我国山楂种植历史悠久,种质资源丰富,是世界第三大山楂栽培中心,种植总面积达8.67万hm2,年产量150多万t,主要分布在北方地区[1]。山楂通常作为绿篱和观赏树,其果(一般也称为山楂)可生吃或做果酱果糕,干制后可入药,有健胃、消积化滞、舒气散瘀等功效[2]。山楂中含有黄酮类化合物、原花青素、有机酸和表儿茶素等多种功能性成分,目前已从山楂中成功分离出超过150余种化合物[3]。多糖是山楂中重要功能活性成分,其含量可达山楂干重的6.4%[4]。研究表明,山楂的品种、成熟度、贮藏时间、提取纯化方法等不同可引起山楂多糖组成结构及功能活性的差异。溶剂提取法(水提法、酸/碱提取法及酶解法等)或辅助溶剂提取法(超声、微波等)是常用的山楂多糖提取方法。通过比较热水浸提、超声辅助、酶法辅助及超声-酶法辅助提取方法对山楂多糖得率、组成结构及体外抗氧化活性的影响发现,不同提取方法对山楂多糖的单糖组成无显著影响,鼠李糖、木糖、葡萄糖和半乳糖为山楂多糖的主要单糖组分。超声-酶法辅助提取山楂多糖得率[(10.39±0.04)%]最高且体外抗氧化活性最强,而热水浸提法提取所得山楂多糖分子质量最大[5]。ZHU等[6]利用DEAE-52树脂对酶法提取山楂粗多糖进行分离并得到6个组分,其中中性糖组分主要由葡萄糖构成,而酸性糖组分主要由半乳糖醛酸构成。
山楂多糖功能活性已被科学证实。山楂多糖可显著降低高脂膳食诱导小鼠的肝脏质量,通过抑制高脂诱导的SREBF-1c活化,显著降低相关的mRNA和蛋白质表达水平,降低脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶和丙酮酸激酶活性,从而降低肝脏中甘油三酯和总脂水平[7-8]。山楂多糖可显著降低肿瘤坏死因子-α与白细胞介素-6水平,提高白细胞介素-10水平,从而抑制NF-κB信号通路,缓解高脂膳食引起的大鼠肝脏炎症[9]。此外,山楂多糖还具有抗糖基化[6]、抑制腐败微生物[10]等健康功效。研究发现,山楂多糖的健康功效与其益生活性密切相关。ZHANG等[11]和GUO等[12]采用沸水浸提与DEAE SepharoseTM Fast Flow离子交换层析从山楂中提取并纯化得到了2个多糖组分HAW-1与HAW-2,结构分析发现二者均为葡聚糖。体外纯种发酵表明,HAW-1与HAW-2具有益生活性,可显著促进多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotamicron)、卵形类杆菌(Bacteroides ovatus)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longμm)的增殖并代谢产生乙酸和丙酸。然而,山楂多糖作为益生元对肠道菌群结构及代谢调节作用研究缺乏,限制了山楂多糖作为功能性食品原料在食品开发中的应用。
本研究采用水提醇沉法制备山楂多糖,经色谱层析纯化获得单一多糖组分HFP-2并对其分子质量、单糖组成、结构特征进行分析,采用体外粪便菌群发酵分析了HFP-2的益生活性,对发酵过程中pH变化、短链脂肪酸生成、肠道微生物组成变化进行监测,研究发现有望为山楂多糖相关益生功能食品的开发提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
山里红山楂(Crataegus pinnatifida var.major),河北怡达食品集团有限公司;SephadexTM G-500、Q-sepharoseTM Fast Flow,美国Cytiva公司;大孔树脂AB-8、透析袋(截留分子质量为3 500 Da),上海源叶生物科技有限公司;苯酚,上海麦克林生化科技有限公司;优级纯菊粉,比利时Orafti公司;BCA蛋白定量检测试剂盒,北京百瑞极生物科技有限责任公司;蛋白胨、酵母浸粉,美国Thermo scientific公司;吐温-80,西陇化工股份有限公司;L-半胱氨酸盐酸盐,常州百瑞吉生物医药有限公司;高铁血红素,上海碧云天生物技术有限公司;维生素K1、D-半乳糖醛酸,D-(+)半乳糖、D-无水葡萄糖、L-(+)鼠李糖、L-阿拉伯糖,北京索莱宝科技有限公司;其他试剂如无说明则均为国产分析纯。
