酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种单细胞微生物,生长周期短,繁殖能力强[1]。酿酒酵母能利用自身代谢,通过发酵途径将糖转化成乙醇,在工业方面和发酵食品方面都被广泛应用。工业上,酿酒酵母是工业乙醇生产中应用最广的微生物[2-3];食品生产上,酿酒酵母能应用于啤酒、白酒、果酒、清酒等酒精饮料的生产,对于酒的产量、香气、口味和风格有重要影响[4-5]。
在发酵过程中,发酵产物乙醇的积累会导致酿酒酵母骨架疏散,体积变大,抑制细胞生长,是阻碍乙醇产量的最主要的因素[6-7]。因此得到能够耐受高浓度乙醇的酿酒酵母,是提高乙醇产量的一种有效方法,对于生产乙醇燃料、酿造白酒和果酒等都具有重要意义。目前已有报道利用自然筛选的方法,如周阳子等[8]从大曲中筛选得到一株耐受20%(体积分数)乙醇的扣囊复膜酵母;范光森等[9]从大曲中得到耐受18%(体积分数)乙醇的酿酒酵母YF1914。此外,易弋等[10]通过紫外诱变得到耐受9%(体积分数)乙醇的酿酒酵母SC1;陈忠军等[11]通过紫外诱变得到一株耐受18%(体积分数)乙醇的酿酒酵母HJ-1E。还有研究者采用基因编辑的方法,如CAO等[12]认为海藻糖及其合成分解相关基因表达调控水平与酵母抗逆和生长发酵性能关系密切,将扣囊复膜孢酵母的海藻糖合成基因tps1导入酿酒酵母W0中表达,得到了一株耐受18%(体积分数)乙醇的酿酒酵母Z8;BUBIS等[13]发现泛素-蛋白酶系统相关基因(如RPN4)的突变可能导致对醇类表现出高度抗性,构建 RPN4基因突变株发现其对不同浓度的乙醇表现出高度耐受性[14-15]。
定向驯化是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体,同时不断将它们进行移种传代,以达到累积和选择合适的自发突变体育种方法。在驯化获得耐受菌株方面,有研究者通过45 d短期定向驯化获得了能在8%(体积分数)乙醇培养基中生长的突变株,而对照株几乎不生长[16]。因此,本研究选择定向驯化的手段,通过逐步增加酵母生长环境中的乙醇浓度,获得具有高浓度乙醇耐受性的酿酒酵母,丰富现有的产醇酵母资源,作为优良的产醇菌株推广应用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株来源
安琪高活性干酵母,安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 培养基制备
YPD液体培养基(g/100 mL):葡萄糖2,胰蛋白胨2,酵母膏1,121 ℃灭菌20 min。
TTC上层培养基(g/100 mL):葡萄糖0.5,琼脂0.5,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC) 0.05,115 ℃灭菌20 min。培养基灭菌后,冷却至50～60 ℃时,再加入0.05 g TTC,摇匀后,立即倾于底层平板上。TTC下层为YPD固体培养基。
发酵培养基(g/100 mL):葡萄糖20,酵母浸膏1,胰蛋白胨2,硫酸铵0.1,磷酸二氢钾0.1,硫酸镁0.1,115 ℃灭菌20 min。
1.1.3 试剂与仪器
无水乙醇,成都金山化学试剂有限公司;D-无水葡萄糖、胰蛋白胨、酵母浸膏、TTC、2×Rapid Tap Master Mix,北京索莱宝科技有限公司;硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、重铬酸钾、氢氧化钠、盐酸,均为分析纯,成都市科隆化学品有限公司;引物ITS1、ITS4,成都擎科梓熙生物技术有限公司。
FA1104 J电子天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;GI54DW高压灭菌锅,信德迈科技(北京)有限公司;HZQ-F160全温振荡培养箱,上海坤诚科学仪器有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;T100基因扩增仪,伯乐生命医学产品有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 耐受高浓度乙醇酿酒酵母的驯化
称取安琪高活性干酵母粉0.1 g接种到YPD液体培养基中于28 ℃ 180 r/min进行活化培养。接种适量(0.1%～1%)活化菌液到含有6%(体积分数)乙醇的YPD液体培养基中进行耐受生长1～5 d,30%(体积分数)的甘油在保藏在-80 ℃备用;再接种适量(0.1%～1%)耐受菌液到含有更高体积分数乙醇(6.5%～22.5%)的YPD液体培养基中进行进一步耐受生长,不断提高乙醇含量以此驯化得到具有高浓度乙醇耐受性的酵母。
