近年来在畜牧业绿色发展的政策背景下,微生物和酶制剂等生物发酵类饲料添加剂产品发展迅速,越来越多的微生物被开发并用于饲料和饲料添加剂的生产[1-3]。生物发酵类饲料添加剂主要涉及2类,即直接饲喂微生物和发酵制品(如酶制剂、氨基酸等)。饲用微生物安全性与饲料产品安全和动物源食品安全密切相关。微生物鉴定是根据现有的分类系统,测定微生物的关键特征,通过与已知参考菌株或数据库比对,确定分类学地位的过程[4-5]。对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株的科学鉴定是菌株应用的前提,也是安全性评价的重要基础。
我国对微生物饲料添加剂及发酵制品生产菌种实行目录准入管理,用于直接饲喂和发酵制品生产的微生物应为《饲料添加剂品种目录》中所列菌种。在生产中使用目录以外菌种的,应开展安全性和有效性评价并通过评审后方可使用。农业农村部2021年发布《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》,对微生物鉴定提出明确要求。但目前行业还缺少配套的微生物鉴定方法标准,饲用微生物菌种名称不准确、不规范等现象仍然存在。本文介绍了欧盟和我国直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定要求,并对形态学、生理生化、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/MS)、核糖体DNA、持家基因和基于全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)分析等微生物鉴定技术及应用进行概述,以期为直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株的鉴定和方法标准化提供参考。
1 欧盟及我国直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定要求
欧盟发布(EC) No 1831/2003《饲料添加剂管理条例》[6-7]及其实施细则(EC) No 429/2008[8]规定：应提供用于菌种鉴定的表型、生理生化和分子生物学等菌种特征描述文件。2005年欧盟食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)建立了欧盟微生物安全资格推定(qualified presumption of safety,QPS)体系[9],为饲料和食品用菌种的安全性提供预评估,其评估的首要步骤是,根据当前鉴定技术和分类学进展将微生物鉴定至种水平,同时每6个月复核列表中的微生物,确保使用科学的微生物分类名称等信息[10-12]。随着WGS技术的发展,2018年EFSA发布了《用作饲料添加剂或其生产菌株的微生物特性评价指南》(EFSA 5206—2018)[13],明确要求应根据最新技术方法和当前知识将拟评价微生物鉴定至种水平。其中,细菌需通过基于WGS的ANI分析、16S rDNA或持家基因序列分析等技术进行鉴定。酵母也需通过WGS进行基因组系统发育学分析鉴定。丝状真菌在有条件获得WGS基因组信息时,可通过基因组系统发育学分析进行鉴定;当WGS基因组信息无法获得时,则应通过18S rDNA、内部转录间隔区(internal transcribed spacer regions,ITS)及其他特征基因进行鉴定。
我国依据《饲料和饲料添加剂管理条例》制定的《新饲料和新饲料添加剂管理办法》中明确要求需提供微生物饲料添加剂及发酵制品生产菌株的分类(菌种)鉴定报告。2019年农业部修订并发布《新饲料添加剂申报材料要求》(农业农村部第226号公告),明确要求微生物饲料添加剂及发酵制品生产菌株应通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法,提供鉴定至少到种或亚种水平的鉴定报告。2021年农业农村部发布的《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》进一步为饲用微生物的鉴定提供了系统的方法指导。
2 微生物鉴定技术及其应用
微生物鉴定是通过综合表型和基因型的鉴定技术,结合当前科学认知,确定微生物分类单元如属名、种名(包括中文和拉丁学名等)的过程;微生物分类是根据物种间亲缘关系将其归纳到某个分类单元的过程;微生物命名是根据微生物国际命名法规赋予已确定的分类单元明确的分类学名称的过程。《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》中明确要求细菌的命名应遵循原核生物系统学国际委员会(International Committee on Systematics of Prokaryotes,ICSP)的规定,并符合原核生物国际命名法规(International Code of Nomenclature of Prokaryotes,ICNP)要求。