儿茶素功能化ZnO/Ag纳米复合材料的制备及其抑菌性能研究

致病菌盛行以及抗生素耐药给人类健康造成巨大挑战,开发安全高效且具有成本效益的抗菌剂已经成为趋势[1]。近年来,人们对多种抗菌材料——天然、有机以及无机物质,都进行了深入研究[2-5]。纳米技术的发展使得抗菌剂开发有了突破性进展。金属纳米材料,如Ag、ZnO、Zn、TiO2、Cu,表现出优异的抗菌性能,引起人们极大关注,被认为是极具应用前景的抗菌剂,有望发展为具有潜力的广谱抗菌剂,从而替代传统抗生素以解决耐药性问题[4-5]。

近年来,合金纳米复合材料因其优异的理化性能及多重功能而广受人们关注,其理化性质因其组成不同而不同,合理设计可以实现功能多样性[6-7]。氧化锌以及银纳米材料经证实可抑制多种细菌生长[8-9],且具有一定的协同作用,通过合理设计,可以合成具有优异抑菌活性的ZnO/Ag纳米复合材料[7]。目前,制备合金纳米材料的方法多样,以植物中活性成分作为还原剂绿色合成纳米材料的方法,因其合成绿色安全、简单快捷以及成本低等优点成为了近年来的研究热点[5,10]。

根据报道,以儿茶素为还原剂,成功合成了儿茶素-ZnO纳米复合材料以及儿茶素-Ag纳米复合材料,并证实所合纳米复合材料具有广谱抗菌性,表明儿茶素是金属纳米材料绿色合成的潜在还原剂[11-12]。儿茶素为多酚类化合物,具有一定的抑菌、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等作用[13]。以儿茶素为还原剂以及稳定剂,水热合成ZnO/Ag纳米复合制剂,有望实现儿茶素自身抗菌性协同合金纳米制剂抗菌性,从而提高纳米制剂的抗菌性能。而关于儿茶素功能化ZnO/Ag纳米复合材料的绿色合成,目前未有深入研究。本研究以植物活性成分儿茶素作为绿色还原剂和稳定剂,通过多次预实验优化合成方案,最终成功制备了亲水性儿茶素功能化ZnO/Ag纳米复合材料,并对所得纳米复合材料进行抑菌性能研究。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

儿茶素,纯度≥98%,生工生物工程(上海)股份有限公司;ZnCl2,纯度≥98%,上海恒远生物科技有限公司;AgNO3,优级纯,科欧密化学试剂公司;NH3·H2O、CH3COOH,分析纯,天津富宇化工公司;营养琼脂、营养肉汤,青岛海博生物;注射用青霉素钠,哈药集团;大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色念珠菌(Candida albicans),黑龙江省农科院应用微生物学研究所;斑马鱼,山东一溪月生物科技有限公司;超纯水,电阻率>18 MΩ·cm,实验室自制。

UV-5500紫外-可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;IR Affinity-1傅里叶变换红外光谱仪,日本岛津公司;JEM-2100透射电子显微镜,日本电子公司;PHI5700ESCA X光电子能谱仪,System美国物理电子公司;PHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料的制备

称取0.232 0 g儿茶素,250 mL超纯水定容,配制得3.2 mmol/L儿茶素水溶液;称取2.500 0 g ZnCl2,50 mL超纯水定容,配制得0.367 mol/L ZnCl2水溶液;称取2.500 0 g AgNO3,50 mL超纯水定容,配制得0.294 mol/L AgNO3水溶液。取40 mL上述儿茶素水溶液,加入0.175 mL上述氯化锌溶液和0.225 mL 上述硝酸银溶液,使得反应体系中氯化锌与硝酸银的摩尔比为1∶1,混匀,30 min后测得反应溶液pH值为6.15。利用氨水/冰醋酸将反应溶液pH值调至8.00,而后将上述溶液转移至50 mL的高压反应釜中,并在140 ℃下保持4 h。待温度达到室温后收集反应溶液,将其高速离心,弃去上清液,所得固体50 ℃下干燥12 h,即得儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料。