然后将驯化得到耐受20%(体积分数)乙醇的菌株及对照进行复苏,将种子液进行梯度稀释后分别点在含有不同乙醇浓度的YPD平板上,密封静置培养,观察其生长状态。将4种不同耐受梯度(10%、15%、20%、22%,下同)的菌株及对照进行复苏,以1%接种量分别接种于含有对应乙醇的YPD液体培养基中,每隔2 h检测OD600nm吸光值,绘制生长曲线。
1.2.2 耐受高浓度乙醇酿酒酵母的产醇能力初筛
将菌株复苏后,以1%接种量分别接种于含有对应浓度乙醇的YPD液体培养基中,强化培养48 h,然后稀释涂布于TTC下层平板上,28 ℃培养2 d,将TTC上层培养基倒入,避光培养2 h[10],观察菌株变色情况。酵母产酒精的能力越强,红色越深,每个梯度选择红色最深的6株菌进行甘油保藏待下一步筛选。
1.2.3 耐受高浓度乙醇酿酒酵母的产气能力复筛
将初筛得到的菌株进行复苏,以1%的接种量分别接种于含有杜氏小管的YPD液体培养基中,静置培养12 h,12 h后每隔1 h观察并记录杜氏小管中的产气情况直至杜氏小管中全部充满气体。重复实验3次,记录各菌株的产气速率,并挑选出各乙醇耐受梯度菌株中产气速率最快的一株。
1.2.4 耐受高浓度乙醇酿酒酵母的菌种鉴定
将筛选得到的菌株活化培养后进行菌液PCR。引物:ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min;55 ℃退火1 min;72 ℃延伸110 s;30个循环;72 ℃延伸修复5 min。PCR扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。将测序得到的基因序列输入NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库进行BLAST同源性在线比对,并用MAGE-X软件构建系统进化树[17]。
1.2.5 耐受高浓度乙醇酿酒酵母的酒精度测定
将菌株活化后,以5%的接种量接种到发酵培养基中,28 ℃发酵7 d后检测其发酵过程中酒精度的变化情况,实验重复3次。酒精度的检测方法:分光光度计法[18]。
1.2.6 耐受高浓度乙醇酿酒酵母发酵桑葚果酒
称取桑葚约200 g,破碎打浆后调整糖度为20°Bx。将偏重亚硫酸钾(200 mg/L)溶于灭菌过的含有200 mL 水的三角瓶中,再加入打好浆的桑葚汁、果胶酶(100 mg/L),以5%的接种量接种酵母菌。28 ℃静置发酵7 d,实验重复3次[19]。
1.2.6.1 测定方法
酒精度采用分光光度计法测定[18]。残糖含量采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法测定[20]。糖醇转化率(S)[21]按公式(1)计算:
(1)
式中:C,酒精度,%vol;G,消耗糖度,°Bx。
1.2.6.2 感官评价
一个由10位(5男5女)经过选择和培训的评价员组成的评价小组,分别对桑葚果酒的澄清度、色泽、香味、滋味4个指标进行感官评价,满分100分,感官评分标准见表1。
表1 桑葚果酒感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of mulberry wine
项目评分标准分数/分澄清度(20分)澄清透亮,无杂质,无沉淀18～20澄清,有轻微悬浮物,无沉淀13～17微浑,有少量杂质或沉淀7～13浑浊,有明显杂质或沉淀0～7 色泽(20分)鲜明协调,有光泽,深紫宝石红色18～20鲜明,有光泽,深紫色13～17有光泽,微红色,无变色7～13失光,不协调0～7 香味(30分)清新的桑果香和浓郁的酒香26～30桑果香和酒香良好,无异味20～25果香酒香不足,有异味13～19无酒香,异味浓重0～12滋味(30分)酒体丰满,醇厚协调26～30酒体淡薄,酸甜适中20～25无酒味,略酸13～19无酒味,酸涩,口感较差0～12
2 结果与分析
2.1 驯化获得耐受高浓度乙醇酿酒酵母
