茶叶作为我国天然的特有饮品,营养价值丰富,深受各国消费者喜爱,广泛应用于食品、药品、保健品、个人护理品等领域[1]。香气是决定茶叶品质的重要因素,也是一种重要的活性成分,不仅具有较强的抗菌活性及广谱抑菌作用[2-3],还有体外抗氧化、抗突变等作用[4-5]。此外,将茶叶香气物质用于卷烟加香,能起到提质增香的效果[6-7]。水蒸气蒸馏法是茶叶香气较传统的提取方法,设备简单、操作简便,但过高的提取温度可能会造成香气物质的破坏,提取时间过长也可能导致香气中掺杂有不愉悦的蒸煮味[8-9]。随着工业技术的发展,超声波技术和酶工程技术也开始被借鉴并应用于茶叶香气的辅助提取。超声波具有空穴效应、机械效应及热作用,能够破坏植物的细胞壁,迅速释放植物中的有效成分,大大缩短提取时间。夏涛等[10]在功率250 W、温度60 ℃、时间40 min条件下浸提茶汤,结果表明超声波浸提茶汤中香气精油总量和香气组分均高于常规浸提茶汤,香气指数达到常规浸提法的1.8倍,且提高了茶叶中键合态糖苷类香气前体的浸出量。酶能使植物材料降解形成疏散结构,且有研究表明茶叶中的香气前体主要是糖苷类物种,包括单糖苷和二糖苷,因此茶叶提取过程中加酶可以增加茶汤香气和风味[11]。提取方法不同,茶中香气成分检出的种类与数量也会有所不同。而针对超声波和生物酶辅助提取茶叶香气的成分差异比较研究还未见报道,因此本文以茶叶为原料,分别采用超声波和酶解辅助提取,通过感官评价比较不同茶叶提取液的香气品质,采用GC-MS、气味活度值(odor activity value,OAV)和主成分分析法对提取的茶香化学成分和特征进行对比分析,为深入研究茶叶香气物质的提取和利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
茶叶由四川泸州市茶叶公司提供;β-葡萄糖苷酶,河南百盛生物科技有限公司;纤维素酶,南宁庞博生物有限公司;果胶酶,河南万邦实业有限公司。
YB-2500A粉碎机,永康市速锋工贸有限公司;AL204电子天平,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;SB25-12DTDN超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;GCMS-QP2020气质联用色谱仪,日本岛津公司;SAAB-57330 USPME手动进样装置,上海安谱实验科技股份有限公司;1 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头,美国Supelco公司。
1.2 实验方法
1.2.1 茶叶香气物质的提取
超声波提取：茶叶粉碎过60目筛备用,称取10.0 g茶叶粉末,置于250 mL锥形瓶中,以蒸馏水为溶剂,使其料液比为1∶8,于超声温度60 ℃、超声功率360 W下超声2 h进行辅助浸提。
酶辅助提取：茶叶粉碎过60目筛,分别称取10.0 g茶叶粉末,置于250 mL锥形瓶中,以蒸馏水为溶剂,使其料液比为1∶8,分别用不同酶进行酶解辅助浸提,酶添加量为1%(质量分数),酶解时间3 h。纤维素酶：酶解温度55 ℃,酶解pH值4.5;β-葡萄糖苷酶：酶解温度70 ℃,酶解pH值5.5;果胶酶：酶解温度60 ℃,酶解pH值4.5。
1.2.2 提取液样品GC-MS预处理
对不同方法提取得到的茶叶提取液样品进行预处理,吸取5 mL样品于15 mL顶空瓶中,加入100 μL癸酸乙酯内标物(质量浓度150 μg/L)和1 g NaCl,混合充分后,置于80 ℃恒温加热磁力搅拌器中平衡45 min,再将萃取头插入顶空瓶吸附40 min,吸附完成后,快速取出萃取头并立即插入GC进样口,热解析3 min进样进行GC-MS分析。
1.2.3 GC-MS条件
GC条件：HP-INNOWAX石英毛细管柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);进样口温度250 ℃;载气He,纯度≥99.999%;流速为1.00 mL/min;不分流进样。升温程序：初始柱温50 ℃,保持5 min;以3 ℃/min的速度升至210 ℃,保持10 min;再以3 ℃/min的速度升至230 ℃,保持10 min。
MS条件：离子源EI,离子源温度230 ℃,接口温度250 ℃;扫描方式：Scan,扫描范围：10～400 amu;溶剂延迟时间2 min;进样量2 μL。谱库检索：NIST14 s.lib谱库。
