制干工艺对黑曲霉侵染红枣品质及赭曲霉毒素A含量的影响

红枣,鼠李科木本植物的果实,已有四千年的栽培史,是我国特有的果品之一,营养丰富,既可鲜食,又可干制。我国种植的红枣面积广泛,种类多,产量约占世界总产量的95%[1]。其中干枣和半干枣的消费量占红枣产量的90%以上,干制红枣主要用于制作糕点、熬汤等。由于鲜枣在成长过程中易被链格孢菌、黑曲霉等真菌侵染,不仅影响其品质和营养价值,而且会造成真菌毒素的积累[2]。红枣干制的生产过程中,果实表面潜伏真菌在环境及贮存方式不当时,会侵染干果,大量定殖并产生真菌毒素,由真菌污染导致的干果产量损失约为25%～30%[3]。真菌侵染会降低干枣品质,并且真菌毒素积累会造成红枣产业严重的经济损失。

鲜枣由于果皮质地脆嫩,容易受到损伤导致其保存期短,且在常温下容易失水,发生褐变等。因此,大部分鲜枣以干制的方式进行贮藏,其中红枣的干制方式主要包括自然干制、热风干制、微波辅助干燥、真空冷冻干燥等[4]。红枣的干制温度对其品质与风味有直接影响,如糖、酸、维生素等营养品质指标等。有研究发现干制温度越高,干制时间越长,枣肉的褐变度越大,维生素C和氨基酸态氮减少越多[5]。不同干制方式干制后对红枣的风味也存在非常大的差异,干制方式不同会改变红枣的组织细胞结构,从而影响干枣的口感,改变其风味[6]。张江宁等[7]将热风干制最佳温度确定为70 ℃,但红枣颜色深,口感较硬,总糖含量高。但是,制干温度对真菌侵染红枣的品质有何影响尚不清楚。

黑曲霉(Aspergillus niger)是红枣曲霉病主要病原菌之一,会导致枣果褐变软化,散发霉酸味,并伴随针头状的黑色小球。黑曲霉侵染寄主后产生的赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是一种重要的真菌毒素,对人体具有致癌、致畸、致突变等威胁,常见于食品和农产品中[8-9]。OTA是一种微溶于水,易溶于极性溶剂和碳酸氢钠溶液的无色结晶化合物,热稳定性高,很难通过加热、蒸煮等热处理方式进行降解[10]。然而,干制温度是否会对黑曲霉侵染红枣中的OTA含量产生影响尚未见报道。

本研究采用黑曲霉对陕西狗头枣进行侵染,将接种不同时间的红枣,分别在65、85、105、125 ℃下进行干制,对干制前后红枣中总酸、总糖、可溶性固形物、褐变度、维生素C含量等品质变化进行测定,并且对OTA加标的红枣进行干制,测定其中OTA的含量变化,评价干制温度对红枣中OTA含量的影响,分析烘干处理对降低红枣中的OTA含量的作用,评价OTA对温度的稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食品级狗头枣,陕西省延安市延川县;OTA(分析纯),青岛普瑞邦生物工程有限公司;NaOH,杭州鑫达化工有限公司;酚酞,上海中泰化学试剂有限公司;甲醇,国药集团化学试剂北京有限公司;亚铁氰化钾,郑州优然化工产品有限公司;葡萄糖,苏州市荣珍精细化工有限公司;乙酸锌,沈阳赛尼欧化工有限公司;盐酸,石家庄蓬松化工贸易有限公司;抗坏血酸,天津市新精细化工开发中心;以上试剂均为化学纯。

1.2 仪器与设备

RE-200B型旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;YP10002型电子天平,上海佑科仪器仪表有限公司;722 N型可见光分光光度计,上海一点分析仪器有限公司;FN-24 W型水浴氮吹仪,青岛聚创设备有限公司;3K15型高速冷冻离心机,北京五洲东方科技发展有限公司;LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;SPX-250-Z-S型生化培养箱,上海新苗医疗器械制造有限公司;JMH-9020A型电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;SN/T2534-2010 NY固相净化柱,青岛普瑞邦生物工程有限公司;LC-20A型高效液相色谱串联荧光,Thermo Fisher Scientific。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的培养