酵母和丝状真菌的命名应符合国际藻类、真菌和植物命名法规(International Code of Nomenclature for algae,fungi,and plants,ICN)要求。目前细菌分类单元的描述、更新及命名发布在原核生物名称名录(List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature,LPSN)[14]和国际微生物学系统与进化杂志(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,IJSEM)。真菌菌种名称主要参考当前国际认可的Mycobank(http：//www.mycobank.org/)、Index Fungorum(http：//www.indexfungorum.org/Names/Names.asp)等分类学数据库。传统的微生物分类和鉴定主要是以形态学和生理生化等鉴定技术为主,《伯杰氏系统细菌学手册》[3]、《酵母菌分类学》[15]和《安·贝氏菌物词典》[16]是微生物鉴定的经典参考。近年来,分子生物学的快速发展和应用为微生物分类鉴定提供了简便、高效和更为准确的鉴定技术方法,如核糖体DNA、持家基因、基于WGS的ANI分析技术等。
2.1 形态学鉴定
微生物菌种形态分为菌落形态和菌体形态,是微生物鉴定的重要依据。菌落形态,即宏观形态,是指观察菌株在适宜培养条件下形成的菌落特征并科学描述。微生物菌种在一定条件下培养形成的菌落形态特征,如大小、形状、在培养基上/中的颜色、表面、边缘、光泽度、透明度、质地、渗出液、可溶性色素等,具有一定的稳定性,是衡量菌种纯度和鉴定菌种的重要依据。菌体形态,即微观形态,是指借助显微镜观察菌株在适宜培养条件下的菌体细胞的形态、大小、排列方式、特殊结构如产孢结构、是否有芽胞,芽胞的形态、着生位置等及表面特征并科学描述。常见的微生物菌体形态观察方法包括细菌的革兰氏染色法、产芽胞菌的芽胞染色法、放线菌的插片法、真菌的水浸片法等。为观察微生物更精细的结构,扫描电镜和透射电镜等技术越来越多地被用于菌体形态的观察。菌体形态是菌种鉴定的重要参考指标,是细菌和酵母菌描述的基本特征,如双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)菌体形态一般不规则、有分叉;谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌体形态为棒状并呈V字排列;德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)菌体形态为直或弯曲的长杆状;枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)菌体呈杆状,有芽胞;GB 7300.501—2021饲料添加剂 第5部分：微生物酿酒酵母中关于菌种鉴别要求应符合酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的形态,包括细胞呈卵圆形或圆形、芽殖等。对于丝状真菌,形态学仍然是分类鉴定的重要特征,如曲霉菌属(Aspergillus sp.)的分生孢子头[17]、青霉菌属(Penicillium sp.)的帚状枝结构[18]、根霉菌属(Rhizopus sp.)的孢子囊结构[19]、镰刀菌属(Fusarium sp.)的镰刀状大分生孢子[19]等。
2.2 生理生化鉴定
生理生化特征与微生物细胞的代谢调控直接相关,既有微生物体内蛋白质和酶的直接参与,也有代谢产物作用的结果,是微生物分类学的重要基础信息。生理生化鉴定通过检测微生物对碳氮源利用、产酸产气、代谢酶学反应等一系列特征实现,目前仍然是国内外标准中微生物鉴定的主要方法。例如乳杆菌属(Lactobacillus sp.)为兼性厌氧菌,氧化酶、过氧化氢酶和硝酸盐还原反应一般为阴性,最适生长温度为30～40 ℃,最适生长pH为5.5～6.2,能够利用碳源产生乳酸,可根据菌株利用碳源和其产酸等特性对其进行鉴定[3]。双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)为严格厌氧菌,过氧化氢酶反应一般为阴性,最适生长温度为37～40 ℃,最适生长pH为6.5～7.0,能够利用碳源,产生乳酸和乙酸,可根据产酸特性以及脲酶等生化反应对其进行鉴定[3]。酿酒酵母(S.cerevisiae)典型特征为同化并发酵葡萄糖、麦芽糖、棉子糖、蔗糖,不同化麦芽糖;产朊假丝酵母(Candida utilis)典型特征为同化木糖、纤维二糖、α-甲基-D-葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、松三糖,只发酵葡萄糖和蔗糖[15],可根据碳源利用等特征对其进行鉴定。