1.1.2 仪器与设备
HB10旋转蒸发仪,德国IKA公司;LGJ-10冷冻干燥机,北京四环科技有限公司;CBS-C自动收集器,上海沪西分析仪器厂;BT100-2 J蠕动泵,兰格恒流泵有限公司;MuLTLSKANFC多功能酶标仪,美国Thermo scientific公司;754紫外可见分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司;HH-1数显恒温水浴锅,常州荣华仪器制造有限公司;3K15冷冻离心机,美国Sigma公司;PHS-3C pH计,成都世纪方舟有限公司;1200 Series高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;LC-20AD高效液相色谱仪,日本岛津公司;SPECTRUM 100傅里叶红外光谱仪,美国PkinElme公司。
1.2 实验方法
1.2.1 山楂多糖的提取
新鲜山楂去核后冷冻干燥,经粉碎后过200目筛后保存备用。取山楂果粉20.0 g以1∶20(质量比)加入去离子水,90 ℃水浴浸提120 min(500 r/min),浸提液冷却至室温后离心10 min(4 ℃,5 000 r/min)并收集上清液。加入2倍体积无水乙醇对上清液中的山楂多糖进行醇沉,4 ℃静置过夜后离心10 min(4 ℃,2 000 r/min)并收集沉淀即为山楂多糖,经冷冻干燥后保存备用。
1.2.2 山楂多糖的分离纯化
1.2.2.1 大孔吸附树脂AB-8脱色
准确称取山楂多糖0.50 g并溶解于50 mmol/L NaCl溶液(5 mg/mL)。采用大孔吸附树脂AB-8色谱柱(3.2 cm×28 cm)对山楂多糖溶液进行脱色,洗脱液为50 mmol/L NaCl溶液,流速为1 mL/min,于490 nm苯酚硫酸法对洗脱液中多糖进行监测。洗脱液中未检测出多糖后停止收集,收集洗脱液并合并,采用旋转蒸发仪进行浓缩,4 ℃条件下去离子水透析72 h(截留分子质量为3 500 Da),冷冻干燥后获得山楂多糖CHFP组分并保存备用。
1.2.2.2 Q-sepharoseTM Fast Flow阴离子交换层析
准确称取山楂多糖CHFP组分0.30 g溶解于20 mmol/L Tris-HCl缓冲液中(pH=8.0,300 mL),同时采用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液中(pH=8.0,200 mL)对Q-sepharoseTM Fast Flow离子层析柱(3.2 cm×28 cm)进行预平衡,将配制的山楂多糖溶液上样至阴离子交换层析柱后(流速2 mL/min),分别采用洗脱液A(Tris-HCl缓冲液,pH=8.0)和洗脱液B(含200 mmol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液,pH=8.0)对山楂多糖中中性组分和酸性组分进行洗脱,洗脱流速为 2 mL/min。采用自动收集器收集洗脱液,每管收集4 min,于490 nm 苯酚硫酸法测定各管中多糖含量,洗脱液中未检测出多糖后停止收集。绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线,对相应组分洗脱液进行合并并浓缩,4 ℃条件下去离子水透析72 h(截留分子质量为3 500 Da),冷冻干燥后获得山楂多糖HFP组分并保存备用。
1.2.2.3 SephadexTM G-500凝胶层析
采用SephadexTM G-500凝胶层析(1.6 cm×74 cm)对山楂多糖HFP组分进行进一步纯化。准备称取山楂多糖HFP组分0.10 g溶解于去离子水(10 mg/mL),上样量为5 mL,采用去离子水对凝胶层析柱进行洗脱。采用自动收集器对洗脱液进行收集,每管收集4 mL。采用苯酚硫酸法测定各管洗脱液中多糖含量,洗脱液中未检测出多糖后停止收集。绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线对洗脱山楂多糖组分进行合并,浓缩后4 ℃条件下去离子水透析72 h(截留分子质量为3 500 Da),冷冻干燥后获得山楂多糖HFP-2组分并保存备用。
