牛蒡又名东洋森、大力子、牛子等,属菊科牛蒡属直根系二年生草本植物。我国原有的牛蒡资源多为野生状态、资源较少,主要为药用。约公元920年牛蒡由我国传播至日本,并被培育为优良品种。牛蒡在日本、韩国以及东南亚被认为是一种具有较高营养、保健功能的蔬菜,被誉为“东洋参”[1]。近年来,牛蒡新品种也从日本被引进我国。牛蒡的嫩叶、根、茎、叶和果实都可食用。牛蒡叶形宽,呈心形或卵形,长约40～50 cm,宽约30～40 cm,表面为绿色无毛状,背面为白灰色绒毛,顶部圆钝,基部含柄状呈心形。牛蒡根肉质粗壮,圆锥形,全部入土生长,可长达35～100 cm,直径约为3～4 cm,重量可近1 kg。牛蒡子为长倒卵圆形,略扁,长约0.5～0.7 cm, 宽约0.2～0.25 cm,厚度约0.15 cm,表面为灰褐色,常散生有紫黑色的斑点以及竖条纵棱。牛蒡本身含有较多的次生代谢产物,可以抵御病虫侵害,受到农业和化肥的污染相对较轻,且种植的成本低,经济效益较好,在我国实现了大面积人工种植。我国西北、华中、华北以及东北等地区均为牛蒡的主要产区,牛蒡在江苏、山东等省份已经成为主要出口农产品[2],其种植面积已大于2.33万hm2,仅江苏徐州丰县牛蒡的种植面积已大于1万hm2。牛蒡本身营养丰富,含有淀粉、菊糖、蛋白质、牛蒡酸、脂肪酸、醛类、多炔物质以及聚糖类的化合物等,其中膳食纤维类物质在牛蒡中占比较大,多糖类膳食纤维含量约占牛蒡总重量的25%,主要包括菊糖、纤维素、阿拉伯半乳聚糖、葡萄聚糖、鼠李半乳聚糖、木聚糖等,功能性果寡糖菊糖含量就占牛蒡根重量的16%[3]。牛蒡膳食纤维中的多糖聚合度适宜,多为2～60。长期食用牛蒡有促进血液循环,降低血糖和胆固醇,防止人体衰老,清除肠胃垃圾、抗菌消炎等作用,同时牛蒡对于尿毒症以及肿瘤都有较好的预防、抑制作用。
膳食纤维指能抵抗人体小肠的消化吸收,在人体大肠内发酵为可利用的植物性成分,主要包括寡糖、多糖、木质素、果胶、纤维素、半纤维素、海藻糖等[4]。膳食纤维分为水不溶性膳食纤维与水溶性膳食纤维。膳食纤维自身产生热量低,具有较强膨胀和吸水作用,能够在胃肠中吸水成凝胶状物质,形成不易被分解的网状结构,增强饱腹感。膳食纤维能加速肠道蠕动并增加肠道黏液,减少肠道对食物的摄取[5],膳食纤维还能够缩短食物在肠道内的时间,有效减弱α-淀粉酶降解淀粉作用,延长酶解时间。同时膳食纤维也可与葡萄糖结合,阻碍葡萄糖的吸收和利用,降低肠液中的葡萄糖浓度,从而改善血糖。经过肠道微生物发酵的膳食纤维,能够有效减少心血管疾病,降低血浆中胆固醇含量、促进肠道益生菌生长等[6]。膳食纤维还能够提高机体胰岛素受体的敏感性,改变肠内末梢组织对于胰岛素的敏感程度,降低胰岛素需求,增强胰岛素的药理学作用,延缓餐后血糖的升高和胰岛素的升高,使血糖能够维持相对稳定。研究表明增加摄入膳食纤维,对预防二型糖尿病也有一定的作用[7]。
国外上世纪以来就对植物来源的膳食纤维对人体代谢调控影响等生理作用进行了相应研究,其中部分高膳食纤维的功能性食品作为膳食补充剂通过了美国食品药品监督管理局的认证并获得中国卫生部批准在中国销售。我国对于膳食纤维的制备工艺技术研究、应用研究、药理学研究等尚处于起步阶段[8]。而对牛蒡资源的主要研究热点集中于牛蒡本身简单加工利用,牛蒡多糖类膳食纤维的提取工艺研究与改进等。