本实验采用定向驯化的手段,从安琪酵母出发,逐步增加环境中的乙醇浓度,以获得耐受高浓度乙醇的酿酒酵母。驯化过程如图1所示,安琪酵母在含有6%～12%(体积分数)乙醇的YPD液体培养基中生长情况接近于在不含乙醇YPD中,驯化顺利;在含有13%～17%(体积分数)乙醇的YPD液体培养基中驯化时,转接20支试管约10支试管能得到生长良好的菌株,菌株生长较之前困难;在含有18%及以上体积分数乙醇的YPD液体培养基中,转接40支试管只有1只试管能得到生长良好的菌株,驯化难度再次加大。菌株在含有22%(体积分数)和22.5%(体积分数)乙醇的YPD液体培养基中生长都困难,但含有22%乙醇的菌液生长后肉眼可见变浑浊,而含有22.5%乙醇的菌液经过一段时间培养后始终未见明显浑浊。因此,认为22%为本次驯化菌株的最高乙醇耐受体积分数。本次酿酒酵母高浓度乙醇耐受驯化全过程耗时11个月。
为对比驯化后酿酒酵母对乙醇的耐受情况,将耐受20%(体积分数)乙醇的菌株和初始安琪酵母置于不同条件下进行培养。初始安琪酵母和耐受20%乙醇的菌株在没有乙醇的YPD下生长情况相似,均能良好的生长(图2-a);在含有10%(体积分数)乙醇的YPD中,初始安琪酵母的生长受到抑制,耐受20%乙醇的菌株能良好生长,并且和在没有乙醇的条件下长势一致(图2-b);在含有15%(体积分数)乙醇的YPD中,初始安琪酵母的生长被严重抑制,几乎不能生长,耐受20%乙醇的菌株则能正常生长(图2-c)。从生长曲线方面分析驯化得到的菌株生长情况,如图3所示,4株不同耐受程度的菌株生长情况类似,即在前6 h属于迟缓期,6～20 h进入对数生长期,20～35 h进入稳定期,35～48 h属于衰亡期。
图1 酿酒酵母菌株乙醇耐受性驯化流程图
Fig.1 Flow chart of the domestication for the ethanol-tolerant S.cerevisiae strains 注:图中均为乙醇的体积分数
a-不含乙醇的YPD;b-含10%乙醇的YPD; c-含15%乙醇的YPD
图2 耐受不同浓度乙醇酿酒酵母菌株在不同 乙醇含量下的生长情况
Fig.2 Growth of S.cerevisiae strains tolerant to different concentrations of ethanol at different ethanol levels
图3 耐受不同浓度乙醇酿酒酵母菌株生长曲线
Fig.3 Growth curve of S.cerevisiae strains tolerant to different ethanol concentrations
2.2 耐受高浓度乙醇酿酒酵母的产醇能力初筛
菌株的乙醇耐受力可能会影响菌株的产乙醇能力。因此,在驯化得到的耐受高浓度乙醇菌株的基础上,通过TTC法对菌株的产醇能力进行初步验证,筛选具有产乙醇能力的菌株。TTC作为一种显色剂, 能对酵母的代谢产物发生显色反应, 并且通过反应颜色的深浅来判断酵母产酒精能力的高低, 通常情况下, 产酒精能力越强的酵母菌株在显色培养基上显现的颜色越深[8]。通过TTC平板分离筛选后,涂布浓度为10-5的平板上约有80～150个单菌落,覆盖TTC上层平板2 h后所有的菌落均呈深红色。从初始安琪酵母中选择6株深红色的菌株编号为01～06(图4-a);从耐受10%乙醇的菌株中选择6株深红色的菌株编号为101～106(图4-b);从耐受15%乙醇的菌株中选择6株深红色的菌株编号为151～156(图4-c);从耐受20%乙醇的菌株中选择6株深红色的菌株编号为201～206(图4-d);从耐受22%乙醇的菌株中选择6株深红色的菌株编号为221～226(图4-e)。
a-初始安琪酵母;b-耐受10%乙醇的菌株;c-耐受15%乙醇的菌株; d-耐受20%乙醇的菌株;e-耐受22%乙醇的菌株
图4 耐受不同浓度乙醇酿酒酵母菌株的TTC染色情况
Fig.4 TTC staining of S.cerevisiae strains tolerant to different ethanol concentrations
2.3 耐受高浓度乙醇酿酒酵母的产气能力复筛
菌株的产醇能力影响菌株的发酵性能,而菌株的发酵性能又和产气能力密切相关,因此我们还通过杜氏小管对初筛得到的产醇能力强的菌株进行产气能力复筛。结果显示30株菌均能产生气体全部充满杜氏小管,说明了这些菌株有较强的产气能力,在初始安琪酵母01～06号菌株中,01号菌株产气能力最强(图5-a);对于耐受10%乙醇的101～106号菌株,104号产气能力优异(图5-b);对于耐受15%乙醇的151～156号菌株中,151号菌株产气能力最强(图5-c);在耐受20%乙醇的201～206号菌株中,202号菌株产气能力优异(图5-d);针对耐受22%乙醇的221～226号菌株,221号菌株产气速率明显优于同等耐受的其他菌株(图5-e)。选择不同乙醇耐受力中产气能力最强的菌株进行下一步实验。
2.4 耐受高浓度乙醇酿酒酵母的菌种鉴定