1.2.3 分子质量测定
采用高效液相色谱法对纯化前后山楂多糖(CHFP与HFP-2)的分子质量进行测定。配制1 mL 1.0 mg/mL纯化前后山楂多糖溶液,过0.22 μm滤膜后采用安捷伦1200液相色谱仪进行分析。色谱条件为:示差检测器,色谱柱Agilent PL aquagel-OH MIXED-H(8 μm,300 mm×7.5 mm),流动相为纯水,柱温30 ℃,流速1.0 mL/min,进样量10 μL。以葡聚糖为标准品建立保留时间(min)与分子质量对数lg Mw的标准曲线,计算CHFP与HFP-2平均分子质量。
1.2.4 化学组成分析
1.2.4.1 总糖含量分析
于490 nm下采用苯酚硫酸法[13],以CHFP与HFP-2中单糖组成及其含量配制0.1 mg/mL标准溶液,对纯化前后的山楂多糖样品中的总糖含量进行检测。
1.2.4.2 蛋白含量分析
于562 nm下采用BCA法[14],以牛血清蛋白作为标准蛋白,对纯化前后的山楂多糖样品中的蛋白质含量进行检测。
1.2.4.3 单糖组成分析
分别称取5.0 mg纯化前后山楂多糖(CHFP与HFP-2)置于5 mL棕色安培管中,加入3.0 mL 2 mol/L三氟乙酸,密封后于110 ℃条件下水解8 h,加入2 mL甲醇中止反应,采用旋转蒸发仪对反应体系进行旋蒸干燥,重复该过程3次后加入去离子水溶解山楂多糖水解产物并定容至3 mL。
吸取250 μL山楂多糖水解物溶液至5 mL离心管中,加入250 μL 0.6 mol/L NaOH及500 μL 0.4 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)-甲醇,70 ℃水浴反应1 h。反应液冷却至室温后加入500 μL 0.3 mol/L HCl中和,再加入1 mL氯仿涡旋1 min,萃取3次后保留水相离心10 min(3 000 r/min,4 ℃),合并上清液。上清液过0.22 μm滤膜后采用岛津LC-20AD液相色谱仪对其中的单糖组分进行分析。色谱条件:紫外检测器,Xtimate C18色谱柱(4.6 mm×200 mm,5 μm),流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH=6.70)∶乙腈=83∶17(体积比),柱温30 ℃,流速1.0 mL/min,进样量20 μL,在250 nm下检测。
1.2.5 傅里叶变换红外光谱分析
称取纯化前后的山楂多糖样品(CHFP与HFP-2)10 mg,利用带有衰减全反射(attenuated total reflection,ATR)组件的SPECTRUM 100型傅里叶红外光谱仪对山楂多糖中的官能团进行分析,波数为4 000～600 cm-1,测定频率设置为1 cm-1。
1.2.6 山楂多糖体外粪便发酵
选取3名健康志愿者(18～25岁),要求志愿者半年内未服用抗生素类药物、未补充益生元类产品且无肠道疾病史。采集志愿者的新鲜粪便样品,借助小玻璃珠将粪便样品分散于PBS缓冲液,纱布过滤后配制成质量浓度为0.1 g/mL的粪便匀浆。配制5 mL基础培养基[基础培养基配方(g/L):蛋白胨2.0、酵母浸粉2.0、NaCl 0.1、K2HPO4 0.04、KH2PO4 0.04、MgSO4· 7H2O 0.01、CaCl2·6H2O 0.01、NaHCO3 2.0、吐温-80 2 mL,高铁血红素0.02,维生素K1 2 mL,胆盐0.5,L-半胱氨酸盐酸盐0.5],加入250 mL厌氧瓶中,灭菌后分别添加5 mL过滤除菌的0.2 mg/mL HFP-2与菊粉(阳性对照)溶液,接入10 mL粪便匀浆并混合均匀后通入氮气,37 ℃水浴厌氧发酵48 h。空白组不添加任何碳源。
