双乙酸钠(sodium diacetate, SDA)分子式为C4H7NaO4,是一种性质稳定、价格低廉的防腐剂和酸味剂[1]。联合国粮农组织和世界卫生组织于1987年批准双乙酸钠作为防腐剂在食品中使用[2],在糕点和水产品中应用较为广泛[3-4]。双乙酸钠在水溶液中以游离乙酸和乙酸根形式存在,GB 25538—2010《食品安全国家标准 食品添加剂 双乙酸钠》中对其游离乙酸含量规定为39%～40%。我国食品添加剂使用标准GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定了食品中双乙酸钠可使用的最大限量,其中豆制品仅豆干类及豆干再制品可限量使用双乙酸钠。
据文献报道,测定食品中双乙酸钠含量时的样品净化方式主要有硫酸锌-氢氧化钾沉淀蛋白[5]、正己烷除油脂[6]、蒸馏[7]以及固相萃取[8]等,检测方法主要有高效液相色谱法[9]、气相色谱法[10]、离子色谱法[11]以及在线衍生-双三元高效液相色谱法[12]等,而张晓梅等[13]通过显色后的分光光度法快速测定食品中的双乙酸钠。目前我国仅GB 5009.277—2016《食品安全国家标准 食品中双乙酸钠的测定》可检测食品中双乙酸钠含量,该方法是以直接浸提法或蒸馏法对样品进行净化处理后经高效液相色谱测定,同时在附录B中规定乙酸本底值的测定方法。检测原理是:试样中双乙酸钠经酸化后转化为乙酸,通过水蒸气蒸馏,收集后调pH,经高效液相色谱测定,外标法定量。因此采用GB 5009.277—2016测定双乙酸钠时实际测定的是乙酸根,并通过酸化、不酸化分别测定豆制品中双乙酸钠和乙酸含量,以酸化与不酸化蒸馏结果差值为双乙酸钠最终测定值。
据反映,部分生产企业声称未添加双乙酸钠用于防腐,但在终产品中检出双乙酸钠且含量较高,部分超过GB 2760—2014允许的最大使用量。有文献报道大豆原料存在乙酸本底[14],部分豆制品在加热、发酵过程中会产生乙酸、丙酸等有机酸[15],食醋等调味品的使用也会在终产品中引入乙酸或乙酸根[16]。为研究部分声称未使用双乙酸钠但终产品含量较高的原因,本文采用GB 5009.277—2016测定大豆、不同豆制品中双乙酸钠和乙酸含量,并对该标准乙酸本底扣除法,发酵和调味过程,以及乙酸、乙酸钠、乙酸铵等化合物对豆制品中双乙酸钠含量的影响进行详细研究,为采用GB 5009.277—2016检测豆制品中双乙酸钠提供技术支持,也为市场监督管理部门依据该标准检测并判定不合格产品的核查方向提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
双乙酸钠、乙酸、乙酸铵、乙酸钠标准品(纯度均大于95%),中北京曼哈格生物科技有限公司;甲醇(色谱纯),德国Merck公司;磷酸、磷酸氢二铵(分析纯),广州化学试剂厂。
市售硅油、食用盐、香辛料及食用酒精。经GB 5009.277—2016进行本底值筛查,选用未检出的原料进行实验。
大豆、再制豆干、腐竹、腐乳及豆豉均为市售产品。
1.2 仪器与设备
SPD-M20A高效液相色谱仪,日本Shimadzu公司;SymmetryShield-TM RP18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)美国Waters公司;BT125D型电子天平,德国赛多利斯;S400-K pH计,梅特勒-托利多;HR-6组织捣碎机,上海沪析实业有限公司;KjeltecTM 2200蒸馏仪,丹麦Foss公司;Centrifuge 5804高速离心机,德国Eppendorf公司;Milli-Q超纯水系统,美国Millipore公司;IKA® MS 3 digital漩涡振动器,德国IKA公司;KQ-500DE型数控超声波清洗器,中国昆山市超声仪器有限公司;0.22 μm滤膜,北京泰科瑞迪国际贸易有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液的配制
精密称取净含量相当于1 g的标准物质于100 mL容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混匀即得浓度为10.0 mg/mL的储备液,4 ℃保存。