黑曲霉培养参照刘雪等[11]的方法并修改。取清洗干净且去皮的土豆200 g,在锅中煮沸30 min,用双层纱布过滤后,在滤液中加入20 g蔗糖和20 g琼脂,加热搅拌,待完全溶解后装入锥形瓶,在高压灭菌锅中进行灭菌,然后将培养基分装到培养皿中,滴加适量的黑曲霉H1菌,密封,待其冷却后在25 ℃下培养7 d,配制成浓度为1×106 spore/mL标准孢子悬浮液待用。

1.3.2 红枣果实的接种及烘干处理

黑曲霉侵染红枣参照宋雅芸等[12]的方法并修改。分别选取大小均匀且无病斑的优质狗头枣若干,用蒸馏水洗涤干净,在0.5%(质量分数)的次氯酸钠溶液中浸泡2 min,捞出后放置无菌操作台,用75%(体积分数)酒精擦洗果实表面,待红枣果实晾干后用已灭菌的打孔器在每个红枣表面打出大小相近的孔(直径约为2 mm,深度大约8 mm),将配制好的孢子悬浮液注入孔中(大约1 μL),将接种后的红枣放入恒温培养箱中培养1、2、3、4、5、6 d。每个培养阶段选取5组狗头枣接种黑曲霉H1,每组30颗。对照组接种不同时间的红枣与对照组分别在电热鼓风干燥箱于65、85、105、125 ℃烘干90 min,处理后的枣果去核,果肉用于后续实验。

1.4 红枣品质测定

总酸测定参照江桐等[13]的方法并修改。取培养1～6 d的红枣,分别在65、85、105、125 ℃下干制90 min,取研磨后的样品5 g,倒入50 mL容量瓶内,滴加蒸馏水至刻度线,摇匀,静置2 h减压抽滤,转移20 mL滤液至锥形瓶中,滴加2滴1%(质量分数)的酚酞溶液,滴加NaOH溶液至溶液刚变红且30 s不褪色,记录NaOH消耗体积量,重复3次,取平均值。总酸度的计算如公式(1)所示:

式中:X表示总酸度,%;C表示NaOH的质量浓度,g/mL;V表示NaOH的用量体积,mL;m表示样品质量,g;K表示稀释倍数。

总糖测定参照詹梦涛等[14]的方法并修改,利用3,5-二硝基水杨酸法测定液体中总糖含量。取样品溶液5 mL,加入一定量的3,5-二硝基水杨酸和NaOH溶液,在540 nm下测定吸光度,通过标准曲线求出不同时间的总糖含量。

1.4.3 可溶性固形物(total soluble solid, TSS)

TSS测定参照牛英等[15]的方法并修改。称取3 g果肉,加入3 mL H2O,放入大号离心管中,斡旋3 min混合匀浆,读取折光率,通过《25 ℃折光率与可溶性固形物换算表》获得TSS含量。

褐变度测定参照朱效兵等[16]的方法并修改。取样品溶液5 mL,加入95%(体积分数)乙醇5 mL,离心10 min,在420 nm处测定吸光度,直接用吸光度数值表示褐变度大小。

1.4.5 维生素C含量

维生素C含量测定参照白茹等[17]的方法并修改。分别取抗坏血酸2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度线处,移至试管中并加入1 mol/L NaOH溶液4 mL,摇匀后待15 min时加入1%(质量分数)盐酸4 mL,定容至50 mL,在243 nm处测定消光值并绘制标准曲线。然后取干制后红枣样品5 g,加入50 mL容量瓶制备成溶液,吸取1 mL样液至50 mL容量瓶中,接着加入10 mL蒸馏水,4 mL 1 mol/L NaOH溶液,摇匀,待15 min后加入4 mL盐酸,摇匀后定容至50 mL。在243 nm处测定其消光值,通过标准曲线,计算样品中维生素C的含量。