1.2.4 香气成分的OAV分析
采用OAV分析各香气成分对提取液总体风味的贡献[12]。各香气成分的OAV按公式(1)计算：
(1)
式中：Ci,茶叶提取液组分i的含量,μg/L;Ti,组分i在水中的香气阈值,μg/L。
1.2.5 提取液香气感官评价
由具有省级评茶资格的审评人员匿名审评提取液香气。参考文献[13-14]评价方式,从浓郁度、协调度、层次感、持久性4个方面进行评价,评分从0～6(0：很差;1：差;2：较差;3：一般;4：好;5：很好;6：非常好)。
1.2.6 数据处理分析
采用QP2010Ultra GC-MS 自带数据库(NIST 2014)及Wiley8.0检索数据库检索,以质谱匹配度≥90%作为鉴定依据,通过计算保留指数(retention index,RI)与文献报道对比进行定性分析;不同提取方法得到的香气成分采用内标法定量分析。采用Excel进行香气成分测定结果数据处理和OAV值计算,采用Graph Pad Prism 8和Origin Pro 2022绘图。
2 结果与分析
2.1 不同方法茶叶提取液的香气物质种类和含量
应用超声波和酶辅助提取茶叶香气物质,并用GC-MS对提取液的香气成分进行分析鉴定。如图1所示,4种提取方法所得茶液共鉴定出87种香气物质,超声波、纤维素酶辅助提取液均检测出70种香气成分,β-葡萄糖苷酶和果胶酶辅助提取分别检测出73和74种香气成分,但含量有所差异。
图1 不同方法茶叶提取液香气组分及含量热图
Fig.1 Heat map of aroma components and content of tea extracts by different methods
将鉴定出的香气物质进行分类分析,由图2-a可知,超声波和酶辅助提取的香气物质种类基本相同,均以醇类数目最多,其次是酯类、酸类和醛类,但数量有所差异;不同酶处理的香气物质种类也不相同,组成有所差异。通过绘制韦恩图(图2-b)可见4种提取液之间的香气物质种类存在一定区别。4种提取液共有香气物质58种。超声波提取液、β-葡萄糖苷酶提取液、纤维素酶提取液、果胶酶提取液分别有1种、4种、1种、5种香气物质。
a-香气物质数量;b-韦恩图
图2 不同方法提取液的香气物质数量和韦恩图
Fig.2 Quantity and Venn plot of aroma substances and various compounds extracted by different methods
超声波提取液和β-葡萄糖苷酶提取液共有2种香气物质;超声波提取液和纤维素酶提取液共有2种香气物质;超声波提取液和果胶酶提取液共有4种香气物质;β-葡萄糖苷酶提取液和纤维素酶提取液共有1种香气物质;纤维素酶提取液和果胶酶提取液共有1种香气物质。超声波提取液、β-葡萄糖苷酶提取液、纤维素酶提取液共有月桂醇、苯甲酸叶醇酯2种香气物质;超声波提取液、β-葡萄糖苷酶提取液、果胶酶提取液共有顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇1种香气物质;β-葡萄糖苷酶提取液、纤维素酶提取液、果胶酶提取液共有5种香气物质。
进一步对4种方法得到的茶叶提取液香气物质的相对含量进行分析,由图3可知,不同提取液中香气物质各类化合物的含量也存在一定差异。醇类化合物在4种方法中含量占比均最高,占主导地位,与曹晓念等[15]的研究一致,其次,酸类、酯类、酚类化合物在几种提取方法的香气物质中的总含量也较高。
图3 不同方法提取液香气物质中各类化合物的含量
Fig.3 Content of various compounds of tea aroma substances extracted by different methods
2.2 不同方法茶叶提取液的各类香气物质分析
2.2.1 醇类成分分析
由图2和图3可知,醇类物质是4种提取液中最丰富的香气物质,共检测到24种醇类物质,超声波提取液、β-葡萄糖苷酶提取液、纤维素酶提取液、果胶酶提取液分别检出21、20、19、22种。其中果胶酶提取液的醇类物质含量最高,达到542.65 μg/L,β-葡萄糖苷酶提取液的醇类含量为412.52 μg/L,纤维素酶提取液的醇类含量最低,为334.71 μg/L。醇类物质主要包括反式-芳樟醇氧化物(呋喃型)、芳樟醇、香叶醇、苯甲醇、苯乙醇等,在4种提取液中的含量均存在一定差异。研究表明芳樟醇及其氧化物、香叶醇、苯甲醇、苯乙醇、水杨酸甲酯等物质是红茶的特征性香气物质[16],在4种方法的提取液中均检出,且含量均较丰富。其中香叶醇的含量在4种提取液中均为最高,占总醇含量的45%左右。不同提取方法的香叶醇含量总体趋势为果胶酶>β-葡萄糖苷酶>纤维素酶>超声波。