随着微生物快速鉴定技术的发展,API、VITEK等自动生化分析系统已被广泛应用。API鉴定系统基于细菌数值分类分析,根据细菌所属类群选择鉴定系列,通过软件转化分析生化代谢反应结果并与相应数据库比对得出鉴定结果[20]。API 50CHB、API 50CHL系列分别为芽胞杆菌、乳杆菌鉴定的常用技术,可鉴定枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)等;VITEK全自动微生物分析系统通过测定菌株碳源利用、氮源利用、产酶活性及耐药性等生理生化特征,实现菌株快速鉴定分析。根据不同菌种类型使用不同的测试鉴定卡片,在鉴定过程中软件将菌种的试验反应与预期反应进行比较,鉴定可信概率百分比的范围为85%～99%[21]。
2.3 MALDI-TOF/MS鉴定
MALDI-TOF/MS是基于微生物核糖体等高丰度稳定表达的特征蛋白指纹图谱的快速鉴定技术,其原理是将样品与小分子基质的混合溶液加在靶盘上,待溶剂挥发后形成共结晶,用激光照射晶体时,基质分子吸收能量与样品解吸附并使其电离,采用不同的飞行时间分析器检测带电荷的分析物,从而获得微生物核糖体蛋白指纹图谱,与已知微生物蛋白指纹图谱数据库比对分析,实现微生物的快速鉴定。该技术可进行乳杆菌属(Lactobacillus sp.)[22]、木霉菌属(Trichoderma sp.)[23]、曲霉菌属(Aspergillus sp.)[22,24]等的快速鉴定。目前,MALDI-TOF MS已成为国内外微生物菌种鉴定的标准方法,如美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)于2017年发布的《Methods for the Identification of Cultured Microorganisms Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry》(CLSI M58—2017)和国家标准委发布的《基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则》(GB/T 33682—2017)等。
2.4 核糖体DNA(ribosomal DNA,rDNA)鉴定
rDNA是与核糖体蛋白结合的DNA,同时含有保守区和可变区,广泛用于微生物的分类鉴定。核糖体DNA鉴定以rDNA序列为基础,与基因数据库中标准菌株核酸序列进行比对,根据其相似性及系统发育学分析进而结合判定标准进行微生物种属鉴定。常用核糖体DNA鉴定包括16S rDNA、26S rDNA、ITS rDNA等,可用于微生物细菌、酵母菌、丝状真菌等的鉴定。16S rDNA具有高度的稳定性,是细菌属和种水平鉴定的常用方法,序列相似性98.65%是细菌种水平判定的阈值[25]。利用16S rDNA可将嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)等细菌菌种直接鉴定至种水平。干酪乳酪杆菌群(Lacticaseibacillus casei[basonym：Lactobacillus casei] group)、枯草芽胞杆菌群(B.subtilis group)等同属中菌种的亲缘关系较近,通过16S rDNA仅能鉴定至属水平。编码D1/D2区的26S rDNA具有较高的变异性,可用于酵母菌亲缘关系较近的菌种之间的分类鉴定。ITS rDNA序列属于中度保守区域,表现为种内相对一致,种间差异比较明显,序列片段较小,易于分析,目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育分析。酵母菌和丝状真菌可通过编码D1/D2区的26S rDNA、ITS等进行鉴定,其参考阈值分别为99.6%和99.8%[26-27]。酿酒酵母(S.cerevisiae)和米根霉(R.oryzae)分别利用26S rDNA和ITS可直接鉴定至种水平。
2.5 持家基因鉴定
持家基因(house-keeping gene)又称看家基因或管家基因,是生物体内普遍存在的基因,已被广泛用于微生物分类单元的确定,尤其是通过rDNA难以鉴定至种水平时,部分菌种可通过持家基因鉴定至种水平。对于干酪乳酪杆菌群(L.casei group)[28]、植物乳植杆菌群(Lactiplantibacillus plantarum[basonym：Lactobacillus plantarum] group)[29]、布氏慢生乳杆菌群(Lentilactobacillus buchneri[basonym：Lactobacillus buchneri] group)[30]等中的菌种,属内种间亲缘关系较近,16S rDNA序列相似性高达99%～100%,编码苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基基因(pheS)和RNA聚合酶α亚基基因(rpoA)可将其鉴定至种水平[31]。