取数个质量为10 g的新鲜红枣,将提前配制好的OTA溶液(1 μg/mL)注射入红枣中,分别在65、85、105、125 ℃下烘干,取每个温度下红枣样品5 g装入离心管内,分别加入8.4 mL甲醇和1.6 mL H2O,高速搅拌3 min,高速离心5 min,减压抽滤后得到滤液大约20 mL,浓缩至7 mL,所得溶液通过PriboFast229多功能净化柱,将洗脱后的溶液浓缩至1 mL,使用氮吹仪吹干后,加入0.6 mL H2O和0.4 mL甲醇,涡旋混合30 s,用0.22 μm的有机滤膜过滤,滤液待进行HPLC分析。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉侵染对枣果实的影响

黑曲霉侵染红枣1～6 d后测量红枣的病斑直径,结果发现随着病原物侵染时间的延长,枣果果实病斑直径增大。第1天病斑直径为0.2 cm,第3～6天果实病斑直径较第1天显著增加(2.31～3.22 cm)。初期病斑均呈现为黑色斑点,随着贮藏时间的延长,病斑范围逐渐扩大且在接种孔周围出现黑色孢子及水浸状软腐。红枣贮藏1～6 d后对照组和实验组失重率变化分别为62.70%～70.87%和42.97%～49.31%,说明黑曲霉侵染后红枣的质量损失小于自然条件。以上结果表明,虽然红枣接种后相较鲜枣质量发生了明显变化,但是不同的侵染时间的红枣质量变化较小。对接种不同时间的红枣在65～125 ℃烘干处理90 min,结果发现不同侵染阶段样品失重率的差异反而进一步减小,失重率为52%～54%。由于不同温度及接种时间处理后红枣的质量差异较小,因此后续实验直接采用处理样品进行测定。

2.2 红枣干制后总酸的变化

研究发现酸类和酚类是影响红枣香气品质的主要成分,总酸含量的变化一定程度反映了红枣香气、品质及稳定性。将接种黑曲霉1、2、3、4、5、6 d的红枣和对照组在不同温度下进行烘干,测定其总酸含量,实验结果如图1所示。在不同烘干温度下,随着温度的升高,总酸含量也逐渐升高。在相同的温度下,接种时间的增加,实验组红枣的总酸逐渐增加,在第6天总酸含量达到最大。由图1-B～图1-D可知,在85、105、125 ℃下,在第1天时对照组总酸度高于实验组,说明接种后的红枣内黑曲霉代谢增加,葡萄糖经过糖酵解生成丙酮酸,使红枣总酸明显升高[18]。

2.3 红枣干制后总糖的变化

本研究通过对接种1、2、3、4、5、6 d的红枣进行还原糖含量的测定,如图2所示。在不同干制温度下,对照组总糖含量均随着培养时间的增加,枣内总糖含量升高。相同的温度下,随着培养时间的增加,黑曲霉侵染后红枣内总糖含量较对照组糖含量降低。表明在红枣被黑曲霉侵染之后,黑曲霉在三羧酸循环中代谢加剧生成透明质酸等,消耗了糖[19]。干制温度的升高,红枣内总糖含量逐渐降低。此外,有研究表明红枣中蔗糖等非还原糖的降解速率随着温度的升高而增加[20]。伴随干制温度的升高,红枣内总糖含量逐渐降低。余优森等[21]在苹果含糖量与温度的关系中提出,低温能够促进糖类的转换和积累。此外,有研究表明红枣中蔗糖等非还原糖的降解速率随着温度的升高而增加,较高的烘干温度有利于糖的降解,低烘干温度有助于总糖的积累。

2.4 红枣干制后TSS的变化

TSS含量可以作为果实的甜度指标,含量的多少决定了果实的甜度和风味。果品中的TSS含量越高,在干制之后干品率越高,且口感较好。对接种1、2、3、4、5、6 d的红枣进行TSS含量测定,结果如图3所示。在对照组中,4个温度下的TSS含量基本都在降低,其中,在65、85、105 ℃下的第5天时TSS含量均达到最低。随着培养时间的增加,实验组中的TSS呈下降趋势,从第4天开始,65、105、125 ℃下降趋势均增大。因为红枣中的淀粉等大分子物质会逐渐降解成可溶性小分子物质,随着时间延长,当降解总量小于代谢总量时,TSS含量降低[22]。结合图2,红枣内总糖含量随温度的升高逐渐降低,TSS与糖含量变化趋势相似,当烘干温度较高时其含量降低。