2.2.2 酸类成分分析
酸类物质主要以香叶酸为主,总含量为127.00～253.91 μg/L。其他为辛酸、庚酸、壬酸等,多为长链酸,且含量较低,对风味贡献较小。4种提取液中果胶酶提取液的酸类物质数量和含量均最大,且仅果胶酶提取液检测出棕榈酸。
2.2.3 酯类成分分析
酯类物质在4种提取液中均较丰富,含量相对较高,为64.96～2 115.62 μg/L。超声波提取液酯类物质数量最多,但果胶酶提取液的含量最高。酯类物质主要包括水杨酸甲酯、亚油酸乙酯、棕榈酸乙酯、棕榈酸甲酯等,但除水杨酸甲酯外,酯类主要为长链酯,阈值高且含量低,对提取液风味贡献较小[16]。
2.2.4 醛类成分分析
由图2和图3可知,4种提取液中的醛类物质较少,含量较低,为19.66～38.06 μg/L,但醛类物质因其较低的阈值而对风味具有较大的贡献[17]。主要包括壬醛、苯甲醛、苯乙醛、香橙醛、可卡醛等。此外,反,反-2,4-癸二烯醛仅在纤维素酶提取液检测出,该物质的香气阈值较低,对提取液香气具有一定贡献作用。
2.2.5 酮类成分分析
酮类物质在4种提取液中种类较少,主要包括大马士酮、苯乙酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、植酮等。这些酮类物质含量较低,但多数酮类物质的香气阈值较低,对提取液风味也有一定贡献作用。其中香叶基丙酮在超声波提取液中未检出,2-戊基癸酮仅在纤维素酶提取液和果胶酶提取液中检出。
2.2.6 其他成分分析
烃类物质主要为月桂烯、右旋柠檬烯、β-罗勒烯、罗勒烯异构体混合物等,含量较低。杂环类物质主要为茶吡咯、2,3-二氢苯并呋喃,含量低。酚类仅检测出2,4-二叔丁基苯酚,含量各不相同。其他类为甲氧基苯肟,含量为20.48～48.63 μg/L。
2.3 不同方法茶叶提取液的香气成分OAV分析
在茶叶众多的香气成分中,仅有一部分起主导作用,它们之间相互作用构成了茶的香气特征[18]。此外,不同化合物的香气阈值不同,因此香气成分含量不能说明茶叶的特征香气。王奕等[19]采用OAV评价香气化合物对茶叶主体香气成分的贡献,认为OAV>1的香味化合物对茶叶香气有贡献作用,OAV>10的香气化合物则可能对茶叶香气有显著影响。因此,为进一步确定不同方法提取液的关键香气成分,通过查阅书籍及相关文献中已报道的挥发性风味物质的香味阈值,计算各成分的OAV,利用OAV评价单个香气成分对茶叶提取液整体香气的贡献度。
由表1可知,所有茶叶提取液中OAV>1的香气成分有9种,其中β-紫罗兰酮、芳樟醇、香叶醇是4种提取液共有的主要关键香气成分(OAV>10),可赋予紫罗兰香、铃兰香和玫瑰花香等花香,β-紫罗兰酮的OAV为574.28～915.71,是OAV最高的香气物质,对提取液香气贡献最大。反,反-2,4-癸二烯醛具有脂香味、炸土豆味,是纤维素酶提取液独有的关键香气成分,使得纤维素酶提取液的香气特征与其他3种以花香为主的提取液香气特征具有一定差异。己酸乙酯、雪松醇、苯乙醛是4种提取液共有的对香气贡献较大的香气成分,可赋予果香、酒香、沉香、木香等香气,果胶酶提取液中OAV>1的香气物质还有水杨酸甲酯和月桂烯,赋予果胶酶提取液更丰富的香气类型。
表1 不同方法提取液的香气物质OAV及气味描述
Table 1 OAV and aroma description of the aromatic substances extracted by different methods
序号化合物名称阈值[17,20-22]/(μg/L)OAV超声波β-葡萄糖苷酶纤维素酶果胶酶气味描述[19,23-24]1β-紫罗兰酮0.007574.28805.71662.86915.71紫罗兰香2芳樟醇1.521.9327.4524.7739.73铃兰香3香叶醇7.519.8324.9920.3231.65甜香、玫瑰花香4反,反-2,4-癸二烯醛0.07——21.43—脂香味、炸土豆味5己酸乙酯0.53.441.222.184.72果香、酒香6雪松醇0.52.643.823.163.22木香、沉香7苯乙醛42.382.231.332.56青香、玫瑰、花香、巧克力8水杨酸甲酯400.750.990.801.45冬青油香9月桂烯130.640.760.671.10木香、脂香