对菌株DNA进行 PCR扩增后得其电泳图(图6),4条条带均清晰明亮,大小约800 bp,用MEGA-X软件中的邻接法绘制菌株104、151、202、221基因序列同源菌株的系统发育树(图7)。可以看出4株菌均与酿酒酵母同源性最高,故鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
a-初始安琪酵母;b-耐受10%乙醇的菌株;c-耐受15%乙醇的菌株;d-耐受20%乙醇的菌株;e-耐受22%乙醇的菌株
图5 耐受不同浓度乙醇酿酒酵母菌株产气情况
Fig.5 Gas production of S.cerevisiae strains tolerant to different ethanol concentrations 注:产气量为杜氏小管体积占比
M-Marker;NT-初始安琪酵母01;104-耐受10%乙醇的菌株; 151-耐受15%乙醇的菌株;202-耐受20%乙醇的菌株; 221-耐受22%乙醇的菌株
图6 耐受菌株18S rDNA PCR扩增产物电泳结果
Fig.6 Electrophoresis results of 18S rDNA PCR amplification products of tolerant strains
2.5 耐受高浓度乙醇酿酒酵母发酵过程中酒精度测定
为得到耐乙醇能力优良且产乙醇能力优良的菌株,对驯化得到的耐受高浓度乙醇酿酒酵母的产乙醇能力进行测试,将上述筛选得到的104、151、202、221菌株及对照01菌株分别接种到发酵培养基中发酵7 d。结果显示在发酵初期,未经过驯化和驯化后的酿酒酵母发酵液酒精度含量相似,没有明显的差别;但是在发酵中后期,乙醇耐受性强的菌株发酵液酒精度逐渐增加,并且随着乙醇耐受性增加,发酵液的酒精度也不断增加(图8);发酵终点时,对照01菌株发酵液酒精度为7.18%vol,菌株104发酵液酒精度7.33%vol,菌株151发酵液酒精度7.59%vol,菌株221发酵液酒精度7.93%vol,酒精度最高的是202菌株发酵液为8.03%vol,相比初始菌株提高了约11.8%(表2)。
图7 耐受菌株18S rDNA基因序列系统进化树
Fig.7 Phylogenetic tree of 18S rDNA gene sequence of tolerant strains
表2 耐受不同浓度乙醇酿酒酵母菌株发酵后期 酒精度变化 单位:%vol
Table 2 Changes in liquor precision of S.cerevisiae strains tolerant to different ethanol concentrations in the late fermentation period
发酵时间/d0110415120222157.21±0.097.30±0.127.34±0.097.80±0.137.68±0.1167.22±0.107.24±0.077.39±0.097.81±0.227.89±0.1577.18±0.157.33±0.147.59±0.158.03±0.107.93±0.20
图8 耐受不同浓度乙醇酿酒酵母菌株发酵过程中 酒精度变化情况
Fig.8 Changes in alcohol precision during fermentation of S.cerevisiae strains tolerant to different ethanol concentrations
2.6 耐受高浓度乙醇酿酒酵母在桑葚果酒的应用初探
耐受高浓度乙醇的酿酒酵母具有优良的产乙醇能力,不仅可以应用于工业上乙醇燃料的生产,也可以用于果酒酿造。桑葚色泽鲜艳, 酸甜多汁,是花色苷含量较高的浆果之一,工业上尚无酿造桑葚酒的专用酵母,因此筛选适于桑葚酒发酵的酵母菌株非常重要。将筛选得到的耐受高浓度乙醇的4株菌应用于发酵桑葚果酒,如图9所示,菌株01发酵的桑葚果酒酒精度最低,为10.06%vol;菌株104发酵的为11.59%vol;菌株151发酵的为12.85%vol;菌株202发酵的为14.73%vol;菌株221发酵的最高,为15.07%vol,与初始菌株01相比提高了约49.8%,并且随着菌株的乙醇耐受性增强桑葚果酒的酒精度也在不断升高,说明随着菌株乙醇耐受性的增强,菌株的产醇能力也在不断提高。同时还对桑葚果酒的残糖量进行检测,菌株01发酵的桑葚果酒残糖含量最高,菌株151发酵的果酒残糖含量最低。之后对糖醇转化率进行计算,发现糖醇转化率与乙醇耐受性也呈正相关,随着菌株乙醇耐受性的增强,菌株的糖醇转化率也在不断提高,这可能是因为菌株01更多的将糖分用于自身生长,而耐受性高的菌株则更多利用糖分转化为乙醇。桑葚果酒酒样的感官分析雷达图如图10所示,耐受高浓度乙醇酿酒酵母发酵的桑葚果酒的滋味和香味明显高于初始菌株发酵的果酒,澄清度和色泽差异不大,但是感官评分显著高于初始酵母发酵的果酒感官评分见附表1～附表10(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?FileName=SPFX20220923001&Db Name=CAPJ2022)。
