豆腐作为一种美味又营养的传统美食,长期以来深受亚洲人民的青睐。近年来,随着越来越多的人意识到大豆基植物食品对身体健康的益处,豆腐的全球消费量快速增加[1]。然而,豆腐因其具有高蛋白、高含水量(>80%)和偏中性pH(5.8～6.2)等特性,极易腐败变质,在常温且未包装的条件下存放1～2 d就会逐渐丧失可食用品质,无法远距离销售,限制行业发展[2]。为了延长豆腐保质期,将其预包装和巴氏杀菌之后进行0～10 ℃冷链销售,是目前企业常用的方法。此外,壳聚糖[3]、姜黄素[4]、豆腐柴叶提取液[5]等具有抑菌活性物质或天然提取物尝试加入到预包装豆腐中,取得了一定的保鲜效果。另外,微生物保鲜、抗菌涂膜等新兴技术相继用于延缓豆腐的变质[2,6]。这些方法虽在不同程度上提高了豆腐的保质期和安全性,但是也显著改变了产品感官特性,大幅增加了企业成本,因而较少用于预包装豆腐工业化生产。
壳寡糖(chitosan oligosaccharides,COS)作为甲壳素或壳聚糖的水解产物,是由2～20个重复的β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖组成的线性聚合物。研究表明壳寡糖具备抗氧化、清除自由基以及抑菌等多种生物活性,在食品保鲜等领域有着广泛的应用[7-8]。当前研究多集中于不同浓度壳寡糖对金枪鱼[9]、冷鲜牛肉[10]、水蜜桃[11]等生鲜食品的保鲜作用。此外很多研究证实,壳寡糖的抑菌效果除了与其浓度直接相关外,还受到聚合度、分子质量、脱乙酰度等因素的影响[7]。其中聚合度被认为是重要因素,例如ZHAO等[12]发现不同聚合度的壳寡糖单体对沙门氏菌抑菌效果有明显差异。但是,不同聚合度的壳寡糖对豆腐等生鲜食品的保鲜效果是否存在差异性有待深入研究。
目前,壳寡糖的制备方法主要有化学法、物理法和酶法,其中酶法因其反应条件温和、过程及产物可控、环境友好等优势而成为主流[13]。大量研究显示,壳聚糖酶作为特异性酶,相比于蛋白酶、纤维素酶等非特异性酶,水解效率更高,更适合制备壳寡糖[12]。壳聚糖酶能从壳聚糖内部随机切割β-1,4-糖苷键,从而产生不同聚合度壳寡糖混合物。在前期研究中,本课题组通过重组表达以及纯化获得了吸水链霉菌R1(Streptomyces hygroscopicus R1)壳聚糖酶ShCsn46[14]。重组ShCsn46良好的酶学特性,适用于不同聚合度壳寡糖可控制备。本论文通过重组ShCsn46制备不同聚合度壳寡糖并且研究不同聚合度壳寡糖对预包装豆腐的保鲜效果,为壳寡糖在预包装豆腐保鲜产业化应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
非转基因大豆,劲仔食品集团股份有限公司提供;平板计数琼脂培养基,广东中山百微技术有限公司;95%脱乙酰度胶体壳聚糖,上海源叶生物科技有限公司;标准品:不同聚合度壳寡糖(壳二糖至壳六糖),青岛博智汇力生物科技有限公司;薄层层析硅胶板,德国默克公司;氯化钾、氧化镁、硼酸、三氯乙酸、浓硫酸、石油醚、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾等化学试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
SJJ-20熟浆集成机,北京康得利科技有限公司;UltiMate3000高效液相色谱仪,美国赛默飞世尔科技公司;FE28-CNpH计,瑞士Mettler Toledo公司;CR-400 色差计,日本Konica Minolta公司;TA1质构仪,英国Lloyd公司;I-nose电子鼻,上海昂申智能感官科技有限公司;Scientz-04微生物均质机,宁波新芝科技有限公司;半微量定氮装置,江苏汇达医疗器械有限公司;SW-CJ-2D双人单面垂直超净工作台,江苏智净净化设备有限公司;101-1AB电热恒温干燥箱,北京中兴伟业世纪仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 壳寡糖酶法可控制备
壳寡糖酶法可控制备所用底物均为95%脱乙酰度胶体壳聚糖,总反应体积为200 mL。按照不同酶添加量(1、3、20、50 U/mL)将前期纯化获得的壳聚糖酶ShCsn46加入反应体系,在50 ℃,100 r/min反应1 h。采用薄层层析分析(thin layer chromatography,TLC)分析水解产物壳寡糖的组成,采用HPLC法分析不同聚合度壳寡糖的浓度,TLC和HPLC均参照报道的方法进行[14]。
1.3.2 豆腐的制作及预包装
豆腐制作流程如下:
大豆→清洗→浸泡→磨浆→浆渣二次共熟→过滤→点浆(酸浆为凝固剂)→蹲脑→破脑→压榨→切块→加入壳寡糖溶液→包装→巴氏杀菌→低温贮藏
酸浆豆腐按照HUANG等[15]的方法制作而成,并将其切成小块(质量为60 g,尺寸约为4.0 cm×3.0 cm×3.0 cm),随机选取3块豆腐装入已灭菌的预包装盒中。接着,随机分成4组,其中3组分别加入聚合度为2～4、2～5和2～6的COS溶液(质量浓度均为4 mg/mL),依次记为COS-2-4、COS-2-5和COS-2-6;1组加入无菌水(对照组,记为CON)。豆腐与浸泡液的质量体积比是1∶1,以确保溶液完全淹没豆腐。所有样品经175 ℃、6 s热封口包装后,85 ℃水浴巴氏杀菌30 min,立即用流水冷却降至室温,于10 ℃中贮藏15 d。每3 d(即第0、3、6、9、12、15 天)取样1次,分别测定各组样品的微生物、理化和感官指标。
1.3.3 微生物指标的测定
菌落总数(total viable count,TVC)参照GB 4789.2—2022《食品微生物学检验 菌落总数测定》进行测定。微生物计数单位为lgCFU/g。
1.3.4 理化指标的测定
1.3.4.1 pH值
参照GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》。
1.3.4.2 挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)
参照GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》半微量定氮法。
1.3.4.3 蛋白质含量
参照GB 5009.5—2006《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法。
1.3.4.4 脂肪含量
参照GB 5009.6—2006《食品中脂肪的测定》索氏抽提法。
1.3.4.5 水分含量
参照GB 5009.3—2006《食品中水分的测定》直接干燥法。
1.3.4.6 持水力
参考宁云霞等[16]的方法,将豆腐切成约3 mm厚的薄片,精确称取2.0 g(m2),用滤纸包裹,于6 000 r/min、15 ℃中离心10 min,立即去掉滤纸,精确称取样品质量(m1,g),按公式(1)计算持水力,重复测定5次。
持水力
(1)
1.3.5 感官指标的测定
1.3.5.1 质构特性
采用P35圆柱形探头、TPA模式测定,设置预载应力为0.05 N,压缩速度和提升速度分别为40 mm/min和30 mm/min,两次间隔时间为5 s。样品切成边长2 cm的正方体,采用3点取样法进行测定,取平均值。
1.3.5.2 风味
参照电子鼻气味识别法[17],将样品用拍打器拍碎后,精确称取(5.0 ± 0.2) g样品,剪碎后放入10 mL采集瓶中密封待测。测定参数:平衡温度25 ℃,时间20 min;采样间隔1.0 s,测定时间60 s,清洗时间60 s;传感器室流量300 mL/min,样品流量300 mL/min。数据进行PCA主成分分析。
1.3.5.3 感官评价
微调黄宝玲等[18]的方案,邀请食品专业学生男女各6人,感官培训后,采用盲评法按百分制对样品色泽、气味、组织状态和断面结构进行评分,感官评分标准见表1。
表1 预包装豆腐感官评分标准表
Table 1 Sensory scoring standard of prepackaged tofu
评价指标评价标准分值色泽(20分)乳白色或淡黄色,均一,有光泽16～20白或偏黄色,均一11～15深黄色,无光泽1～10气味(30分)具有浓郁的豆腐香味26～30有淡豆香味,无异味11～25无豆香味,有异味6～10有浓重臭味1～5 组织状态(30分)质地细腻、有弹性、表面不黏26～30质地较细腻、软硬适中、表面不黏11～25质地欠细腻、偏软、表面略黏6～10质地差、弹性差、表面黏1～5 断面结构(20分)断面光滑平整、无孔16～20断面较光滑平整、有少量孔11～15断面不光滑、表面粗糙、有较多孔1～10
1.4 数据处理
每个实验指标做3个平行,结果表述为平均值±标准差。采用IBM SPSS 21.0和Origin 2019软件对实验数据进行分析和作图,通过Duncan′s进行显著性分析(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 壳寡糖酶法可控制备