如植物乳植杆菌(L.plantarum)、干酪乳酪杆菌(L.casei)、副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei[basonym：Lactobacillus paracasei])、布氏慢生乳杆菌(L.buchneri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)等菌种通过16S rDNA无法鉴定至种水平,可通过pheS持家基因序列鉴定。枯草芽胞杆菌群(B.subtilis group)[32]、短小芽胞杆菌群(Bacillus pumilus group)[33]等中的菌种可采用DNA旋转酶B亚基基因(gyrB)鉴定至种水平。如枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、短小芽胞杆菌(B.pumilus)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等菌种通过16S rDNA无法鉴定至种水平,可通过gyrB持家基因序列鉴定。同样,对于真菌已有研究表明,编码β1和β2微管蛋白基因(BenA)对曲霉菌属(Aspergillus sp.)和青霉菌属(Penicillium sp.)的菌种在种水平上具有较高的分辨率[34-36]。
2.6 平均核苷酸一致性鉴定
全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)是确定生物体基因组DNA序列的过程,能够全面分析基因组中的碱基组成,提供更精确的遗传信息。自1987年第一台商用自动测序仪诞生至今,测序技术迅速发展,微生物全基因组测序技术已成为分子生物学实验室越来越广泛使用的技术之一。随着高通量DNA测序技术的快速发展,WGS在微生物分类鉴定中发挥着越来越重要的作用。基于WGS的平均核苷酸一致性(ANI)指2个基因组之间同源基因的相似性,于2007年由GORIS等[37]提出,是原核生物物种鉴定的重要方法。可采用ANI Calculator(https：//www.ezbiocloud.net/tools/ani)等进行待测菌株全基因组序列和其近缘模式菌株的全基因组序列比对分析[38]。ANI值95%～96%与传统的DNA-DNA杂交值70%、16S rRNA基因序列相似性98.65%具有较好的对应关系,可作为细菌种水平的判定阈值[37,39]。ANI鉴定具有方便快捷、错误率低等优点,对于常规方法难鉴定至种水平的微生物,具有较好的分辨率,已广泛应用于芽胞杆菌属(Bacillus sp.)[40]、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)[41]、黏着剑菌(Ensifer adhaerens)[42]等直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株的分类鉴定。目前,饲料[13]、食品[43]等多个领域出台的法规和标准已将基于WGS的ANI鉴定纳入其中,作为微生物分类鉴定的重要工具。
3 讨论
对饲用微生物进行科学准确的鉴定是开展饲料添加剂安全性评价和保障产品质量安全的重要基础。综合利用表型和基因型方法可以实现饲用微生物的鉴定,常见的表型鉴定方法包括菌落菌体形态、生理生化特征分析等。基于分子生物学鉴定的基因型方法,如16S rDNA或持家基因鉴定方法,可通过系统发育从遗传进化角度分析微生物种群之间的分类学关系,是目前微生物鉴定普遍采用的方法。WGS通过提供微生物全面的遗传信息,在实现饲用微生物鉴定的同时,可为深入开展菌株安全性评价和功能挖掘提供有效科学支撑。与常见细菌相比,酵母菌和丝状真菌的基因组普遍较大,且基因数据库有待进一步完善,尚需结合形态学和生理生化进行鉴定,特别是对于丝状真菌,形态学仍然是必不可少的关键特征。不同鉴定方法原理和效果具有差异性,应根据饲用微生物不同种属和应用场景选择适合的方法,结合菌种表型和基因型特征进行综合判断。
随着微生物鉴定技术和系统分类学的不断发展,部分饲用微生物分类学地位会随之变迁,相应基因数据库也在动态更新。尚需持续跟踪菌种分类学前沿,利用最新鉴定技术方法,确认饲用微生物的科学分类学地位。2020年4月,ZHENG等[44]通过WGS分析将原乳杆菌属(Lactobacillus sp.)重新划分为25个属。2020年7月,QPS随之将原乳杆菌属(Lactobacillus sp.)菌种名称更新为当前科学名称[12]。对于微生物的鉴定,应由具有法定资质或实验室检测能力认可资质等相应条件和能力的检测评价机构开展,科学的分类学名称有助于对直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株的正确使用和有效监管。
饲用微生物鉴定是菌株安全性和功能性研究的首要条件,对我国直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株科学的鉴定,有助于饲料添加剂生产过程的有效控制,进一步推动饲料添加剂产业的健康发展。
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