生物表面活性剂是由细菌和真菌等微生物代谢产生的具有表面活性的生物分子[1],它们具有较低的临界胶束浓度,低临界胶束浓度可导致油水或空气-水界面表面张力的大幅度降低[2-3]。这些特性使生物表面活性剂成为泡沫稳定和乳化的良好选择。与化学表面活性剂相较,生物表面活性剂耐酸、耐盐,毒性低,可生物降解,有较好的生物相容性[4-8],在食品、化妆品、医药和农药等各行业都有良好的发展前景[9-12],在未来有逐步替代化学表面活性剂的趋势。
1 生物表面活性剂分类
生物表面活性剂是一种两亲性的化合物,同时含有疏水和亲水基团[13]。根据分子质量的不同,生物表面活性剂可分为低分子质量和高分子质量生物表面活性剂[6]。低分子质量的生物表面活性剂包括糖脂和脂肽等,如海藻糖脂、果糖脂、鼠李糖脂、表面活性素、黏菌素等[14]。高分子质量生物表面活性剂包括多糖、蛋白质、脂蛋白、脂多糖或这些生物聚合物的混合物[15]。前者能降低两相的表面张力,后者有助于提高乳液的稳定性能,也被称为生物乳化剂。根据生物表面活性剂的生化性质的不同,生物表面活性剂分为糖脂、磷脂和脂肪酸、脂肽和脂蛋白、聚合表面活性剂和微粒表面活性剂[16],其中研究较多较为常见的生物表面活性剂主要有糖脂、脂肽和脂蛋白以及聚合表面活性剂。产生这些生物表面活性剂的微生物主要有假单胞菌、不动杆菌、芽孢杆菌、红球菌、念珠菌等[2-3]。
1.1 糖脂类
糖脂类生物表面活性剂是最常见和最容易获得的生物表面活性剂,是碳水化合物与长链脂肪酸通过醚基或酯基连接的复合物。常见的糖脂类表面活性剂主要有铜绿假单胞菌等产生的鼠李糖脂、红串红球菌和石蜡杆菌等产生的海藻糖脂以及解脂假丝酵母和球拟酵母等产生的槐糖脂等。目前国内外研究较多的是由假单胞菌产生的鼠李糖脂,它是由1～2分子的鼠李糖和1～2分子具有不同碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸构成[17]。鼠李糖脂具有良好的表面活性和乳化活性,能够使水的表面张力从72.5 mN/m下降到28.1 mN/m,且对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等也具有一定的抑菌活性[18]。此外,鼠李糖脂也能够增加疏水性底物的表面积和生物利用度,调节微生物对表面的附着和脱离,影响生物被膜的形成,还可以与重金属结合[19-22]。
1.2 脂肽和脂蛋白
脂肽和脂蛋白是第二大类生物表面活性剂,它们主要来自芽孢杆菌和假单胞菌等细菌。脂肽通常是由1个脂肪酸(C12～C18)和肽链(4～12个氨基酸)连接形成的[23]。按照其结构特征,脂肽可以分为环状脂肽和线形脂肽。环状脂肽具有环状结构,是由氨基酸和肽或脂肪酸连接形成内酯键或酰胺键构成的[24]。线形脂肽无环状结构,可分为直链结构和支链结构[25]。环状脂肽主要有表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、地衣素和黏菌素等[23]。表面活性素是由枯草芽孢杆菌产生的一种脂肽型生物表面活性剂,它是由7个氨基酸和长链脂肪酸(C13～C15)上的羧基和羟基连接组成[26]。作为一种次级代谢物,表面活性素于1968年首次在枯草芽孢杆菌的培养液中被发现,包括4种异构体(表面活性素A、B、C和D),表现出多种生理活性,能作为纤维蛋白凝固的抑制剂和细胞裂解剂[27]。近年来,很多学者发现表面活性素还具有抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗支原体和溶血特性[28]。