1 牛蒡多糖类膳食纤维制备方法研究现状
牛蒡多糖类膳食纤维的制备方式主要分粗制备法、化学制备法、辅助制备法、酶制备法等。虽然一些牛蒡中含有的多糖类膳食纤维存在于细胞壁外(胞外多糖),但大多数多糖类膳食纤维仍旧主要存在于细胞壁(胞内多糖)中。因此在提取过程中首先是破碎牛蒡细胞,传统的物理方法可在不改变多糖性质的情况下进行提取,新设备以及生物酶等方式的使用可使不溶性的多糖膳食纤维经过改构、降解等特性变为水溶性多糖膳食纤维,从而提高多糖膳食纤维的提取效率。
1.1 粗制备法
粗制备法包括气流分级法、悬浮法以及热水浸提法。此类方法得到的膳食纤维不够纯净,但可以改变原料中各组分的相对含量,增加膳食纤维的相对含量。该类方法主要适用于膳食纤维原料的预处理,不适合高纯度膳食纤维的制备。袁平川[9]使用热水浸提法提取到了牛蒡中的多糖膳食纤维等物质并研究了不同的提取条件对膳食纤维提取纯度的影响。
1.2 化学制备法
化学制备法是将膳食纤维原料干燥、粉碎、过筛、称量后,采用化学试剂提取膳食纤维,包括酸法、碱法、絮凝剂法、双水相萃取法等,其中碱提取法是在稀碱液的作用下,使植物细胞壁吸水破裂,从而使游离的多糖等物质释放出细胞壁。周浓等[10]利用碱液优化获得具有较高结构特性的牛蒡多糖类膳食纤维。巫永华等[11]利用超声辅助双水相法提取牛蒡多糖类膳食纤维,建立了PEG/(NH4)2SO4双水相体系,最终获得(32.35±0.85)%的牛蒡多糖类膳食纤维的萃取率。
1.3 辅助制备法
辅助制备法主要包括超声辅助制备法,微波辅助制备法等。超声辅助制备法是指使用超声波产生强烈空振作用、机械效应等破坏植物细胞薄膜,释放内部物质。JIANG等[12]以及胡建[13]都通过优化超声辅助制备的料液比、超声功率等条件提取到了牛蒡膳食纤维中的多糖物质。但目前因超声设备功率,稳定性以及噪音问题,该方法在工业大规模生产中还不能形成规模化应用[14]。微波辅助制备法是利用微波具有强穿透力的特点,使用微波的高能量破坏植物细胞组织,释放内部含有的物质。杨萍等[15]通过优化微波辅助制备法获取了13.41%的牛蒡多糖类膳食纤维收率。唐仕荣等[16]采用常压、高压结合微波辅助制备法分别得到28.84%、31.97%的牛蒡多糖类膳食纤维,部分研究也使用超声-微波协同制备法提取牛蒡膳食纤维。
1.4 酶制备法
酶制备法利用膳食纤维的水合与黏度特性进行提取。通常使用包括淀粉酶、蛋白酶、阿拉伯聚糖酶、纤维素酶等处理原料中的蛋白质、脂肪等杂质,从而制备高纯度膳食纤维。使用酶法获取膳食纤维因采用酶多次水解,获取的膳食纤维纯度高,原料利用率高,因此适用蛋白质、淀粉含量比较高的原料。酶制备法具有工艺简单、膳食纤维提取纯度高、原料利用率高等优点,可以弥补化学提取的不足,提取过程不需要高压、高温,节约能耗,还可以省略化学制备法中部分工业化设备,因此具有较高的应用和研究价值[17]。高明侠等[18]利用8种不同的酶类采用正交实验方法获取了牛蒡多糖类膳食纤维,且证实双酶法对于牛蒡多糖类膳食纤维的得率更高。宋慧等[19]也通过使用纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶等获取到了得率较高,结构比较完整的牛蒡多糖类膳食纤维。部分研究也使用酶法结合超声等辅助提取法提取牛蒡中的多糖物质,增加回收率[20]。