不同ShCsn46酶添加量下水解产物中壳寡糖组成及浓度如图1所示。当酶添加量为2、6 U/mL,水解产物主要包括壳二糖至壳六糖(COS-2-6)以及壳二糖至壳五糖(COS-2-5)(图1-A);当酶添加量增加至20、50 U/mL,水解产物则由壳二糖至壳四糖(COS-2-4)组成(图1-A)。HPLC检测结果(图1-B)表明,当酶添加量为2 U/mL,水解产物中壳二糖至壳六糖的质量浓度分别为3.75、6.32、9.65、9.68、8.83 mg/mL;当酶添加量为6 U/mL,水解产物中壳二糖至壳五糖的质量浓度分别为8.91、11.25、10.78、6.98 mg/mL;当酶添加量为20 U/mL,水解产物中壳二糖至壳四糖的质量浓度分别为12.86、13.69、12.03 mg/mL。
A-壳寡糖组成;B-壳寡糖浓度
图1 壳聚糖酶ShCsn46不同添加量下水解产物中 壳寡糖组成和浓度分析
Fig.1 Analysis of the composition and concentration of COS in hydrolysates addition with different amounts of chitosanase ShCsn46
2.2 不同聚合度COS对预包装豆腐菌落总数的影响
由表2可知,预包装豆腐初始TVC未检出,与LEE等[19]报道的预包装豆腐情况是一致的。各组预包装豆腐冷藏前期的菌落总数增长缓慢,到了后期快速升高。其中对照组样品的TVC增幅最快,贮藏第9天时的TVC已达5.87 lgCFU/g,已超过DB33/529—2005《散装及预包装豆制品质量安全要求》规定的腐败限制(5 lgCFU/g),因此对照组在第9天时失去食用价值。而黄宝玲等[18]发现酸浆豆腐在 4 ℃冷藏第6天时已不宜食用,少于本研究对照组的货架期,可能由于文献[18]中的实验未对样品进行包装,增加了贮藏期细菌污染的几率。不过,COS各组的TVC始终低于对照组,且在第15天时TVC仍小于5 lgCFU/g,说明COS能较好地抑制豆腐中微生物的生长繁殖。COS的抑菌效应普遍认为与其所带正电荷基团(—NH3+)有关,通过—NH3+与微生物细胞膜上脂多糖、脂蛋白等负电荷成分的相互作用影响了细胞膜的完整性和通透性,从而扰乱微生物正常的新陈代谢[8]。值得注意的是,COS-2-6组样品的TVC在整个贮藏期内均低于COS-2-4和COS-2-5组。HOSSEINNEJAD等[20]总结了不同聚合度COS抑菌差异性的机制,某种程度上阐释了本研究中3组COS混合物抑菌表现不同的原因。
表2 不同聚合度COS对冷藏预包装豆腐TVC的影响
Table 2 Effect of different degrees of polymerization of COS mixture on total numbers of colony of prepackaged tofu during refrigerated storage
组别TVC(lgCFU/g)03691215COS-2-4<11.56±0.02b2.12±0.01b2.95±0.02b3.68±0.06b4.56±0.04bCOS-2-5<11.32±0.02b1.85±0.02c2.49±0.02c3.26±0.07c3.82±0.04cCOS-2-6<11.15±0.01b1.62±0.02c2.14±0.03d2.99±0.02d3.35±0.05dCON<13.24±0.10a3.57±0.04a5.87±0.05a7.76±0.02a9.86±0.05a
注:<1表示未检出;同列中不同小写字母表示组间存在显著性差异 (P<0.05)(下同)
2.3 不同聚合度COS对预包装豆腐pH和挥发性盐基氮的影响
如图2-A所示,豆腐的初始pH为6.13,与黄宝玲等[18]报道的酸浆豆腐pH值(6.03)接近。贮藏第3天,各组豆腐的pH值均显著下降(P<0.05),这与乳酸菌豆腐pH值变化趋势是基本一致[2]。但是,KIM等[3]报道壳聚糖豆腐的pH值在4 ℃贮藏前10 d变化不大。由此推断,pH值下降明显可能是酸浆中乳酸菌在样品降温阶段继续生长并产生有机酸所致。此外COS组的pH值均显著低于对照组,可能由于壳寡糖溶液中存在少量醋酸,呈酸性,游离H+较多。贮藏第6天各组样品pH值均有不同程度的升高,而后趋于平缓。LIU等[21]报道,新鲜豆腐在变质腐败之后pH略有升高。根据前人报道[2],COS组样品pH值升高缓慢的原因可能是壳寡糖能抑制微生物繁殖,从而减少了多肽、氨基酸以及胺类等碱性代谢物的产生。