1.2.6.1 微生物基因组提取和测序分析
取5 mL发酵液离心后(1 000 r/min,15 min)沉淀采用OMEGA Soil DNA Kit(D5625 01)试剂盒提取总DNA。选用细菌16S rRNA基因高度可变的V3、V4区进行扩增,特异性引物分别为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′),806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。扩增结束后采用2%琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,切取目的片段后使用Axygen凝胶回收试剂盒回收目的基因。利用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit(Illumina公司,美国)进行建库。对合格的文库,在Illumina NovaSeq上利用NovaSeq 6000 SP Reagent Kit(500个循环)进行2×250 bp的双端测序。测序数据使用QIIME2进行分析微生物群落多样性分析[15]。
1.2.6.2 发酵液pH测定
取5.0 mL各时间点发酵液至离心管,室温下测定发酵液pH。
1.2.6.3 短链脂肪酸分析
取0.5 mL各时间点发酵液至离心管,离心10 min(4 ℃,10 000 r/min),取200 μL上清液至4 mL 离心管中,加入50 μL浓HCl及2.5 mL无水乙醚涡旋后静置20 min,萃取完成后离心10 min(4 ℃,10 000 r/min),取上层有机相至离心管中,加入300 μL 1.0 mol/L NaOH涡旋后静置20 min,萃取结束后离心10 min(4 ℃,10 000 r/min),收集下层水相,加入50 μL浓HCl混匀,过0.22 μm滤膜后采用安捷伦1260液相色谱仪对短链脂肪酸组成及含量进行分析。色谱条件:紫外检测器,Agilent Hi-Plex色谱柱(4.6 mm×250 mm,8 μm),流动相为5 mmol/L硫酸溶液,柱温55 ℃,流速1.0 mL/min,进样量30 μL,在210 nm下检测。
1.3 数据处理与分析
所有实验均重复3次,结果表示为平均值±标准偏差,使用R3.6.0、Python3等数据处理软件对数据进行分析,采用多重比较法进行显著性分析(P<0.05表示差异显著),使用GraphPad Prism 8软件作图。
2 结果与分析
2.1 山楂多糖的提取与分离纯化
采用水提醇沉法对山楂中的多糖组分进行提取,山楂多糖得率为(5.61±1.23)%。GUO等[12]采用热水浸提法从山楂中提取富含葡萄糖的杂多糖得率为6.5%,而TRIPATHI等[10]LI等[16]从山楂中提取果胶类多糖的得率可达8.7%。山楂多糖经大孔树脂AB-8脱色后(记为CHFP)采用Q-sepharoseTM Fast Flow离子交换色谱进行纯化,洗脱曲线如图1-a所示。CHFP经20 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.0)洗脱后无明显洗脱峰,而经含200 mmol/L NaCl的Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.0)洗脱后出现洗脱峰(记为HFP),说明CHFP主要为酸性多糖,而不含中性多糖。对HFP进行收集浓缩后进一步通过SephadexTM G-500凝胶柱层析进行纯化,如图1-b洗脱曲线所示,经洗脱后共出现2个洗脱峰,分别记为HFP-1(22～45管)和HFP-2(50～90管),两组分分别占HFP的(15.24±1.25)%和(83.24±1.75)%。因HFP-1组分含量较低,后续收集HFP中主要组分HFP-2进行结构组成及益生活性研究。
2.2 山楂多糖组成及结构特征分析