虽然目前针对牛蒡多糖类膳食纤维提取的方法有较多研究且各种方法都具有自身的优缺点,但目前仍旧是以提高多糖类牛蒡膳食纤维的提取率作为主要的研究目标,对于提取获得的多糖种类并没有区分。随着技术和应用的发展,如何选择正确的提取方法并且提取特定的多糖种类,并根据特定多糖生物活性选择合适的提取方式可成为后续的主要研究内容。
2 牛蒡多糖类膳食纤维组成、结构特性研究现状
经过提取的牛蒡多糖类膳食纤维经过脱蛋白、脱色、透析处理后得到不同聚合度的多糖膳食纤维,其组成主要是由单糖连接聚合而成,具有环构象,链构象等构象多样性,因此增加了多糖纯度与糖类结构、链接形式的分析难度[21]。虽然对于糖类的分析方法目前已经较为成熟,但对于牛蒡多糖类膳食纤维的结构特性研究仍旧较少。目前研究者对于牛蒡膳食纤维相对分子质量的测定常采用高效空间排阻色谱法、高效凝胶渗透色谱法等研究技术。牛蒡多糖类膳食纤维经过水解衍生后,研究者通常辅助采用高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、离子交换色谱法等进行进一步结构分析。对于分析牛蒡多糖类膳食纤维所含官能团和化学键,常使用红外光谱分析法等[22]技术。
2.1 牛蒡多糖类膳食纤维纯度分析
紫外分光光度法在对分离制备的牛蒡多糖类膳食纤维组分检测中具有重要的应用。采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法,考马斯亮蓝蛋白测定法、改良美国谷物化学师协会标准法对牛蒡膳食纤维进行总糖、糖醛酸、蛋白质、水分等测定。在牛蒡多糖类膳食纤维含量进行测定时,需将多糖转为糖醛酸衍生物,再与酚类物质结合,因此使用紫外分光光度法在260 nm和280 nm处测定膳食纤维结构中的紫外吸收基团,判定样品中是否含有核酸、蛋白质等物质,最终确定提取物的纯度。
2.2 牛蒡多糖类膳食纤维分子质量测定
使用高效液相凝胶渗透色谱对牛蒡膳食纤维中多糖分子质量进行测定,此方法具有不截留分子、不丢失组分的特性,结合标准曲线可对牛蒡膳食纤维中多糖的相对分子质量进行区分和定性。
2.3 牛蒡多糖类膳食纤维单糖组成与含量分析
在对牛蒡多糖类膳食纤维的纯度、组成、分子质量等进行表征后,因牛蒡膳食纤维中的多糖单体为单糖,因此对单糖组成的分析对于了解牛蒡多糖的结构分析具有重要意义[23]。通常采用高效液相法、气相色谱法对膳食纤维中的单糖组分进行定性分析[24-25],2种方法需要将牛蒡多糖类膳食纤维完全水解为单糖混合物,经过衍生化后使用纯化单糖作为标准,使用糖腈衍生方法进行色谱分析,并结合气相质谱、液相质谱等技术,对单糖组成进行分子含量等确认。
2.4 牛蒡多糖类膳食纤维糖苷键、官能团分析
甲基化分析是对糖苷键连接的主要键型的连接形式,以及对连接的糖苷键数目进行定量分析的常用方法。在经过甲基化反应改变待测试物极性后,经过水解和还原并对还原后得到的物质进行衍生,辅助气质联用技术可对糖类连接的结构进行分析,包括糖残基的连接方式、位置、糖类残基的数目等信息[26]。傅里叶变换红外光谱在对牛蒡膳食纤维分析过程中,可用于分析糖苷键的主要构型,以及对内部主要官能团进行分析。通过在牛蒡膳食纤维在4 000～400 cm-1区域内的傅里叶变换红外光谱扫描,分析牛蒡膳食纤维的主要官能团变化,如在3 500～3 000 cm-1光谱范围内主要为O—H基团的伸缩振动,2 900 cm-1光谱范围主要为C—H基团的伸缩振动[27]。