1.3.2 仪器条件
色谱柱:SymmetryShield-TM RP18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:1.5 g/L磷酸氢二铵溶液,用1 mol/L磷酸溶液调节pH为3.0;流速:1 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:214 nm;进样体积:10 μL。
1.3.3 双乙酸钠和乙酸测定实验
依据GB 5009.277—2016方法,以双乙酸钠为标准品分别测定大豆及豆制品中的双乙酸钠含量;依据附录B方法,以乙酸为标准品测定大豆及豆制品中乙酸含量。
1.3.4 本底扣除法对双乙酸钠含量的影响实验
以经1.3.3检测结果均为阴性的再制豆干为基质,制备双乙酸钠含量为1.0 g/kg加标样品,按GB 5009.277—2016方法分别进行酸化、不酸化蒸馏,按1.3.2条件检测并比较测定结果。
1.3.5 乙酸、乙酸钠和乙酸铵对双乙酸钠含量的影响实验
以经1.3.3检测结果均为阴性的再制豆干为基质,用双乙酸钠与乙酸、乙酸钠、乙酸铵分别以质量比1∶1制备1.0 g/kg的加标样品,并按GB 5009.277—2016方法分别进行酸化与不酸化蒸馏检测。
1.3.6 发酵与调味过程对双乙酸钠含量的影响实验
参考文献[17]模拟腐乳生产过程,分别于发酵0、7、14 d取样,于发酵第14天,用盐、香辛料及食用酒精(经GB 5009.277—2016方法均未检出双乙酸钠和乙酸)进行处理后继续发酵,并于发酵第45、60、90、120、150天取样,所有样品按GB 5009.277—2016方法分别进行酸化与不酸化蒸馏检测。
2 结果与分析
2.1 大豆及豆制品中双乙酸钠、乙酸测定结果
配制系列双乙酸钠标准工作溶液,按酸化蒸馏法进行操作,以峰面积(y)-浓度(x)作校正曲线,得到线性回归方程,双乙酸钠与乙酸在5～400 mg/L内线性关系均良好,相关系数均大于0.998,双乙酸钠线性方程为y=0.184 01x+0.119 23,乙酸线性方程为y=0.179 35x+0.116 93。双乙酸钠标准溶液相色谱图见图1,再制豆干的双乙酸钠液相色谱图见图2。31批次大豆中均检出双乙酸钠和乙酸,双乙酸钠含量为0.15～0.52 g/kg,平均含量为0.29 g/kg;乙酸含量为0.13～0.44 g/kg,平均含量为0.25 g/kg,乙酸含量分布如图3所示。
图1 双乙酸钠标准溶液色谱图(50 mg/L)
Fig.1 Chromatogram of sodium diacetate standard solution (50 mg/L)
研究分别对市售豆制品(包含腐乳、豆豉等发酵性豆制品,再制豆干、腐竹等非发酵性豆制品)中双乙酸钠进行检测,结果显示除7批次再制豆干,其余样品均检出一定量的双乙酸钠,结果见表1。
图2 再制豆干中双乙酸钠色谱图(90 mg/L)
Fig.2 Chromatogram of sodium diacetate in processed dried bean (90 mg/L)
图3 31批大豆中乙酸含量分布
Fig.3 Distribution of acetic acid content in 31 batches of soybean
分别取检出双乙酸钠的大豆及豆制品,按照GB 5009.277—2016附录B方法,以乙酸为对照品制备标准曲线,测定各样品中乙酸含量,并计算扣除乙酸本底后样品中双乙酸钠含量。双乙酸钠含量的计算如公式(1)所示:
扣除乙酸本底后双乙酸钠含量/(g·kg-1)=
(1)
式中:X,GB 5009.277—2016测得样品中双乙酸钠含量,g/kg;X0,GB 5009.277—2016附录B测得样品中乙酸含量,g/kg;142.09,双乙酸钠分子质量;60.5,乙酸分子质量。
测定结果如表2所示,研究表明经扣除乙酸本底后,大豆中均未检出双乙酸钠;而检出双乙酸钠的豆制品,在扣除乙酸本底后仍有52.44%(161/307)的样品检出双乙酸钠,其中76.25%(122/160)的样品中双乙酸钠含量高于GB 2760—2014中的最大使用量。表3例举部分大豆及豆制品中双乙酸钠、乙酸及扣除乙酸本底后双乙酸钠的含量。