2.5 红枣干制后褐变度的变化

对接种1、2、3、4、5、6 d的红枣褐变度进行测定,如图4所示,随着培养时间的增加,同一制干温度下对照组与实验组的褐变度都呈下降趋势,且黑曲霉侵染前后红枣的褐变度与对照组相比变化明显。而随着干制温度的升高,褐变度随之升高。本研究中当温度在65 ℃下,红枣的色泽呈亮红色,温度升高到85 ℃时,红枣色泽加深,升高至105、125 ℃时,红枣表面呈现出焦黑色。红枣的褐变主要由酶促褐变和非酶褐变引起。酶促褐变是由于红枣在干制的过程中会发生呼吸作用,体内的酶会将底物破坏氧化发生褐变,而非酶褐变则是一个极复杂的化学反应过程。由于高温会使酶变性失活,因此我们推断红枣褐变度随温度升高而增加是由非酶促褐变导致的。且多酚类物质在高温作用下易氧化成醌类,多酚类物质减少,导致果肉颜色加深,褐变度增加[23]。由此,为保证红枣果实品质,干制时温度不宜过高。

2.6 红枣干制后维生素C的变化

维生素C是红枣中主要营养成分之一,具有较强的还原性,在高温下极易被氧化,是评价红枣品质的重要指标[24]。对接种1、2、3、4、5、6 d的红枣进行维生素C含量测定,结果如图5所示,发现培养时间的增加,对照组维生素C含量无明显变化;反而制干温度越高,维生素C含量降低,说明制干温度对红枣维生素C含量有明显的影响,红枣干制时温度不宜过高。实验组中,制干温度对于接种后红枣中维生素C的含量影响较小,维生素C随干制温度的升高略有降低。在同一制干温度下,培养时间增加,维生素C含量出现缓慢的增加,结合图1可知,红枣中总酸含量随侵染后培养时间的延长而增加,在酸性条件下,维生素C的存在会更加稳定[25]。一般认为高温会加速维生素C的氧化,导致其含量降低,因此,接种黑曲霉后红枣中的维生素C的含量同样受到温度的影响而下降。

2.7 红枣干制后OTA含量

在红枣中加标10 mL 1 μg/mL的OTA溶液,由表1可知,红枣在65～85 ℃干制后OTA含量降低,高于85 ℃后OTA含量又逐渐升高,在不同温度下红枣干制后OTA浓度都会降低。分析原因如下:在回收过程中,PriboFast229多功能净化柱的回收率只能达到80%,未能完全回收;同时,杨红娟[26]指出,当水果内存在OTA时,拮抗微生物会通过吸附和降解的方法脱除OTA,蛋白酶也会在37 ℃后对OTA有降解作用,使水果内OTA含量下降;并且OTA在高温烘焙时能够降低10%～20%[27]。85～125 ℃干制后红枣内OTA浓度上升,是由于随着温度的升高,导致红枣内拮抗微生物和蛋白酶活性降低,使OTA降解速率降低。综上所述,烘干处理会在一定程度降低红枣中OTA含量,但无法完全消除OTA。

3 结论

本研究结果发现,黑曲霉侵染的红枣干制后总酸、总糖、维生素C含量会随培养时间的增加而增加,褐变度与TSS略有降低,说明黑曲霉侵染会对红枣干制后的品质产生影响。干制温度对接种后红枣的褐变度影响最大,而对维生素C的影响不显著。干制后红枣中OTA总含量总体呈下降趋势,说明红枣干制过程有助于降低其中OTA的含量。根据红枣干制后的品质及OTA含量的变化,综合分析最终确定红枣干制的最佳温度为65 ℃。该研究分析了干制温度对真菌侵染红枣品质及真菌毒素含量的影响,为从侵染源控制真菌污染及品质损失提供了理论依据,对保证消费者的身体健康,减少枣果产业经济损失具有深远意义。

[1] GAO Q H, WU C S, YU J G, et al.Textural characteristic, antioxidant activity, sugar, organic acid, and phenolic profiles of 10 promising jujube (Ziziphus jujuba Mill.) selections[J].Journal of Food Science, 2012, 77(11):C1 218-C1 225.