1.3 聚合类生物表面活性剂
聚合生物表面活性剂是一种高分子质量的生物表面活性剂,黏度较大,具有抗剪切的能力。常见的聚合生物表面活性剂有脂质糖、脂多糖、甘露糖蛋白和其他的多糖蛋白复合物,它们对一些碳氢化合物均表现出很好的乳化活性[29]。脂多糖主要由醋酸钙不动杆菌产生,是一种异脂多糖生物表面活性剂[30]。脂质糖通常由脂多念珠菌生产,是另一种有效的乳化剂,含有17%的蛋白质和83%的碳水化合物,其碳水化合物的比例与脂多糖的比例非常相似,均能作为生物絮凝剂和生长刺激剂使用[31]。
2 生物表面活性剂的性质
生物表面活性剂非极性疏水尾部由不同长度和复杂程度的碳氢链组成,而极性亲水头部由肽、碳水化合物、氨基酸、醇或磷酸羧酸组成。由于其独特的分子组成和结构,它们表现出多种物理化学性质和生物特性,如能降低表面张力、可生物降解、毒性低,还具有良好的乳化活性和抑菌性。
2.1 良好的表面和界面活性
生物表面活性剂具有两亲性,可以改变流体的表面或界面张力,使其形成微乳液,从而导致胶体溶液、胶束体系和水-油悬浮液的增溶。表面张力测量的是液-液、液-固或液-气界面之间的吸引力[3],它是液体表面的弹性趋势,也是评估表面活性剂有效性的一个关键参数,当其在溶液中的浓度增加时,会导致表面张力下降,从而形成胶束,形成胶束所需的最低浓度称为临界胶束浓度[32]。表面活性剂由大的碳氢链组成,当这些表面活性剂被纳入液体溶剂系统时,它们占据了液体颗粒分子间的空间,这导致分子间的作用力变弱,并导致界面张力下降。分子之间表面张力的降低使得固体或液体溶质粒子与溶剂相互作用,形成新的附加表面,使不混溶的流体可混溶。胶束是同时包含疏水性和亲水性基团的聚集分子,其亲水基团面向水,而疏水基团面向油。胶束的形成导致疏水化合物分布到位于中心的伪核中,从而提高了溶解度。与化学表面活性剂相比,大多数生物表面活性剂的临界胶束浓度、表面和界面张力值较低,在类似的应用中更有效和高效[30]。
2.2 乳化和破乳能力
乳化是指一种不混溶的液体通过形成微液滴分散到另一种液体中[33],该过程产生的胶束溶解颗粒的尺寸大于0.1 mm。而去乳化过程则是通过干扰内相和体相之间存在的表层的稳定性,使乳状液不稳定。非均相乳液体系主要包括油包水型和水包油型。许多生物表面活性剂具有显著的乳化活性,并且可以很容易地溶解水中的碳氢化合物,鼠李糖脂和槐糖脂以其较高的乳化指数和较低的表面张力而闻名[34-35]。高地芽孢杆菌产生的脂肽对不同碳氢化合物(原油、机油、橄榄油和煤油)表现出不同的乳化活性,且其在672 h内的乳液稳定性也不相同,对原油的乳化稳定性最高,为95.8%[36]。高分子质量生物表面活性剂具有乳化活性,但在降低表面张力方面效果不明显。乳酸菌产生的生物乳化剂/生物表面活性剂在牛奶面包制备中的乳化性能比商业乳化剂大豆卵磷脂更明显,可以改善面团的流变性(降低面团黏度)、降低面包屑的质地(降低硬度,提高均匀性)、增加面包的最终体积[37],这证明了生物乳化剂/生物表面活性剂在牛奶面包制备中极具潜力,并展示出其作为化学乳化剂的替代品在食品工业中的应用前景。
2.3 生物降解能力