注：“—”未检出该物质而未做计算;仅列出OAV>1的香气化合物。
2.4 不同方法茶叶提取液的香气成分主成分分析
对表1中对提取液整体风味轮廓有重要影响的香气物质(OAV>1)进行主成分分析,结果如图4所示。PC1中载荷正向最高的物质为香叶醇,载荷负向最高的物质为反,反-2,4-癸二烯醛;PC2中载荷正向最高的物质为雪松醇,载荷负向最高的物质为己酸乙酯。说明香叶醇、反,反-2,4-癸二烯醛、雪松醇和己酸乙酯是不同方法提取液中含量变化最明显的挥发性物质,可以根据这些物质区分不同方法提取液。主成分分析是可直观地反映样本成分构成的近似度的统计方法,样本间的相似度越高则距离越近[18]。4种处理方法的提取液在得分图上距离较远,说明香气差异较大。其中,表征β-葡萄糖苷酶提取液的关键性香气物质是β-紫罗兰酮、芳樟醇和香叶醇,具有贡献作用的是雪松醇、月桂烯和水杨酸甲酯;表征纤维素酶提取液的关键性香气物质是反,反-2,4-癸二烯醛;表征果胶酶提取液具有贡献作用的是苯乙醛和己酸乙酯。
图4 不同方法提取液香气物质的主成分双图
Fig.4 Principal component analysis biplot of aromatic substances extracted by different methods
2.5 不同方法提取的茶液香气感官评价比较
对4种提取液进行香气感官评价,由表2可知,4种提取液的香气特征不完全相同,但均带有花果香,与OAV分析结果相似。从不同评价因子来看,果胶酶提取液的浓郁度得分显著低于其他3种提取液(P<0.05),但它的协调度最佳;层次感以β-葡萄糖苷酶提取液和纤维素酶提取液的香气最好;而4种提取液的香气持久性没有显著性差异。综合评分显示,β-葡萄糖苷酶提取液得分显著高于其他提取液得分(P<0.05),品质最优,其次是纤维素酶提取液和超声波提取液,果胶酶提取液的得分最低。茶叶香气类型丰富,香气物质的种类、种数、含量的微小变化都会对茶叶的香气产生重要影响[25]。本研究的GC-MS和OAV分析也证实4种提取液的香气成分组成和含量存在一定差异,关键性香气物质和具有贡献作用的香气物质也不完全相同。
表2 不同方法提取液的香气感官评价
Table 2 Sensory evaluation of tea liquor extracted by different methods
提取方法浓郁度(0～6分)协调度(0～6分)层次感(0～6分)持久(0～6分)总分(0～24分)香气特征描述超声波4.6±0.5a4.6±0.5b5.0±0ab5.4±0.5a19.6±0.7bc花香、木质香、焦糖香、烘焙香β-葡萄糖苷酶5.2±0.4a5.0±0ab5.4±0.5a5.4±0.5a21.0±0.3a花香、果香、发酵香、焦甜香、烘焙香纤维素酶5.2±0.7a4.8±0.4ab5.4±0.5a5.0±0.6a20.4±0.4b花香、木质香、果香、甜香、脂香果胶酶3.8±0.4b5.2±0.4a4.6±0.5b5.0±0a18.6±1.5c花香、果香、发酵香
注：同一肩列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
3 结论
对超声波和酶解辅助提取茶叶香气进行GC-MS分析表明,4种方法提取的香气物质种类基本相同,主要包括醇类、酸类、酯类、醛类、酮类等9类87个化合物,但香气物质的组成及相对含量存在较大的差异。OAV分析表明不同方法提取液中具有贡献作用的香气成分(OAV>1)有己酸乙酯、雪松醇、苯乙醛、水杨酸甲酯、月桂烯等,其中主要的关键香气成分(OAV>10)为β-紫罗兰酮、香叶醇、芳樟醇、反,反-2,4-癸二烯醛。主成分分析表明,因各提取液香气表征物质不同,不同方法的茶叶提取液香气差异较大。香气感官评价发现4种提取液的持久性没有显著差异,但β-葡萄糖苷酶提取液和纤维素酶提取液的层次感最丰富,果胶酶提取液的协调度最佳,但浓郁度最差,综合得分表明β-葡萄糖苷酶提取液的整体香气最佳。本研究结果可为茶叶香气物质的提取和利用提供理论依据。
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