组的环境微生物大于试验组导致发酵风味过大,检测时响应值过大。咸味在整体响应值中最大可能是矿物质含量高导致[23]。

由表7发现,试验组与对照组在W5S(对氮氧化物敏感)、W6S(对氢敏感)、W3S(对甲烷)有差异显著(P<0.05),说明试验组与对照组发酵后产生的氮氧化合物、氢化物、烷烃物质有明显的不同,说明辅助发酵剂对奶豆腐气味有较大影响。

2.6.3 风味特征

采用GC-MS分别对试验组与对照组奶豆腐进行挥发性风味物质测定,试验组共检测出52种风味物质,对照组检测出42种风味物质。由图10-a可知,试验组中的风味物质分离较好,物种丰富。

将被测的试验组与对照组数据结果进行化学物质分类,由图10-b可知,试验组的风味物质均高于对照组,说明辅助发酵剂有助于产品风味的提高。酸类物质在风味中占主体地位,其次为醇类、酯类、烷烃类、醛类及其他。酸类是传统奶豆腐的重要风味物质。由图10-b可知,试验组总酸含量为18 923 mg/100 g,主要为苯甲酸、丁酸、异丁酸、戊酸、庚酸、辛酸,对照组的总酸含量为3 006.709 mg/100 g。不同的酸类物质给奶豆腐带来了不同风味,研究表明辛酸与癸酸的含量影响产品的奶香味,二者含量越高奶香越浓郁[24-25]。辛酸有助于人体的消化吸收[26],进而提高奶豆腐的营养价值。

试验组共检测到10种醇类物质,总量为3 137.76 mg/100 g,对照组共检测到6种醇类,总量为973.2 mg/100 g。试验组的醇类物质含量较高,可能是试验组的脂肪酸、氨基酸含量大于对照组,醇类物质是由脂肪氧化或脂肪酸发生降解得到的一类风味物质,具有甜香或香蕉香气[27]。试验组共检测到11种酯类物质,总量为2 001.476 mg/100 g,对照组为404.977 4 mg/100 g。脂类物质可以分解产生芳香物质,在高温条件下挥发性较强且具有独特的奶香味[28]。试验组共检测到7种醛类物质,总量为1 118.717 mg/100 g,对照组总量为293.07 mg/100 g。被检测到的醛类物质中乙醛含量较多占主体,赵建新等[29]研究发现乙醛对风味影响较大。醛类物质主要是由氨基酸的降解生产,是发酵乳中具有重要地位的风味物质[24]。

3 结论

本文对传统奶豆腐发酵技术进行改善,复配适合生产传统奶豆腐的菌株进行试验。对9株实验室供试菌株进行凝乳性、产酸、产香、风味以及排乳清能力与发酵24 h的pH值与凝乳时间为初步筛选,筛选出4株发酵特性较好的菌株分别为:D655、686、NDF9-3与MN1-7。验证菌株发酵能力,发现菌株D655的产酸能力最强,其次为686、MN1-7、NDF9-3,单菌株发酵奶豆腐发现4株菌均可用于发酵生产奶豆腐。经过16S rDNA检测,D655、686、NDF9-3与MN1-7分别检测为泡菜乳球菌(Lactococcus kimchii)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)与粪肠球菌(Enterococcus faeciums)。对4株菌进行配比发酵,测其酸度、发酵终点时间与质构特性得到最佳组合为D655∶686∶NDF9-3=5∶2∶3。经单因素试验最终确定辅助发酵剂的添加量3%、发酵温度25 ℃、排乳清温度65 ℃。此时试验组的奶豆腐品质最佳。GC-MS其结果显示,试验组的风味物质均高于对照组,说明辅助发酵剂有助于产品风味的提高。酸类物质在风味中占主体地位,其次为醇类、脂类、烷烃类、醛类以及其他。本研究进一步探究了辅助发酵剂对传统奶豆腐的影响,同时为传统乳制品的加工与发展提供参考价值。

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Flavor characteristics of traditional Hurood based on auxiliary starter

YANG Yang1, CE Ligeer1, ZHANG Zhigang1, SUN Lishan2, SHUANG Quan1

1(College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China) 2(Zhenglan Banner Changhong Dairy Factory, Hohhot 027200, China)

ABSTRACT Taking lactic acid bacteria isolated from Hurood as the research object, the lactic acid bacteria with strong acid producing ability, good flavor, and short fermentation time were screened, then the fermentation acidity, fermentation end time, and texture characteristics were determined to confirm the matching combination of traditional Hurood assisted starter strains. The optimal production technology of traditional Hurood was selected by single factor and orthogonal experiment of auxiliary starter. The results showed that there were four strains of lactic acid bacteria with strong acid producing ability, good flavor, and short fermentation time. After 16S rDNA sequence analysis, strains D655, 686, NDF9-3, and MN1-7 were identified as Lactococcus kimchii, Lactiplantibacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, and Enterococcus faecium respectively. The results of the fermentation experiment showed that the optimal combination was D655∶686∶NDF9-3=5∶2∶3, which was used as the auxiliary fermentation agent. The product elasticity, acidity and sensory score were used as the indexes to optimize the process. The optimal supplemental amount of auxiliary starter was 3%, fermentation temperature was 25 ℃, and whey temperature was 65 ℃, while the Hurood elasticity was (0.92±0.05) g, acidity was (70±1.2) °T, and sensory score was (83±0.2). The flavor substances in the experimental group were higher than those in the control group, while acids were the main flavor substances, followed by alcohols, lipids, alkanes, aldehydes, and others. In summary, the experimental group had better flavor with strong milk flavor as the traditional dairy products.

Key words Hurood; strain ratio; single factor test; orthogonal test; flavor profile

第一作者：博士研究生(双全教授为通信作者,E-mail:shuangquan@imau.edu.cn)

基金项目：内蒙古自然科学基金项目(2021MS03059);锡林郭勒盟科技计划项目(202117)

收稿日期：2022-08-25,改回日期：2022-09-28

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033436

引用格式：洋洋,策里格尔,张志刚,等.基于辅助发酵剂制备传统奶豆腐的风味特性研究[J].食品与发酵工业,2023,49(11):93-101.YANG Yang, CE Ligeer, ZHANG Zhigang, et al.Flavor characteristics of traditional Hurood based on auxiliary starter[J].Food and Fermentation Industries,2023,49(11):93-101.