[2] 沙娜瓦尔·色买提, 玉山江·买买提, 郭庆元, 等.枣果霉烂病病原鉴定(一)——引起新疆枣果霉烂病的几种曲霉菌的分离鉴定[J].新疆农业科学, 2016, 53(3):502-509.

SHANAWAER S, YUSHANJIANG M, GUO Q Y, et al.Identification of the pathogen causing jujube fruit mildew(part Ⅰ)-isolation and identification of Aspergillus fungus causing jujube fruit mildew[J].Xinjiang Agricultural Sciences, 2016, 53(3):502-509.

[3] CHEN Y, GUO Q, WEI J A, et al.Inhibitory effect and mechanism of nitric oxide (NO) fumigation on fungal disease in Xinjiang Saimaiti dried apricots[J].LWT, 2019, 116:108507.

[4] 耿然, 路威, 王明空.红枣品质及干制工艺研究分析[J].农产品加工, 2015(3):53-56.

GENG R, LU W, WANG M K.The research status of Zizyphus jujube variety qualities and drying process[J].Farm Products Processing, 2015(3):53-56.

[5] 张宝善, 陈锦屏, 李慧芸.热风干制对红枣非酶褐变的影响[J].食品科学, 2006, 27(10):139-142.

ZHANG B S, CHEN J P, LI H Y.Effect of hot air drying on nonenzymatic browning of Chinese jujube[J].Food Science, 2006, 27(10):139-142.

[6] 贺怡, 张明, 马超, 等.不同干制方式对红枣风味影响的研究进展[J].食品工业, 2021, 42(7):208-211.

HE Y, ZHANG M, MA C, et al.Research progress on the influence of different drying methods on the flavor of jujube[J].The Food Industry, 2021, 42(7):208-211.

[7] 张江宁, 杨春, 丁卫英.不同干燥方式对红枣品质的影响[J].北方园艺, 2016(14):139-143.

ZHANG J N, YANG C, DING W Y.Effect of different drying methods on the quality properties of jujube[J].Northern Horticulture, 2016(14):139-143.

[8] NAN M N, XUE H L, BI Y.Contamination, detection and control of mycotoxins in fruits and vegetables[J].Toxins, 2022, 14(5):309.

[9] WANG L, HUA X, SHI J, et al.Ochratoxin A:Occurrence and recent advances in detoxification[J].Toxicon, 2022, 210:11-18.

[10] NAN M N, BI Y, QIANG Y, et al.Electrostatic adsorption and removal mechanism of ochratoxin A in wine via a positively charged nano-MgO microporous ceramic membrane[J].Food Chemistry, 2022, 371:131157.

[11] 刘雪, 李林, 徐其静, 等.一种黑曲霉生产胞外多聚物的优化培养基及培养方法:中国, CN112708566A[P].2021-04-27.

LIU X, LI L, XU Q J, et al.An optimized culture medium and culture method for Aspergillus niger to produce extracellular polymers:China, CN112708566A[P].2021-04-27.

[12] 宋雅芸, 罗仓学, 邵明亮.马铃薯渣发酵生产活性蛋白饲料的研究[J].食品工业科技, 2016, 37(24):186-192.

SONG Y Y, LUO C X, SHAO M L.Research on production of active protein feed by fermenting potato residue[J].Science and Technology of Food Industry, 2016, 37(24):186-192.

[13] 江桐, 王奕聪.利用酸碱滴定法测定可乐中的磷酸含量的探究[J].实验教学与仪器, 2019, 36(6):70-71.

JIANG T, WANG Y C.Study on the determination of phosphoric acid content in cola by acid-base titration[J].Experiment Teaching and Apparatus, 2019, 36(6):70-71.

[14] 詹梦涛, 娄水珠, 刘仙花, 等.3,5-二硝基水杨酸法测定液体糖中总糖含量[J].云南民族大学学报(自然科学版), 2020, 29(4):317-321.

ZHAN M T, LOU S Z, LIU X H, et al.Determination of the total sugar content in liquid sugar by 3,5-dinitrosalicylic acid method[J].Journal of Yunnan Minzu University(Natural Sciences Edition), 2020, 29(4):317-321.

[15] 牛英, 范七君, 刘冰浩, 等.柑桔果汁可溶性固形物含量测定的影响因素及优化[J].现代园艺, 2021, 44(7):3-6.