TVB-N是反映食品腐败程度的重要指标,主要受腐败微生物的影响。与pH变化趋势不同,各组豆腐TVB-N含量随贮藏的延长呈上升趋势(图2-B)。对照组TVB-N值由初始的1.80 mg/100 g急剧增加至贮藏15 d的15.96 mg/100 g,说明豆腐腐败进程较快。而COS组相比于对照组显著降低了56%～66%,说明COS能较好地延缓豆腐的变质,YU等[22]使用COS处理鲤鱼鱼片后也有类似的TVB-N变化趋势。
2.4 不同聚合度COS对预包装豆腐蛋白质及脂肪的影响
由图3可知,各组豆腐的蛋白质和脂肪含量均随贮藏时间的延长而持续降低,前6 d下降程度均较小,而贮藏6～15 d时对照组下降程度明显大于COS组。根据李除夕[23]的报道,腐败微生物可以利用豆腐所含蛋白质、脂肪等营养成分而生长繁殖,并在这过程中将蛋白质分解成多肽、生物胺、吲哚和硫化氢等物质,将脂肪分解成脂肪酸、甘油等物质。这些降解产物中的水溶性成分逐渐溶入浸泡液中,挥发性成分则弥散于包装盒内空隙中,这可能是造成豆腐中蛋白质和脂肪含量减少的重要原因。后文感官评定结果可佐证该观点。
A-pH;B-挥发性盐基氮
图2 不同聚合度COS对冷藏预包装豆腐pH与 挥发性盐基氮的影响
Fig.2 Effect of different degrees of polymerization of COS on pH and TVB-N of pre-packaged tofu during refrigerated storage 注:图中同列不同小写字母表示组间存在显著性差异(P<0.05)(下同)
2.5 不同聚合度COS对预包装豆腐水分含量与持水力的影响
水是豆腐的主要成分之一,对保持豆腐的质量稳定和结构组成有着重要影响[1]。由图4-A可知,各组豆腐样品在贮藏前3 d升高,而后略微降低,最后趋于平缓,说明贮藏前期部分浸泡液可能通过扩散作用进入豆腐凝胶内部或间隙,随着越来越多的微生物代谢产物融入浸泡液中,水分扩散逐渐平衡。由图4-B可知,在15 d贮藏期间,各组样品的持水力表现出相似的下降趋势。在凝胶体系中,水可以与多糖和蛋白质的官能团耦合,也可以被束缚在凝胶网络的微小网格或空隙中[24]。在豆腐腐败过程中,蛋白质变性降解,凝胶结构逐渐被破坏,固水能力逐渐降低,水分子被释放,表现为持水力下降。结合图4-A结果判断,贮藏期豆腐水分含量的增量部分多以自由水形式存在。此外COS组的持水力始终显著大于对照组(P<0.05),这可能是因为壳寡糖可以渗透至豆腐的组织间隙中,进而通过其亲水基团而结合更多的水分子,使游离水转化为结合水。
A-蛋白质;B-脂肪
图3 不同聚合度COS对冷藏预包装豆腐蛋白质与脂肪的影响
Fig.3 Effect of different degrees of polymerization of COS on protein and fat of pre-packaged tofu during refrigerated storage
2.6 不同聚合度COS对预包装豆腐感官品质的影响
由图5-A可知,各组感官评分随贮藏时间的延长而降低,说明豆腐品质相应下降。贮藏第3天,各组的感官评分介于84～93分,表明各组豆腐在贮藏前3 d均能保持较好的食用品质。从第6天起,对照组的感官评分呈现快速下降趋势;第9天感官得分为59分,低于感官可接受的最低限值(60分),此时豆腐表面发黄、弹性不足,打开包装有较浓的发酵味,而浸泡液出现浑浊(图5-B);第12天和第15天,豆腐有明显的馊臭味,腐败现象严重。结合感官评分和菌落总数结果可以判定,对照组样品在10 ℃下贮藏超过6 d不宜食用且存在安全风险。相比之下,COS组在整个贮藏期的感官评分均显著高于对照组(P<0.05),第15天时,COS-2-4、COS-2-5和COS-2-6组的感官评分分别为76、82、86分,仍高于感官不可接受的阈值,表明COS处理有利于延长冷藏预包装豆腐的货架期。COS组间比较,COS-2-6组的感官评分下降率最低,在一定程度上说明COS-2-6对预包装豆腐的保鲜效果要优于COS-2-4和COS-2-5组。
A-水分含量;B-持水力
图4 不同聚合度COS对冷藏预包装豆腐水分含量与 持水力的影响
Fig.4 Effect of different degrees of polymerization of COS on moisture content and water-holding capacity of pre-packaged tofu during refrigerated storage
2.7 不同聚合度COS对预包装豆腐质构的影响