2.5 牛蒡多糖类膳食纤维组成结构分析
核磁共振波谱法是对生物大分子空间构型检测的主要研究方法之一。使用核磁共振波谱法对牛蒡多糖类膳食纤维进行研究,包括其氢谱、碳谱等信息。综合核磁图谱的分析手段获取膳食纤维中的糖残基构型、连接次序、基团种类等信息,从而确定膳食纤维的结构特点[27]。
刚果红法是用于分析多糖类物质的三螺旋结构的主要方法。待测多糖类物质通过与刚果红结合,在不同碱性溶液条件下,其主要吸收峰会发生变化。通过检测最大吸收波长变化,判断牛蒡膳食纤维中三螺旋结构[28]。
使用扫描电镜对牛蒡多糖类膳食纤维进行高倍数的电镜检测,观察膳食纤维的微观结构特性。使用原子力显微镜对牛蒡膳食纤维样品中多糖组分的宽度、高度等信息进行检测,最终获取牛蒡多糖类膳食纤维的分子形态、螺旋结构等结构特性。
随着膳食纤维在人类饮食结构中的重要性研究不断提高,天然资源中的膳食纤维的开发和利用越来越被重视,对于膳食纤维中的单体、结构和特性也逐渐被研究。目前对牛蒡多糖类膳食纤维的研究相对起步较晚,对牛蒡膳食纤维的结构和特性研究还较少,现有的研究主要基于多糖类膳食纤维的整体纯度等,后续仍需要加强对其结构、官能团的探究,同时探究结构特性与生理性活性的相关性研究。
3 牛蒡多糖类膳食纤维生理学活性研究现状
牛蒡为药食同源植物,牛蒡的嫩叶和牛蒡根可供食用,而牛蒡的根、茎、叶和果实都可以作为药用。牛蒡主要的经济价值更体现在其药用和保健功效,据《本草纲目》的记载,牛蒡性温味甘,我国《中药大辞典》、《现代中医药大辞典》等国家权威性中药药典也把牛蒡的药理学作用主要概括为3个方面:(1)降血糖、抑制肿瘤作用;(2)抗菌消炎作用;(3)调节肠道微生态作用。长期食用牛蒡根有促进血液循环、降低血糖和胆固醇、防止人体衰老、清除肠胃垃圾、滋润皮肤、清理肠道、预防高血压和中风、抗菌消炎、调节血糖等作用,特别适合患有糖尿病的患者食用。
3.1 血糖调节活性
糖尿病因高发病率、死亡率已经成为仅次于癌症严重威胁人类健康的疾病,其主要是由于自身代谢系统问题。研究表明,增加摄入膳食纤维,减少脂肪的摄入对于预防二型糖尿病具有一定的作用。膳食纤维的强膨胀和吸水作用,使其在胃肠中吸水成为凝胶状物质,增强饱腹感,从而减少食物的摄取[5]。膳食纤维还能够增加粪便的水分以及体积,刺激肠道蠕动加速。膳食纤维本身对于油脂吸附能力也较强,能够帮助脂肪随粪便排出体外,从而对肥胖症的预防具有积极作用。科学研究表明,膳食纤维在控制餐后血糖升高以及改善耐糖量上,具有较好的效果。目前有研究提出膳食纤维改善血糖机制主要是能够增加肠道粘液,阻碍葡萄糖的吸收,同时膳食纤维可以与葡萄糖结合,导致肠液中的葡萄糖浓度降低。膳食纤维还可有效减弱α-淀粉酶降解淀粉作用,延长酶解时间,降低肠内葡萄糖释放速度,也可改变肠内末梢组织对于胰岛素的敏感程度,降低胰岛素需求,从而改善血糖[29]。牛蒡多糖类膳食纤维提取物在实验中能够较为显著持久性地降低血糖,提升机体对于糖类物质的耐受量[30]。