生物表面活性剂是一种环境友好型化合物,化学表面活性剂易于在环境中积累并引起生态毒性,而生物表面活性剂易被生物降解,不会在土壤和水中堆积[14],已被有效地应用于各种生物修复和生物吸附过程中[38-39]。鼠李糖脂在好氧、硝酸盐还原、硫酸盐还原和厌氧条件下均可生物降解,而Triton X-100等化学表面活性剂仅在好氧条件下可部分生物降解[40]。此外,生物表面活性剂还会促进其他化合物的生物降解,许多学者发现缓释营养物质与鼠李糖脂的联合应用有效地提高了微生物的代谢活性,富集了原油降解细菌,促进了稠油的生物降解[41]。
2.4 抗菌和抗黏附特性
生物表面活性剂有抑菌活性,同时也被认为是一种抗黏附剂,可以通过改变疏水性来减少微生物对生物膜表面的黏附,这有助于形成稳定的生物膜,因为微生物、疏水物质或电荷等外来源不会黏附在生物膜的表面[14]。FATIMA等[42]以鱼胶原蛋白、聚乙烯醇和鼠李糖脂为原料制备无珠状、光滑的纳米纤维垫,发现在纳米纤维上添加生物表面活性剂可以增强纤维的自旋能力,减少纤维直径,还能提高降解稳定性和静电纺纳米纤维毡的杀菌性能。还有学者发现鼠李糖脂分别和银以及氧化铁包裹形成的纳米颗粒无论是在生物膜形成过程中,还是在预先形成的生物膜上,都表现出良好的抗生物膜活性,这是因为鼠李糖脂通过改变细胞的表面疏水性,显著降低了细胞的黏附,从而增强了纳米颗粒对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌2种菌株的抗生物膜特性[43]。
2.5 低毒性
生物表面活性剂被认为是低毒甚至无毒的化合物,可被用于制药、化妆品和食品行业,有望成为化学表面活性剂的替代品。一些研究已经探索了生物表面活性剂在植物、动物等细胞系中的毒性[7,44]。单鼠李糖脂对水蚤和斑马鱼胚胎的急性毒性与化学表面活性剂相当,甚至低于化学表面活性剂,而且鼠李糖脂对黑曲霉孢子的萌发和白色念珠菌的生长表现出非常低的毒性。在实验条件下,鼠李糖脂类既没有诱导移码突变或碱基替换,也没有显示出雌激素破坏的潜力[45]。另外,JOHANN等[45]测出在雄性小鼠中脂肽的半数致死量为475 mg/kg,而每日摄入低于47.5 mg/kg体重的脂肽对小鼠血液参数和血清生化数据没有显著影响。
3 生物表面活性剂的鉴定方法
生物表面活性剂的制备方法主要包括沉淀、溶剂萃取、色谱纯化和泡沫分馏等[46-47]。沉淀法包括硫酸铵沉淀、硫酸铝沉淀和酸沉淀,可用于提取低分子质量生物表面活性剂,并根据其亲疏水性使用氯仿、甲醇、丙酮和乙酸乙酯等不同的溶剂进行提取[21,47],还可进一步采用硅胶柱色谱法获得纯化的生物表面活性剂。泡沫分馏不需要使用溶剂就可以分离吸附在培养基气泡中的生物表面活性剂分子,也是近年来研究较多的分离技术之一,在海藻糖脂的制备中不仅可以提高产量,还具有廉价和环境友好的特性[48]。
近几十年来,随着科学和技术的进步,一系列新技术已经被引入来鉴定和表征生物表面活性剂,如薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)、傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(gas chromatograph-mass spectrometry,GC-MS)、液相色谱-质谱法(liquid chromatograph mass spectrometry,LC-MS)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)法等。
3.1 薄层色谱法