以葡聚糖为标准品,采用HPLC法对CHFP及HFP-2的分子质量进行分析。如图2所示,CHFP与HFP-2的色谱保留时间分别为5.566、5.450 min,根据葡聚糖标准曲线(y=-1.338 9x+15.712,R2=0.996 4)计算可得,CHFP分子质量为1.82×105 kDa,而经SephadexTM G-500凝胶柱层析进行纯化后获得的HFP-2分子质量为2.60×105 kDa,LINARES-GARC
A等[17]通过水提醇沉法得到山楂多糖HMPH的分子质量为502.3 kDa,显著小于CHFP与HFP-2分子质量。
a-Q-sepharoseTM Fast Flow阴离子交换色谱; b-SephadexTMG-500凝胶柱层析
图1 纯化山楂多糖洗脱曲线
Fig.1 Purified hawthorn polysaccharide elution curve
图2 高效液相色谱法分析CHFP与HFP-2的分子质量
Fig.2 Molecular weight analysis of CHFP and HFP-2 by HPLC
2.3 山楂多糖化学组成
如表1所示,未经阴离子层析纯化的组分CHFP总糖含量为(91.58±0.52)%,主要由半乳糖醛酸(44.60 mol%)、阿拉伯糖(26.15 mol%)、葡萄糖(13.02 mol%)和半乳糖(11.53 mol%)组成,此外还含有少量的鼠李糖(5.21 mol%)。HFP-2总糖含量为(93.84±0.58)%,其单糖组成与CHFP相同,HFP-2中的阿拉伯糖(28.11 mol%)、葡萄糖(15.02 mol%)和半乳糖(13.06 mol%)高于CHFP。CHFP与HFP-2中半乳糖醛酸为主要单糖组成,这一结果与商飞飞等[4]通过水提法并利用DEAE-52纤维素柱纯化得到的酸性山楂多糖单糖组成结果一致。BCA法分析结果显示,HFP与HFP-2中均含有少量的蛋白质,含量分别为(6.26±0.08)%和(5.41±0.05)%。
表1 CHFP与HFP-2的化学组成
Table 1 The chemical composition of HFP and HFP-2
相对含量CHFPHFP-2鼠李糖/mol%5.217.49半乳糖醛酸/mol%44.6036.91葡萄糖/mol%13.0215.02半乳糖/mol%11.5313.06阿拉伯糖/mol%26.1528.11总糖/%91.58±0.5293.84±0.58蛋白质/%6.26±0.085.41±0.05
2.4 傅里叶变换红外光谱分析
采用傅里叶变换红外光谱分别对HFP与HFP-2结构中的官能团类型进行分析。如图3所示,CHFP与HFP-2的具有相似的傅里叶变换红外吸收特征,其中3 308 cm-1处强吸收峰是由由于O—H振动引起,表明2种组分均存在分子间/内氢键[18]。2 904 cm-1处的低强度峰为—CH、—CH2和—CH3中C—H的拉伸和弯曲振动[19]。CHFP与HFP-2含有吡喃糖环结构,吡喃糖环的C—H弯曲振动在1 334 cm-1处有吸收,而1 608 cm-1和1 422 cm-1处的峰分别为CHFP与HFP-2结构中糖醛酸的羧基的不对称和对称拉伸[20]。HFP与HFP-2在1 744 cm-1和1 238 cm-1处存在吸收峰,表明结构中存在酯化羧基(—COOR)及—O—CH3基团[19]。HFP与HFP-2组成中的高半乳糖醛酸含量引起1 020～1 082 cm-1区域的强吸收峰[21]。此外,1 200～1 900 cm-1处的吸收峰为果胶的特征指纹区域[22-23],结合山楂多糖的化学组成分析可以推断,山楂多糖CHFP和HFP-2组分为类似半乳糖醛酸为主链的果胶结构。
图3 CHFP与HFP-2傅里叶变换红外光谱图
Fig.3 FTIR of CHFP and HFP-2
2.5 山楂多糖体外粪便菌群发酵
2.5.1 发酵液pH及短链脂肪酸变化