图9 耐受不同浓度乙醇酿酒酵母菌株发酵桑葚果酒 酒精度、残糖和糖醇转化率
Fig.9 Alcohol content, sugar, and sugar alcohol conversion of mulberry fruit wine fermented by S.cerevisiae strains tolerant to different ethanol concentrations
图10 耐受不同浓度乙醇酿酒酵母菌株对桑葚 果酒感官品质的影响
Fig.10 Effect of S.cerevisiae strains tolerant to different concentrations of ethanol on sensory quality of mulberry fruit wine
3 结论与讨论
本研究以安琪高活性干酵母出发,经过高浓度乙醇耐受性驯化,挑选耐受不同浓度乙醇的菌株进行分离、TTC初筛、杜氏小管复筛,得到4株产醇、产气能力优良且分别耐受10%、15%、20%、22%乙醇的酿酒酵母。对这4株菌进行产酒精能力测试,发现随着驯化程度的增加,菌株的产酒精能力也在不断增加,其中耐受20%乙醇的菌株202发酵液的酒精度最大,达到了8.03%vol,相比初始菌株01提高了11.8%。最后将这4株菌应用于发酵桑葚果酒,随着菌株的乙醇耐受性增加,桑葚果酒的酒精度也不断增加,耐受22%乙醇的菌株221桑葚果酒酒精度最大,达到了15.07%vol,相比初始菌株01增加了49.8%,使桑葚果酒的酒精度得到显著提升。在发酵培养基和桑葚果酒发酵糖浓度相当时,相同菌株发酵的乙醇浓度出现较大的差别,一方面可能是因为桑葚鲜果在榨汁时并没有完全破碎,果肉中的部分糖分在发酵过程中才缓慢释放;另一方面发酵培养中主要成分是葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨等,而桑葚含有葡萄糖、果糖和蔗糖等糖分,营养价值高且含有多种微量元素,成分更加复杂,并且大部分酿酒酵母更适宜在酸性条件下生长,酸性的桑葚汁可能更适合耐乙醇的酿酒酵母菌株生长发酵。
通过驯化手段获得理想性状的酵母菌株,是一种有效手段,但其性能在传代过程中可能会发生性状丢失现象。因此对耐高浓度乙醇酵母菌株的遗传稳定性进行探究,将驯化后的菌株进行20次连续传代(在YPD培养基中每隔24 h转接1次,连续转接20次),结合其在传代过程中生长状态、细胞形态和浊度对稳定性进行综合分析,在连续传代过程中耐受菌株依然能够耐受高浓度乙醇且生长状态良好,细胞形态没有发生变化,表明耐受高浓度乙醇菌株在长期传代过程中表型特征十分稳定。
此前已有研究使用定向驯化的手段得到耐受8%乙醇的酿酒酵母,也有研究使用诱变育种的方法得到了乙醇耐受力20%的酿酒酵母,而本研究通过定向驯化的方法得到了耐受22%乙醇的酿酒酵母,并且在发酵培养基同样的含糖量情况下,乙醇耐受性最高,酒精度最高,达到了8.03%vol。本研究中酿酒酵母乙醇耐受性增加,猜测可能是和海藻糖有关,海藻糖能够抑制己糖激酶活性,稳定生物大分子结构,从而提高酿酒酵母乙醇耐受性[22];还可能是相关酶如乙酰转移酶MPR1可以使有毒代谢物乙酰化从而调节细胞耐受能力[23-24];也可能是因为转录因子MSN2的过表达促进乙醇耐受性并增加了乙醇产量[25]。后续研究可以对驯化菌株的基因组、转录组进行测序,观察是否存在乙醇耐受相关基因突变,比如tps1[12]、RPN4[13]等基因,再利用基因编辑技术验证突变基因的功能,从基因层面上解读酿酒酵母在高浓度乙醇耐受性的适应性进化研究中乙醇耐受相关基因与表达性状之间的具体关系。未来还可以将驯化得到的耐受高浓度乙醇的酿酒酵母应用于工业生产乙醇,或者应用于发酵白酒、果酒等;还可以利用现有的耐受高浓度乙醇的酿酒酵母,继续通过定向驯化技术得到既耐乙醇又耐高温、耐酸等优良性状的菌株,用于更好的发酵白酒和果酒,提高产品品质。
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