1.3 表征方法

紫外-可见分光光谱仪(ultraviolet-visible spectroscopy,UV-vis):将所制备的儿茶素-ZnO/Ag胶体溶液移至石英比色皿中,以进行UV-vis吸收光谱测定,波长范围为200～800 nm。透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM):将5 μL儿茶素-ZnO/Ag胶体测试液滴在碳膜铜网上,室温风干以进行TEM成像,工作电压200 kV。能谱仪(energy dispersive spectroscopy,EDS):协同TEM测试,通过EDS同步分析纳米复合材料的元素组成。X射线光电子能谱仪(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS):样品的表面元素由XPS分析,X射线(Mg Kα)能量为1 253.6 eV。傅里叶红外光谱仪(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR):采用溴化钾压片法对儿茶素和儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料进行FTIR测试,波数范围为4 000～400 cm-1。

1.4 抑菌性能研究

选取革兰氏阳性细菌——大肠杆菌,革兰氏阴性菌——金黄色葡萄球菌及真菌——白色念珠菌,分别进行抑菌圈,最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)/最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)测定,以及抑菌率测定实验以探究儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料抑菌性能,抑菌实验均在无菌台上操作。

称取0.027 6 g儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料,100 mL超纯水定容,即得质量浓度为276 μg/mL的儿茶素-ZnO/Ag胶体溶液,为样品。质量浓度为100 μg/mL的青霉素溶液,质量浓度为7 350 μg/mL的儿茶素溶液,以及相同质量浓度(276 μg/mL)的AgNO3、ZnCl2溶液为对照组。分别滴加15 μL测试液于直径为6 mm圆形滤纸片上,自然晾干。取200 μL 稀释至106 CFU/mL对数期菌悬液加至营养琼脂平板,均匀涂抹,而后将自然晾干的滤纸片用镊子依次放至平板中,最后密封。将大肠杆菌与金黄色葡萄球菌置于37 ℃恒温振荡培养箱中培养24 h,白色念珠菌置于28 ℃恒温振荡培养箱中培养24 h。培养结束后,观察滤纸片周边菌落的生长状况,并拍照记录。

将儿茶素-ZnO/Ag胶体溶液和对照组中的青霉素以及儿茶素溶液进行稀释,采用两倍稀释法测定MIC及MBC。分别移取100 μL稀释后的样品或对照组于96孔板中,而后滴加100 μL菌悬液,培养的温度与时间同上述抑菌圈实验。无菌落生长的最低浓度即MIC。取10 μL上述不同浓度的悬浮液,在琼脂板上再进行接种,培养24 h,琼脂板上菌落小于5个的最低浓度确定为MBC。

在MIC以及MBC测定的基础上进行抑菌率测定。将样品稀释至2 MIC,各菌液稀释至106 CFU/mL,两者各取100 μL进行混合。同时,以100 μL超纯水与100 μL营养培养液的混合溶液作为空白对照,100 μL细菌或真菌悬浮液与100 μL氯化钠溶液的混合溶液作为阳性对照。培养条件与抑菌圈实验相同,采用酶标仪测定635 nm波长处的光密度值(OD值)以计算抑制率,如公式(1)所示:

式中:At,测试液OD值;A0,空白对照OD值;Acon,阳性对照OD值。

斑马鱼由于成本低,易于饲养且繁殖率高,通常被用作纳米材料安全性评估的体内模型[14]。以斑马鱼为模型动物,儿茶素-ZnO/Ag胶体溶液为测试液,进行生物相容性评估。所用斑马鱼自购买,使用充分曝气且沉淀过滤处理的自来水进行饲养,温度维持在21～23 ℃,每日喂食2次。以低MBC以及高MBC为目标浓度,使用上述自来水配制儿茶素-ZnO/Ag胶体溶液作为暴露溶液,备用。相同规格的试验箱内分别注入3 L空白对照溶液以及暴露溶液,标记为空白组,MBC处理组1(低MBC)以及MBC处理组2(高MBC)。将30尾同一批次斑马鱼随机分配引入上述试验箱中,进行为期1周的观察,并拍摄记录。