肠道微生物可发酵利用膳食纤维并代谢生成短链脂肪酸,如乙酸、丙酸和丁酸等[24]。短链脂肪酸可降低结肠内pH值,从而具有抑制肠道有害菌如节杆菌和梭菌类的生长、提高钙离子和镁离子的生物利用率等多种生理功能[25-26]。此外,短链脂肪酸对肠道上皮细胞的代谢具有重要意义,丁酸作为肠道上皮细胞代谢的重要能量来源,能够影响其生长、分化与凋亡。有研究表明,丁酸可预防结肠癌的发生[27-28]。如表2所示,体外粪便菌群发酵HFP-2后,发酵液pH随发酵时间的延长逐渐降低,发酵48 h后,发酵液pH降低至4.45与阳性对照菊粉相当,显著低于空白组(pH=6.33)。发酵液中短链脂肪酸的累积是导致pH降低的重要原因,如表2所示,随着发酵时间的延长,HFP-2组发酵液中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸含量逐渐提高,发酵24 h后乙酸、丙酸、异丁酸含量分别为2.319 3×10-1、1.735 8×10-1、5.058×10-2 mg/mL,
表2 HFP-2体外粪便菌群发酵过程中发酵液pH及短链脂肪酸变化
Table 2 Changes of pH and short chain fatty acids (SCFAs) concentration in culture medium throughout in vitro fermentation of HFP-2 with human fecal microbiota
组别发酵时间/hpH短链脂肪酸×103/(mg·mL-1)乙酸丙酸异丁酸丁酸07.68±0.04a18.78±2.95abNDNDND66.98±0.05b12.51±1.34b3.64±0.49a4.51±0.19aND空白126.74±0.01c27.11±1.04a19.92±0.60b35.90±1.03bND246.61±0.04d19.67±5.63ab7.74±0.92c40.53±0.52cND486.33±0.03e12.47±1.20b6.14±1.55ac31.93±0.96dND06.34±0.04a14.76±2.1aNDNDND64.97±0.02b66.64±3.32b70.51±6.63a23.76±4.51aNDHFP-2124.88±0.02b198.98±11.18b144.73±9.86b44.12±8.04ab18.10±4.31a244.81±0.11b231.93±9.23b173.58±8.66c50.58±3.06c14.93±5.94a484.45±0.03c199.08±40.54b125.54±9.71ab30.22±5.58bc18.86±4.98a07.79±0.09a13.75±2.05aNDNDND64.41±0.02b59.88±1.92a40.60±3.03a9.84±1.09aND菊粉124.29±0.01b216.81±15.36b148.84±10.11b23.25±0.72bc13.35±2.10a244.14±0.03c206.72±3.30b145.55±7.35c13.64±0.77b23.69±0.60b484.07±0.03c258.97±6.10b184.25±7.35b18.38±1.49cdND
注:所有结果按照平均值±标准差表示,显著性差异分析使用法;ND表示未检出;上标字母表示组内是否存在差异,即相同标记字母的为差异不显著,不同标记字母的为差异显著(P<0.05)
显著高于菊粉组发酵液中相应短链脂肪酸含量(2.067 2×10-1、1.455 5×10-1和1.364×10-2 mg/mL),而HFP-2组发酵液中丁酸含量(1.493×10-2 mg/mL)低于菊粉组。
2.5.2 微生物群落结构及组成变化