表1 市售豆制品中双乙酸钠含量测定结果
Table 1 Determination results of sodium diacetate in commercial bean products
指标再制豆干腐竹、油皮腐乳豆豉检测批次150146090检出率/%95.33100.00100.00100.00含量范围/(g·kg-1)0.01～1.480.12～1.360.15～3.550.08～3.16平均含量/(g·kg-1)0.280.641.441.48≥大豆平均含量(0.29 g/kg)批次98125782≥1.0 g/kg的含量范围/(g·kg-1)1.04～1.481.361.02～3.551.01～3.16
注:GB 2760—2014中规定再制豆干最大使用量为1.0 g/kg,其余产品均“不得使用”
表2 大豆及豆制品扣除乙酸本底后双乙酸钠检出情况
Table 2 The results of sodium diacetate in soybean and bean products after deducting acetic acid background
样品分类检测批次检出双乙酸钠批次扣除乙酸本底后检出双乙酸钠批次扣除本底后双乙酸钠含量/(g·kg-1)扣除本底后超过GB 2760—2014规定的批次扣除本底后超过GB 2760—2014规定的占比/%再制豆干150143530.11～1.291426.42腐竹、油皮141460.20～0.776100.00腐乳6060400.07～2.1840100.00豆豉9090620.32～2.2362100.00大豆31310/00.00
注:/表示无数据
2.2 本底扣除法对双乙酸钠的影响情况
双乙酸钠加标样品(1.0 g/kg)研究结果如表4所示,采用GB 5009.277—2016本底扣除法测定双乙酸钠含量时,由于双乙酸钠在水溶液中存在游离乙酸,测定乙酸本底时也会被同时蒸出,因此不加酸蒸馏结果并不能代表乙酸本底,且会导致双乙酸钠含量测定结果偏低。
2.3 乙酸、乙酸钠和乙酸铵对双乙酸钠测定的影响情况
研究结果如表5所示,样品中加入的乙酸、乙酸钠、乙酸铵均被检测为双乙酸钠含量,且除乙酸外,乙酸钠和乙酸铵均不可通过本底扣除法消除其对双乙酸钠测定结果的影响,进而导致双乙酸钠的假阳性结果。此外,若在豆制品制备过程使用了乙酸,且乙酸在样品中以盐的形式存在,本底扣除法也无法完全避免其对双乙酸钠测定结果的影响,同样会导致双乙酸钠测定结果偏高。
表3 部分大豆及豆制品中乙酸及扣除乙酸本底后 双乙酸钠含量(n=3) 单位:g/kg
Table 3 The contents of acetic acid and sodium diacetate (after deducting acetic acid background) in some soybeans and bean products (n=3)
样品分类双乙酸钠含量乙酸含量扣除乙酸后双乙酸钠含量再制豆干1.48±0.010.19±0.011.291.23±0.030.4±0 0.76 1.1±0.020.06±0 1.030.48±0 0.12±0 0.340.37±0.02 0.2±0.010.130.31±0.010.1±0 0.19腐竹、油皮1.36±0.050.50±0 0.770.80±0.020.24±0 0.520.60±0 0.10±0 0.480.54±0 0±00.540.28±0 0.07±0 0.20.27±0.010±00.27腐乳3.55±0.03 2.6±0.150.472.33±0.040.13±0.012.181.71±0.030±01.71 0.6±0.010.05±0 0.54 0.3±0.010.31±0.01未检出0.22±0 0.13±0.010.07豆豉3.16±0.090.98±0.0122.66±0.051.03±0.011.442.24±0.030.86±0.011.232.23±0.090±02.230.99±0.020.18±0 0.780.47±0.020±0 0.47大豆0.15±0 0.14±0 未检出0.27±0 0.26±0 未检出0.28±0 0.28±0 未检出0.34±0 0.31±0.01未检出0.42±0.010.45±0.01未检出0.52±0 0.50±0.01未检出