2 结果与分析

2.1 表征结果

紫外-可见吸收光谱是金属纳米材料结构表征最广泛使用的技术之一。金属纳米材料光学吸收光谱主要由表面等离子体共振决定,随着粒径的增大,表面等离子体共振波长会向更长的波长移动[15]。已有报道,球形ZnO纳米材料(70～75 nm)的UV-vis吸收光谱典型吸收带为380 nm[16],银纳米颗粒(～12 nm)在405 nm波长处显示尖峰吸收[17]。图1描述了所合儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料的UV-vis吸收光谱,并以儿茶素-ZnO以及儿茶素-Ag纳米粒子作为对照。儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料光学吸收光谱同儿茶素-ZnO纳米粒子相似,在350～430 nm波长处显示出宽吸收峰,相较于儿茶素-Ag纳米粒子在420 nm波长处显示尖峰吸收,其最大吸收峰出现在390 nm波长处,发生了蓝移。这种蓝移可能是由于ZnO/Ag纳米复合材料中电子空穴交换相互作用所导致,表明Ag纳米粒子与ZnO纳米粒子之间存在强大的界面电子相互作用。同时,儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料,由于银纳米粒子的引入,其390 nm处的吸收强度有所增强,表明银纳米颗粒沉积在ZnO纳米材料的表面,增强了其光学吸收[6,18]。

2.1.2 TEM及EDS分析

所制备儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料的形貌采用JEM-2100型透射电子显微镜进行分析。如图2所示,合成的纳米复合材料以棒状以及球状颗粒为主,且被儿茶素覆盖。分析图2-c、图2-d,可以看到球状纳米粒子大多分散点缀在棒状纳米粒子表面,未发生聚集,分析图2-a、图2-b,可以看到球状纳米粒子点缀在棒状纳米粒子表面,组成纳米复合材料,且呈现分散状态。以上结果表明,球状纳米粒子与棒状纳米颗粒之间存在较强的相互作用,形成ZnO-Ag键,同时体系中引入了儿茶素作为稳定剂,故合成的纳米复合材料均匀分散。

通过EDS分析进一步证实纳米复合材料的化学元素组成,其中图3为儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料的EDS谱图,显示其化学元素组成,表1则显示纳米复合材料元素含量情况。图1中的C、O元素归因于儿茶素的存在,值得注意的是,表1显示的C质量分数相对丰富,这是由于测试时采用碳膜铜网制作样品。表1显示Zn与Ag的质量分数别为7.20%与6.20%,以及图3中Zn、O、Ag元素的存在充分证实了纳米复合材料中ZnO和Ag纳米粒子的存在。

为阐明纳米复合材料的化学组成以及结合能下的价态,利用XPS分析进行表征,图4为Zn 2p以及Ag 3d的XPS图谱。如图4-a所示,1 046.1 eV与1 021.9 eV特征峰归因于ZnO的Zn 2p1/2和Zn 2p3/2,与报道值相一致[18]。如图4-b所示,Ag 3d5/2峰出现在366.9 eV结合能处,Ag 3d3/2峰出现在373.2 eV结合能处,3d双峰的分裂为6.0 eV,表明存在金属银[19]。与Ag 3d5/2(368.6 eV)和Ag 3d3/2(374.1 eV)标准值不同的较低结合能,这是由于电子从Ag纳米粒子转移到ZnO纳米材料表面,证实了Ag纳米粒子在ZnO纳米材料上功能化[18]。