β多样性反映了不同样本之间微生物丰富度的差异,选择weighted UniFrac距离结合主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)来衡量β多样性[29],如图4-a所示,添加HFP-2发酵后发酵液菌群组成与菊粉组相比发生显著性变化(P<0.05)。α多样性反映了微生物群落的丰富度和多样性,Simpson指数与微生物多样性呈正相关[30]。如图4-b所示,添加HFP-2与菊粉在发酵12、24、48 h后,Simpson指数均低于空白组(P<0.05),这可能与优势菌群的竞争作用有关[31],但添加HFP-2发酵后Simpson指数逐渐增加。以上结果说明,HFP-2在发酵过程中不仅能够改变肠道微生物组成结构,还能够提高肠道微生物丰度。如图4-c所示,0 h时发酵液微生物主要为Firmicutes(91.94%)、Bacteroidetes(4.06%)、Actinobacteria(2.86%)、Proteobacteria(1.01%)门,添加HFP-2发酵12 h后Bacteroidetes(18.14%)、Proteobacteria(17.92%)门相对丰度显著提高(P<0.05),随着发酵时间的延长,Proteobacteria门相对丰度逐渐降低,但Bacteroidetes门相对丰度逐渐上升且始终高于菊粉组。如图4-d所示从属水平上,发酵之初Megamonas(31.24%)、Roseburia(14.62%)与Faecalibacterium(7.06%)为优势菌属,加入HFP-2发酵后上述3种菌属相对丰度均显著降低,Phascolarctobacterium、Bacteroides与Shigella成为优势菌属。相较于菊粉,HFP-2能够显著增加肠道Bacteroides(12 h:10.44%;24 h:14.51%;48 h:19.22%)与Phascolarctobacterium属(12 h:26.17%;24 h:22.85%;48 h:8.65%)相对丰度(P<0.05)。Phascolarctobacterium属广泛分布在我国30～60岁人群肠道中[32],能够分解琥珀酸盐产生丙酸[33],HOU等[34]通过碱提法从柑桔皮提取得到AK与HPAK 2种果胶,与本研究结果相同,AK与HPAK通过体外发酵能够显著提高Phascolarctobacterium属相对丰度且增加丙酸和丁酸的含量。Bacteroide属中许多菌种能够通过编码多种碳水化合物水解酶(如多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶)代谢复杂碳水化合物主要产生乙酸和丙酸[35],研究发现富含RG-Ⅰ型结构的果胶能够显著提高小鼠肠道中Bacteroides属微生物含量[36],这可能是HFP-2组在体外发酵24 h后发酵液中乙酸和丙酸含量显著高于菊粉组的原因。与空白对照组相比HFP-2能够显著增加Prevotella属(12 h:0.84%;24 h:2.00%;48 h:2.11%)相对丰度,Prevotella是健康人群肠道中的一种主要微生物,它能抵抗胆汁酸,编码多种酶水解复合碳水化合物,产生乙酸,调节餐后血糖,缓解肠道炎症[37]。
a-β多样性;b-α多样性;c-门水平;d-属水平
图4 HFP-2体外发酵过程中粪便菌群组成及结构变化
Fig.4 Changes in the composition and structure in culture medium throughout in vitro fermentation of HFP-2 with human fecal microbiota
3 结论
本研究从新鲜山楂中提取多糖,通过大孔吸附树脂脱色处理、Q-sepharoseTM Fast Flow阴离子交换层析以及SephadexTM G-500凝胶层析对山楂多糖进行纯化,得到均一多糖组分HFP-2。HFP-2分子质量为5.36×103 kDa,经单糖组成及傅里叶红外光谱分析发现,HFP-2可能是以半乳糖醛酸为主链的果胶。体外粪便菌群发酵实验表明,HFP-2具有益生活性,可以显著改变粪便菌群结构,提高菌群多样性及有益菌相对丰度,促进粪便菌群代谢产乙酸、丙酸、异丁酸及丁酸等短链脂肪酸。因此,山楂多糖可作为膳食纤维类益生元应用于功能食品。
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