TLC是检测和鉴定生物表面活性剂中未知成分的应用最广泛的技术之一,一些研究人员将TLC或高效薄层色谱(high performance thin layer chromatography,HPTLC)作为不同生物表面活性剂的初始定性检测或定量分析的方法[49-51]。TLC是在一张铝箔、玻璃片或塑料片上进行的,上面覆盖着一层薄薄的吸附剂材料,通常是氧化铝、硅胶或纤维素,用来检测是否存在碳水化合物、脂类和蛋白质等[52]。WANG等[53]用TLC对生物表面活性剂进行初始定性检测,发现生物表面活性剂不含有碳水化合物,而且很有可能是一种脂肽类物质。除此之外,HPTLC是一种更精确的定量方法,可以在短时间内对许多样品进行定量,减少了交叉污染,具有更高的灵活性,因为其溶剂的选择不受紫外线透明度或黏度的限制。AL-WAHAIBI等[54]使用了全自动HPTLC系统对分离的生物表面活性剂进行定性检测,并比较分离的生物表面活性剂条带,发现使用不同的溶剂体系可能会得到更好的分离效果。GEISSLER等[51]使用HPTLC同时定量芽孢杆菌培养物中的环状脂肽-表面活性素、伊枯草菌素A和丰原素,还采用HPLC-紫外/可见光方法对样品中的超荧光素进行定量,并将数据与HPTLC法进行比较。结果表明,在运行分析的总时间消耗方面,HPTLC耗时更少;与HPLC相比,HPTLC的结果同样可靠。HPLC可以监测单个同源物,而如果需要测定一个脂肽家族,HPTLC方法在灵敏度、积分势、分析时间、溶剂量和成本等方面都有显著优势。
3.2 红外光谱法
FTIR是通过红外辐射测量样品的波长和对吸收光谱的分析来确定生物表面活性剂的分子成分和结构[52]。生物表面活性剂各种官能团的基本振动都可以在4 000～400 cm-1的范围内找到[55]。FTIR具有很多优点,如检测灵敏度高、测量精度高、分辨率高、测量速度快、散光低以及波段宽等,而且红外光谱是非破坏性的,这意味着生物表面活性剂的结构组成完全保持不变。WANG等[53]发现生物表面活性剂的FTIR光谱显示了其吸收带与脂肽成分的存在一致,证明该生物表面活性剂为脂肽。
3.3 高效液相色谱法及质谱法
质谱法可以提供关于所研究化合物分子质量的详细结构信息[56],也被用于测定生物表面活性剂样品中的结构和化学键,它通常与液相色谱法或气相色谱法相结合来确定生物表面活性剂的结构,并对其进行定性和定量分析[57-60]。在大多数情况下,生物表面活性剂的亲水和疏水部分可以分别使用LC-MS和GC-MS进行分析。JIMOH等[61]采用GC-MS分析脂肪酸甲酯,鉴定出的脂肪酸为十六烷酸,然后通过LC-MS分析获得的数据进一步确定生物表面活性剂为脂肽类,确定了其结构组成,推断出肽段的氨基酸序列。此外,质谱还可以与电喷雾电离相结合[62],使用高电压分离产生的大分子碎片来识别不同的生物分子能够提供更好的准确性,如鉴定生物表面活性剂的蛋白质和肽部分。
HPLC常用于分离、鉴定和定量混合物中的每个组分其优点是分析速度快、柱效高、检测灵敏度高[63],在级联过程中,HPLC可以在短时间内表征存在于大量体积混合物中的每个成分,节省了下游过程的时间。电喷雾电离可以与液相色谱结合[61],有助于鉴定生物表面活性剂。YIN等[64]采用了高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱(high-performance liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometery,HPLC-ESI-MS)法对生物表面活性剂的化学成分进行了分析,证实了铜绿假单胞菌产生的生物表面活性剂活性成分是鼠李糖脂,其中至少含有13个鼠李糖脂同源物,每个同源物由1～2个鼠李糖残基和1～2个脂肪酸(C8～C12)组成。