NIU Y, FAN Q J, LIU B H, et al.Influencing factors and optimization of determination of soluble solid content in citrus juice[J].Xiandai Horticulture, 2021, 44(7):3-6.

[16] 朱效兵, 徐瑞年, 夏美茹, 等.肉苁蓉软罐头品质测定与分析[J].农产品加工, 2020(11):57-61.

ZHU X B, XU R N, XIA M R, et al.Quality measurement and analysis of retort pouch of Cistanche deserticola[J].Farm Products Processing, 2020(11):57-61.

[17] 白茹, 邹本春.紫外分光光度法测定水果蔬菜中维生素C含量测定[J].生物技术世界, 2013,10(3):70.

BAI R, ZOU B C.Determination of vitamin C in fruits and vegetables by ultraviolet spectrophotometry[J].Biotech World, 2013,10(3):70.

[18] 牛贵洋, 王治泽, 任俊坤.干制红枣总糖含量测定的不确定度分析[J].食品安全导刊, 2016(15):126-127.

NIU G Y, WANG Z Z, REN J K.Uncertainty analysis of determination of total sugar content in dried jujube[J].China Food Safety Magazine, 2016(15):126-127.

[19] 孙静涛, 马本学, 董娟, 等.基于特征波长提取的哈密大枣可溶性固形物的高光谱预测[J].现代食品科技, 2016, 32(9):174-179;223.

SUN J T, MA B X, DONG J, et al.Characteristic wavelength selection-based prediction of soluble solids content of Hami big jujubes using the hyperspectral imaging technology[J].Modern Food Science and Technology, 2016, 32(9):174-179;223.

[20] LAKHO A B J, SOOMRO A H, HAMMAD H H M.Effects of pectin on the reducing and non-reducing sugar and total sugar percentage of date jam[J].Journal of Biology, Agriculture and Healthcare, 2017, 7(3):84-87.

[21] 余优森, 葛秉钧, 蒲永义.苹果含糖量与温度关系的研究[J].中国农业气象, 1990, 11(3):34-38.

YU Y S, GE B J, PU Y Y.Study on the relationship between apple sugar content and temperature in apples[J].Chinese Journal of Agrometeorology, 1990, 11(3):34-38.

[22] 陈燕, 张健, 魏佳, 等.一氧化氮熏蒸抑制干制灰枣黑曲霉病及贮藏品质保持[J].农业工程学报, 2019, 35(12):297-303.

CHEN Y, ZHANG J, WEI J, et al.Nitric oxide fumigation inhibiting Aspergillus niger disease and maintaining storage quality of dried ash jujube[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2019, 35(12):297-303.

[23] WANG C T, CAO J K, JIANG W B.Effect of the drying method on browning of flesh, antioxidant compounds and antioxidant capacity of Chinese jujube (Zizyphus jujuba Mill.) fruit[J].Current Topics in Nutraceuticals Research, 2016, 14(2):161-169.

[24] HUA S H, HSU H C, HAN P. Development of detection system with low predictive errors for determining vitamin c content of indian jujube. Applied Sciences,2019,9(24):5317.

[25] 邹荣. 不同水果中维生素C含量的测定及其影响因素研究[J].食品安全导刊, 2021(21):190-192.

ZOU R.Determination of vitamin C content in different fruits and its influencing factors[J].China Food Safety Magazine, 2021(21):190-192.

[26] 杨红娟. 解脂亚罗酵母Y-2降解赭曲霉毒素A机制的研究[D].镇江:江苏大学, 2018.

YANG H J.Study on the mechanisms involved in degradation of ochratoxin A by Yarrowia lipolytica Y-2[D].Zhenjiang:Jiangsu University, 2018.

[27] 赵云, 李鹏兵, 唐冬梅, 等.花后高温对小麦籽粒淀粉合成及相关酶活性的影响[J].新疆农业科学, 2018, 55(2):210-218.

ZHAO Y, LI P B, TANG D M, et al.Effects of post-anthesis high temperature stress on starch synthesis and activities of related enzymes in wheat grain[J].Xinjiang Agricultural Sciences, 2018, 55(2):210-218.