由图6可知,各组样品的硬度、咀嚼性和弹性均随贮藏时间的延长先趋于稳定后快速降低。郑玉玺[25]研究结果显示,内酯豆腐在4 ℃冷藏下咀嚼性和弹性逐渐降低,而硬度先增大后降低。以往研究显示,凝胶网络结构的致密程度及连续性与豆腐硬度等质构密切相关[1,15]。李除夕[23]研究表明,芽孢杆菌等腐败菌在贮藏后期将分泌蛋白酶降解蛋白,从而破坏豆腐凝胶网络,最终导致豆腐质构特性的改变。在整个贮藏期,COS-2-6组的硬度、咀嚼性和弹性均高于其他COS组和对照组,可能由于COS-2-6混合物抑菌活性更强,延缓豆腐腐败的效果更好。
A-感官评分;B-感官图片
图5 不同聚合度COS对冷藏预包装豆腐感官品质的影响
Fig.5 Effect of different degrees of polymerization of COS on sensory quality of pre-packaged tofu during refrigerated storage
2.8 不同聚合度COS对预包装豆腐气味的影响
根据I-Nose公司说明[26],S2对氮氧化合物,低分子胺类:如甲胺、二甲胺等敏感;S3对硫类化合物,如硫醇、硫醚、二丙烯基二硫化合物敏感;S10对碳氢化合物:如甲烷、乙烷敏感。由图7-A可知,随着贮藏时间的延长,S2、S3、S10类型的传感器的响应值越来越大(P<0.05),说明产品中不良气味主要是生物胺、硫化氢等物质贡献的。
A-硬度(图上)、咀嚼性(图下);B-弹性
图6 不同聚合度COS对冷藏预包装豆腐质构的影响
Fig.6 Effect of different degrees of polymerization of COS on texture of pre-packaged tofu during refrigerated storage
A-COS-2-4;B-COS-2-5;C-COS-2-6;D-CON;
图7 不同聚合度COS对冷藏预包装豆腐雷达图的影响
Fig.7 Effect of different degrees of polymerization of COS on radar diagram of pre-packaged tofu during refrigerated storage
不同贮藏期电子鼻主成分分析(principal component analysis,PCA)结果如图8所示,不同样品第3天PCA1的方差贡献率为83.57%,PCA2方差贡献率为8.03%,二者之和为91.60%(图8-A);不同样品第15天PCA1的方差贡献率为87.03%,PCA2方差贡献率为6.22%,二者之和为93.25%(图8-B);两图的方差贡献率之和皆大于90%,表明几乎可以覆盖所有的变量信息。由图8-A可知,第3天之前的各组分散在4个象限中,表明各点相差不大,COS-2-4组、COS-2-6组与新鲜样品组相距最近,说明三组的样品差异性不大。由图8-B可知,第15天,新鲜样品落在第一和第四象限,COS-2-6组大部分落点位于第四象限,与新鲜样品组相距最近,表明产品新鲜度最高。与新鲜样品组相比,COS-2-5组落点继续远离,COS-2-5组与COS-2-6组之间有交集,气味较为接近,COS-2-4组与COS-2-6组之间没有交集,气味已经不同,无菌水组单独落在第二象限,产生的气味与其他组最为不同,与感官评分结果相同。
A-不同样品第3天PCA;B-不同样品第15天PCA
图8 不同聚合度COS对冷藏预包装豆腐主坐标分析的影响
Fig.8 Effect of different degrees of polymerization of COS on PCA of pre-packaged tofu during refrigerated storage
3 结论
本研究通过调节壳寡糖酶ShCsn46添加量制备了不同聚合度壳寡糖混合物COS-2-4、COS-2-5和COS-2-6,并证实COS-2-4、COS-2-5和COS-2-6处理预包装豆腐均能抑制微生物的生长和含氮物积累,减缓pH值升高以及蛋白质和脂肪的损失,保持了较好的感官特性。对照组预包装豆腐在贮藏第9天时,TVB-N含量达15.96 mg/100 g,菌落总数为5.87 lg CFU/g,感官评分仅59分,即豆腐已经变质。COS-2-4、COS-2-5和COS-2-6均能有效延缓豆腐腐败变质,在冷藏15 d后仍可食用。通过对比3组壳寡糖对冷藏豆腐的保鲜效果,COS-2-6组在豆腐感官评分、TVC、TVB-N含量、持水力等指标上有更佳的表现,可优先选择用于豆腐的保鲜。因此,壳寡糖酶ShCsn46可控制备适宜聚合度的壳寡糖为预包装豆腐的保鲜应用提供了一个有效的方法。
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