MALDI是一种软电离质谱技术,可以识别完整的化合物[56]。由于MALDI-TOF/MS的软电离能力,它与质谱的结合也能够鉴定生物表面活性剂[65-66]。尽管MALDI-TOF/MS检测成本高昂,但它具有快速和精细的特点,为生物表面活性剂的基本表征提供了高分辨率数据。
为了测定生物表面活性剂的完整结构,还需要利用NMR技术[59,62,67]。它是能够识别官能团以及碳水化合物和脂质分子中连接位置的一种方法。通过NMR实验可以得到每个官能团的确切位置,并可以获得有关结构异构体的信息。另外,它还能检测出样品的成分和纯度。
4 生物表面活性剂的应用
如上所述,生物表面活性剂由于其细胞表面的疏水性而具有独特的性质,能够降低不混溶或可混溶液体之间的表面张力。由于生物降解性、底物特异性、快速控制失活等多种功能,生物表面活性剂在各行业中的重要性日益凸显,在食品、医药、环境、石油、纳米技术(介导的金属纳米颗粒的生物合成)、商业洗衣剂、纺织品、造纸和油漆行业以及污染控制等方面都有潜在用途。
4.1 食品领域
在食品工业中,生物表面活性剂的乳化、发泡、润湿、增溶、抗黏连和抗菌性都有利于食品加工,这些特性可以增加高稳定性产品的表面积[47],形成稳定的乳剂,改善乳制品的质地和保质期[52],为消费者提供安全和健康的食品[47]。除此之外,生物表面活性剂还可以控制脂肪球的聚集,稳定充气系统,改善含淀粉产品的质地和保质期,改变小麦面团的流变性能及改善脂肪类产品的分散性和质地[68]。酵母和细菌产生的大多数生物表面活性剂可以在各种pH和温度条件下发挥作用,在酸性pH值下依然保持良好的黏度,可以用于含有柠檬酸或抗坏血酸的产品,是一种潜在的增黏剂[69]。生物表面活性剂作为食品添加剂的使用是安全的,它可以抑制生物膜的形成,去除蔬菜中的重金属[70-71],芽孢杆菌产生的生物表面活性剂可去除蔬菜约73%的镉[72]。另外,与化学表面活性剂相比,生物表面活性剂具有较高的抑制食品病原体生物膜和微生物的活性,这是生物表面活性剂能成为食品加工过程中的主要添加剂的原因之一。尽管生物表面活性剂在食品中有各种应用的可能性,仍需要大量的研究来验证其在不同加工条件下食品复杂基质中填加的可行性,使其在尽可能低的浓度下达到最大的作用。
4.2 医药领域
生物表面活性剂可以用于不同的药物和生物医学领域,它能够破坏细胞膜,通过增加细胞膜通透性导致代谢物泄漏,导致细胞裂解[73],这是由于物理膜结构的变化或通过破坏蛋白质构象导致重要膜功能的改变,如运输和能量产生[74]。生物表面活性剂还可用于各种制药业,它们固有的抗菌性使它们成为对抗各种疾病和紊乱的合适分子,可以作为呼吸衰竭的治疗剂、抗黏连剂和免疫佐剂,还能抑制病原体,刺激皮肤纤维细胞的代谢[75-76]。CORAZZA等[77]评估了加氏乳杆菌生产的生物表面活性剂作为创新天然辅料来改善氢化可的松鼻给药的可能性,发现生物表面活性剂能够与鼻黏膜的主要成分相互作用,而且在低浓度下药物具有更大的溶解性和渗透性。表面活性素与靶细胞膜有广泛的相互作用[75],除了抗菌、抗病毒和抗肿瘤的功能,还可以抑制纤维蛋白凝块形成,诱导离子通道的形成脂质双层膜,阻止环腺苷的活动,抑制血小板和脾胞质磷脂酶A2(phospholipaseA2,PLA2)[75]。