贺学林等[31]以饲料混合牛蒡子喂食实验性模型大鼠进行实验,发现6周后给药组动物因高血糖引起的大鼠多饮多食以及体重减轻症状得到缓解,白蛋白的尿排泄量减轻,血清中的肌酐水平以及肾重/体重的比例降低,糖尿病的症状得到缓解。牛蒡也能较为明显的改善大鼠的PAS染色阳性基质的面积比值,减轻肾脏因血糖较高引起的病理性的损害,对糖尿病大鼠的早期肾脏病变具有一定的防治。胡利平等[32]以五味子、牛蒡子组成牛蒡子复合制剂治疗糖尿病大鼠,实验结果表明该复合制剂可以用于防治糖尿病的肾脏损伤,疗效与使用的剂量呈现正相关。王海颖等[33]分别使用牛蒡子水提取物、牛蒡子的粗粉、牛蒡子醇溶提取物用于治疗糖尿病的肾病大鼠,结果表明大鼠的尿量、肾重/体重,白蛋白量等都较为明显的减少。
3.2 抗肿瘤活性
恶性肿瘤又称为癌症,是危害健康的最重大疾病之一,在肿瘤的治疗和研究过程中,多糖类物质被发现具有重要的抗肿瘤作用。多糖类物质可以抑制癌细胞的基因扩增来抑制肿瘤细胞生长或诱导细胞凋亡,从而起到抗癌作用[34]。牛蒡中含量较为丰富的菊糖也具有较高的抗肿瘤功效,牛蒡中的牛蒡苦素能够抑制肿瘤细胞内的硫酸果糖激酶活性,具有免疫活性的牛蒡苷以及牛蒡苷元也能够有效抑制肿瘤细胞的热休克蛋白表达,有助于高温治疗对癌细胞的作用。魏东等[35]发现牛蒡根中的多种多糖、多酚物质,如绿原酸、咖啡酸等都具有一定的抗突变以及抑制肿瘤细胞生长的作用,其抗突变作用的能力与牛蒡中的多糖、多酚含量呈正相关的关系。
3.3 抗氧化活性
生物体中低水平活性氧可以促进细胞在分化、进程和凋亡停滞中的信息传递。但过量的活性氧会打破氧化还原稳定状态,导致氧化应激。生物体内的自由基能够调节细胞生长、抑制细菌等作用,但部分自由基也会导致癌症、衰老等疾病。研究发现天然提取物,如多糖类等物质能够抑制脂质过氧化,加强生物体对于自由基的清除能力。牛蒡因含有较多的多糖类膳食纤维,具有较为明显的抗氧化作用[36]。牛蒡根经过水煮后对大鼠进行30 d灌胃,结果表明大鼠的肝组织、血清内的超氧化物歧化酶活性明显提高,但脑组织、血清内的丙二醛含量则降低明显,结果表明牛蒡具有较好的抗衰老的作用[37]。在牛蒡的抗衰老体外实验中,KARDO
OV
等[38]通过实验发现牛蒡中的多糖成分能够显著抑制由羟自由基导致的卵磷脂脂质体的过氧化反应,其抑制能力相当于维生素E的45%。严斌等[39]使用邻苯三酚自氧化法测定牛蒡的抗氧化作用,结果证明牛蒡具有明显抗氧化作用,对经过邻苯三酚处理后的人老化后的红细胞细胞膜具有保护作用。金春英等[40]也利用邻苯三酚法对牛蒡提取液抗自由基的能力进行了研究,发现牛蒡中较多的多酚、多糖类物质使得牛蒡提取液具有较强的自由基清除能力。
3.4 抗炎症、抗菌活性
牛蒡本身具有抗菌的成分,牛蒡叶片在开花期时能够主要抵抗金黄色葡萄球菌,牛蒡子的水浸剂对多种致病性真菌均有一定程度的抑制效果。牛蒡中含有的多糖类化合物也具有抗菌作用,当提取物浓度达到一定浓度后也会对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等有抑制作用。同时牛蒡多糖类物质还具有低毒性,低抗性的抗病毒作用。
3.5 肠道微生态调节活性