表4 双乙酸钠加标样品实验结果(n=3) 单位:g/kg
Table 4 The results of sodium diacetate spiked samples (n=3)
添加水平双乙酸钠含量乙酸含量扣除乙酸后双乙酸钠含量1.00.92±0.010.41±0.010.44±0.01
2.4 发酵与调味过程对双乙酸钠含量的影响情况
为研究发酵和调味过程对腐乳中双乙酸钠含量的影响,以大豆为原料,模拟腐乳生产过程,并检测该过程不同阶段样品中双乙酸钠含量和乙酸含量。研究结果如图4所示,随着发酵时间的延长,样品中检出双乙酸钠和乙酸。调味前的样品经扣除乙酸本底,样品中双乙酸钠含量为0.06～0.28 g/kg;调味后,随着发酵时间延长,样品中双乙酸钠和乙酸含量逐渐增加,扣除乙酸本底后样品中双乙酸钠含量为0.20～2.12 g/kg,且发酵第60天及以后的样品经扣除乙酸本底其含量均大于1.0 g/kg。研究结果显示,大豆在发酵过程中会产生乙酸,且随着发酵时间的延长乙酸含量呈上升趋势,在采用GB 5009.277—2016检测双乙酸钠时会出现阳性结果,而扣除本底法并不能完全消除乙酸的影响,分析可能因发酵产生的部分乙酸转化为盐的形态,从而导致扣除乙酸本底后双乙酸钠含量仍呈上升趋势。
表5 含乙酸根类化合物对双乙酸钠测定的影响(n=3)
Table 5 Influence of compounds containing acetate on the determination of sodium diacetate (n=3)
加标物加标水平/(g·kg-1)双乙酸钠乙酸含量/(g·kg-1)RSD/%含量/(g·kg-1)RSD/%扣除乙酸后双乙酸钠含量/(g·kg-1)乙酸1.0 1.101.80.881.10.07乙酸钠1.0 0.760.9未检出/0.76乙酸铵1.0 0.831.1未检出/0.83双乙酸钠+乙酸0.5+0.51.010.30.652.30.24双乙酸钠+乙酸钠0.5+0.50.860.60.204.80.63双乙酸钠+乙酸铵0.5+0.50.891.00.201.90.66
图4 腐乳发酵过程中乙酸、双乙酸钠含量变化情况(n=3)
Fig.4 Changes of acetic acid and sodium diacetate contents in Sufu during fermentation (n=3)
3 结论
本研究通过GB 5009.277—2016标准本底扣除法检测31批次大豆和314批次豆制品,31批次大豆均未检出双乙酸钠,52.44%的豆制品检出双乙酸钠,其中76.25%豆制品的双乙酸钠含量高于GB 2760—2014中相应产品的最大使用量。通过对该方法的影响因素进一步研究发现,采用GB 5009.277—2016标准检测添加了双乙酸钠的豆制品,若样品中双乙酸钠以乙酸钠和乙酸两种状态同时存在或全部以乙酸形式存在时,本底扣除法会导致双乙酸钠含量测定结果偏低;样品中乙酸的存在形态会显著影响双乙酸钠的测定,当乙酸以游离态存在时,不加酸蒸馏的方式能够完全将其蒸馏出来,若样品中的乙酸呈结合态(如乙酸钠、乙酸铵等盐),则不加酸时蒸馏不完全,乙酸本底扣除法结果偏高;添加剂乙酸钠、化学试剂乙酸铵等含有乙酸根的物质也会影响双乙酸钠的检测,且不能通过本底扣除法消除这类物质的影响。此外,腐乳类发酵豆制品在发酵过程中会产生乙酸,若乙酸在发酵过程中存在形式发生变化同样也会导致双乙酸钠检测结果呈阳性。因此,采用GB 5009.277—2016检测大豆及豆制品中双乙酸钠含量时,其阳性结果只能表示样品中存在乙酸和/或乙酸根两种形态,并不能直接判定样品中使用了食品添加剂双乙酸钠。若检验机构采用GB 5009.277—2016检测豆制品中双乙酸钠并判定不合格,建议市场监管部门结合现场检查、企业举证等方式,综合判断是否存在实际添加行为。
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