表面活性素通过阻断NK-κB、MAPK和Akt通路在抑制巨噬细胞免疫刺激功能中的作用[78],可以抑制NF-κB激活,下调调控脂多糖诱导的RAW264.7细胞和初级巨噬细胞的NO生成[79],然后通过ROS/JNK介导的线粒体/aspase途径诱导人类乳腺癌MCF-7细胞凋亡[80]。这为表面活性素在自身免疫性疾病和移植中的免疫药理学作用提供了一个新的见解。表面活性素具有强大的免疫抑制能力,对移植和自身免疫性疾病具有重要的治疗意义,包括过敏、关节炎和糖尿病等[47]。
4.3 环境领域
生物表面活性剂同时含有亲水和疏水基团,降低了不混溶流体的表面和界面张力,增强了疏水有机物和无机化合物在水相中的分散性和溶解性[81],从而提高微生物对疏水性底物的利用,加速生物降解过程,大量研究证实了生物表面活性剂在生物修复、生物吸附和生物增溶等环境应用中的潜力[82]。生物表面活性剂具有高生物降解性和无毒性,能够作为一种抗黏附剂和抗菌膜剂。通过对表面疏水性的改变来增强微生物对不同污染物的黏附性[83],对恢复污染环境具有重要价值。生物表面活性剂还可以通过络合过程去除重金属,其作用机理是生物表面活性剂的负电荷分子与重金属阳离子相互吸引,因此生物表面活性剂也可用于废水处理以改善社会环境。此外,表面活性剂在消除污染环境中的多环芳烃方面也承担着重要作用,皂素和鼠李糖脂的应用会影响污染物的溶解度,导致微生物和疏水污染物之间的生物利用度的增加,从而改善污染环境中包括多氯联苯在内的疏水有机化合物的生物降解[82]。
4.4 石油工业
生物表面活性剂也可以用于石油工业,以清理石油泄漏,清除储罐中的石油残留物,以及微生物增强石油回收率。与化学表面活性剂相比,生物表面活性剂更具选择性,它们所需的数量少,在更广泛的石油和油藏条件下更有效;还可以应用于各种工业过程以增加溶解度、润滑性和流动性,并去除土壤和洗涤[84]。微生物提高原油采收率是指利用微生物或其产品来提高油藏中的剩余原油采收率。生物表面活性剂可以降低油/水界面张力、改变油藏的润湿性及乳化原油,从而显著提高原油的流动性,增加原油的采收率[29]。SATPUTE等[85]研究发现,相比化学表面活性剂,生物表面活性剂具有较高的石油污染物去除效率,这可能是由于生物表面活性剂较高的表面作用和与环境的相容性。另外,ASHISH等[86]还使用了枯草芽孢杆菌MTCC 230产生的生物表面活性剂从饱和砂油柱中回收油,得到的额外油采收率为39.8%,这表明其适用于油藏微生物提高采收率的商业用途。
5 结论与展望
生物表面活性剂具有优异的表面和界面活性、乳化性、生物降解性、抗黏附性、低毒性等某些独特的性能。生物表面活性剂的结构可以通过采用TLC、FTIR、HPLC和质谱法等技术来鉴定。由于其特征的多样性,生物表面活性剂被广泛应用于制药、食品、石油、煤炭、冶金和采矿工业、化妆品、农业和化肥等领域。本文综述了生物表面活性剂的分类、特性和鉴定,并讨论了其在各个领域中的应用,然而目前对生物表面活性剂的研究依然不足,阻碍了其开发利用及发展。制备生物表面活性剂需要较高的成本,如何降低其生产成本是亟待解决的难题。通过应用专门的成效益本测试和讨论,也许有可能找到允许大规模使用生物表面活性剂的突破口。此外,生物表面活性剂的作用机理及其对人体细胞的影响还需要进一步研究,以期深入挖掘生物表面活性剂在不同领域的应用,解决当下在实际应用中碰到的难题。
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