图5为儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料的FTIR谱图,以纯儿茶素作为对照,两者FTIR谱图相似。分析纯儿茶素FTIR谱图,由于儿茶素羟基之间形成氢键,其在3 350 cm-1处产生了一个很宽的吸收带。值得注意的是,儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料存在相似的氢键特征吸收峰,相对而言,其位置发生红移,表明儿茶素与ZnO/Ag纳米复合材料表面发生了强烈的相互作用。此外,1 625 cm-1和1 465 cm-1处吸收峰归因于儿茶素苯环C

C键及烷烃C—H键的伸缩振动,1 518 cm-1处的吸收带由C—O伸缩振动引起[20]。FTIR分析结果证实了儿茶素结合于ZnO/Ag纳米复合材料表面,氢键区域的移位效应表明儿茶素的—OH与ZnO/Ag纳米复合材料表面存在相互作用。儿茶素是复合纳米材料的重要组成部分之一,羟基的引入使得复合纳米材料具有亲水性,溶于水可形成稳定胶体。

2.2 抑菌性能探究

图6是儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料抑菌圈实验结果,其中ZnCl2、AgNO3、儿茶素和青霉素溶液为对照。儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料对两种细菌以及白色念珠菌表现出了极强的杀菌作用,表明其具有广谱抑菌性能。对比同质量浓度ZnCl2溶液、AgNO3溶液,其抑菌效果更佳。ZnCl2以及AgNO3易于变质,且直接应用可能会对人体健康造成不可逆转的不良影响[21],而儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料具有长期稳定性以及生物相容性,更适用于生物抗菌应用[11,22]。

表2所示为儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料的MIC/MBC测定实验结果,青霉素及儿茶素为对照。在MIC的基础上进一步探索了儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌的抑制率,结果如图7所示。实验结果表明,儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的MIC为17.25 μg/mL,明显低于儿茶素,也略低于儿茶素-ZnO纳米复合材料(29.8 μg/mL)以及儿茶素-Ag纳米复合材料(19.63 μg/mL)[11-12]。其对白色念珠菌的MIC为34.50 μg/mL,明显低于儿茶素,略高于儿茶素-ZnO纳米复合材料以及儿茶素-Ag纳米复合材料。以上结果表明儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料协同儿茶素与合金纳米材料的抗菌性能,实现高效抗菌。且MIC条件下,其对3种微生物的抑制率明显都达到85%以上。值得注意的是,抑菌圈,MIC/MBC以及抑菌率测试结果都表明所合儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料针对细菌的抗菌效果明显强于真菌。抑菌性能研究结果表明儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料对细菌以及真菌都有明显抑制作用,有望开发为新型抑菌制剂。

为进一步评估儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料的生物相容性,以斑马鱼为模型动物,进行安全性评估。空白,MBC处理组1(低MBC 34.5 μg/mL)以及MBC处理组2(高MBC 69 μg/mL)各放入10尾斑马鱼,如图8-a所示。1周后,MBC处理组的斑马鱼依旧保持

活跃状态,没有出现死亡情况,如图8-b所示。结果表明MBC水平的儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料无毒,生物相容性好。因此,高抗菌活性的儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料有望应用于包装材料,化妆品和生物医学应用。

3 结论与讨论

本研究开发了一种用以合成亲水性儿茶素功能化ZnO/Ag纳米复合材料的绿色合成方法,该方法简捷方便,且可批量生产。以儿茶素作为还原剂和稳定剂,要求ZnCl2和AgNO3摩尔比为1∶1,反应体系pH为8.0,密封于140 ℃反应温度下保持4 h,即可制备儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料。合成的儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料通过透射电镜图谱观察发现,是由球形的Ag纳米粒子点缀在ZnO纳米棒表面组成的纳米复合材料。FTIR谱图证实了儿茶素存在于纳米复合材料表面中,使得纳米复合材料具有亲水性。抑菌实验表明了合成的儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料对大肠杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌明显的抑制作用,具有广谱抗菌性能。因此,儿茶素-ZnO/Ag纳米复合材料由于其生产便捷性以及广谱抗菌性能,有望成为新型高效抗菌剂,应用于生物医学领域中,以解决细菌感染问题。

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