肠道微生态主要功能是预防胃肠道疾病以及对免疫的调节。因此肠道微生物菌群结构平衡对人体健康有重要意义[41-42]。肠道微生态会受到内源性以及食物等环境因素影响,造成其组成和代谢功能变化。膳食纤维在小肠内不易被消化和吸收,但在大肠中可被微生物发酵,具有生理学作用[43]。经过发酵的膳食纤维可以产生部分代谢副产物,如短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs),包括丁酸、乙酸、丙酸等。研究证明SCFAs对于维持肠道生理功能以及结肠内上皮细胞细胞形态具有重要作用,SDFAs同时也可为肠道微生物提供能量[44]。肠道微生态是人体较为复杂和主要的生态系统,肠道菌群作为系统内的主要微生物,是宿主与环境之间抵御疾病的物理和免疫屏障。通过膳食纤维在肠道微生物发酵下产生的代谢产物可以促进肠道中益生菌的生长,抑制有害菌丰度,维持肠道微生态[45-46]。SHTRIKER等[47]研究发现,含15%纤维-柑橘果胶或半乳甘露聚糖的饮食能明显提升小鼠体内SCFAs水平,同时含半乳甘露聚糖组还能减缓小鼠体重增加并改善葡萄糖代谢。CHAMBERS等[48]使用一种新型菊粉-丙酸酯,将丙酸盐特异性的输送到肥胖人群的结肠中进而研究其饮食调节作用。结果发现,丙酸盐可显著刺激人结肠细胞释放YY肽和胰高血糖素样肽-1并减少能量摄入。该研究首次表明,增加结肠中丙酸盐可减少超重人群体重的增加。另外,作为最重要SCFAs的丁酸盐因其对肠内稳态和能量代谢的健康益处而饱受关注。徐永杰等[49]研究发现牛蒡多糖类膳食纤维能使肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌增多,且与使用剂量呈正相关作用。
牛蒡多糖类膳食纤维因本身多糖种类复杂,连接形势和位点多样,分子聚合度不同导致其自身不易被小肠吸收。在肠道微生物的发酵和代谢下,产生对身体有益的物质。但消化和降解多糖类膳食纤维需要多种酶类的参与,且对肠道微生物菌落组成和代谢产生较大的影响。因涉及到的膳食纤维结构,肠内微生物组成等因素,目前对于牛蒡多糖类膳食纤维的生理学作用仍旧处于初步认知阶段,后续的研究对于揭示膳食纤维对人体健康作用的机理以及功能性应用都具有较高的研究意义。
4 结语
牛蒡作为具有较高食药两用价值的农作物,国内主要研究重点仍旧是牛蒡粗加工等。虽然部分的研究已经涉及牛蒡膳食纤维药理学的作用研究,但对于牛蒡膳食纤维结构特性、发酵后对肠道微生态影响以及血糖调节等生理学机制研究都处于初步研究阶段,研究内容不够系统和完整。牛蒡多糖类膳食纤维对肠道微生态的影响,包括微生物菌群变化、关键肠道代谢物指标变化都没有较为细致的分析。同时牛蒡膳食纤维对于血糖调节等的药理学作用研究不深入,对于糖代谢关键酶类如影响肠道对于葡萄糖吸收有关的α-葡萄糖苷酶抑制等影响情况、血糖吸收情况等影响都没有做出细致研究,同时关于牛蒡多糖类膳食纤维抑制肿瘤的研究也处于较为初步的肿瘤表现研究。因此对于牛蒡多糖类膳食纤维的药理学研究,能够为牛蒡的种植以及以牛蒡膳食纤维为基础的产品开发提供理论支持,为开发对糖尿病患者的血糖调节、肿瘤患者的肿瘤抑制等有作用食物和药物提供理论指导,对提高糖尿病、肿瘤患者的生活质量具有积极作用。
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