保健酒是一种具有某些特定保健养生功能的饮料酒,根据2019年2月1日起实施的T/CBJ 5102—2019《保健酒》,将保健酒定义为以蒸馏酒、发酵酒或食用酒精为基酒,加入符合国家相关规定的原料、辅料或食品添加剂,经注册或备案,并声称具有保健功能的饮料酒。保健酒适用于特定人群食用,它不以治疗疾病为目的,对人体不产生危害,主要用于调节机体的功能,在养生保健方面具有显著的功效和作用。
保健酒在中国历史悠久,古人以酒泡药材制成,其原理是利用一定浓度的白酒通过浸泡的方式将药材中有用的成分提取出来,饮后具有特定的保健养生效果;现代采用新兴技术将药材原料中的有效成分以更加科学的方法提取出来,通过提取、渗漉、调配等工艺制成保健酒,生产过程中对重要功效成分进行控制,保证保健酒质量稳定可靠。
追风八珍酒是以清香型小曲原酒为基酒,以黄芪、杜仲、五加皮、枸杞子、天麻、桑椹、制黄精、木瓜共八味药材以及一味风味药材肉桂为药材原料,提取药材的有效成分,运用中医组方以适合比例混合精制而成的一款具有增强免疫力功效的保健酒。本研究采用液相色谱结合中药材指纹图谱技术研究追风八珍酒的微量成分,并对微量成分的功效进行分析,为追风八珍酒的健康内涵提供科学依据。
1 追风八珍酒微量成分含量分析
对追风八珍酒的微量成分进行分离提纯,采用液相色谱分析技术,对其原料药材中可能存在的化学成分以保留时间及二极管阵列检测器(diode array detector,DAD)全波长吸收曲线定性,最终分离出了响应值较高的7种特征化合物,并对其含量进行了测定。
1.1 微量成分分离提纯
取酒样10 mL于50 ℃减压蒸至近干,用5 mL水溶解残渣,上HLB固相萃取柱(SelectCore HLB 200 mg 6 mL),用10 mL水预洗,去掉水洗脱液,再用10 mL 50%(体积分数)乙醇洗脱,收集洗脱液,于50 ℃减压蒸至近干,残渣用50%(体积分数)甲醇溶解,定容至5 mL,摇匀。
1.2 高效液相色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(如Agilent SB-Aq C18色谱柱4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈为流动相A,0.1%磷酸溶液为流动相B,梯度洗脱(0～10 min,5%～10%A;10～60 min,10%～20%A);流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长为210 nm;进样量20 μL。
1.3 微量成分含量测定
经分离提纯的样品采用以上色谱条件检测分析,得到原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁共7种微量成分的含量,分析了6批次追风八珍酒微量成分,检测结果如表1所示,追风八珍酒微量成分色谱图如图1所示。
表1 六批次追风八珍酒微量成分检测结果 单位:mg/L
Table 1 Test results of trace components in 6 batches of Zhuifengbazhen wine
批次原儿茶酸绿原酸巴利森苷B松脂醇二葡萄糖苷毛蕊异黄酮苷巴利森苷A芦丁12.461 15.233 3.441 3.158 1.288 5.811 1.022 22.465 15.158 3.209 2.989 1.248 5.677 1.054 33.100 18.972 3.083 3.445 1.236 6.700 2.139 43.155 19.809 3.417 3.584 1.335 6.963 1.487 52.876 20.162 3.446 3.477 1.333 6.975 1.243 62.740 19.348 3.046 3.640 1.314 8.180 1.162
图1 追风八珍酒微量成分色谱分析图
Fig.1 Chromatographic analysis of trace components in Zhuifengbazhen wine
1.4 追风八珍酒微量成分含量分析测定
追风八珍酒经分离提纯,采用液相色谱技术分析,利用色谱峰保留时间及DAD全波长扫描吸收曲线定性,最终鉴定出了原儿茶酸、绿原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A、芦丁共7种含量相对较高的微量成分。
2 追风八珍酒微量成分来源筛查
追风八珍酒采用了黄芪、杜仲、五加皮、枸杞子、天麻、桑椹、制黄精、木瓜八味主体药材,一味风味药材(肉桂),为了解和确认追风八珍酒微量成分的来源,采用中药指纹图谱技术对追风八珍酒及其使用的原料药材进行研究,以更好地了解药材中有效成分向追风八珍酒中的转移情况。
2.1 供试品溶液的制备
追风八珍酒使用的药材原料种类较多,且中药材成分复杂多样,故追风八珍酒及药材原料指纹图谱供试品溶液制备过程中分两步洗脱,得到水饱和乙醚部位及无水乙醇部位供试品溶液,并选择合适的色谱条件分别进行分析,以此优化各种化合物的分离效果。
2.1.1 追风八珍酒供试品溶液的制备
量取10 mL追风八珍酒,于40 ℃减压蒸至近干,上样于Copure HLB固相萃取小柱(规格:200 mg/6 mL,上柱前先用6 mL甲醇和12 mL水活化,下同),水洗40 mL,然后用10 mL水饱和乙醚洗脱,收集洗脱液,取乙醚层,50 ℃旋蒸至干,残渣用1 mL 50%甲醇溶解,摇匀,即得水饱和乙醚部位供试品溶液;再用10 mL 无水乙醇洗脱,收集洗脱液,50 ℃旋蒸至干,残渣用1 mL 50%甲醇溶解,摇匀,即得无水乙醇部位供试品溶液。
2.1.2 药材供试品溶液的制备
根据药材有效成分的性质,将追风八珍酒中用到的药材分为两组,采用两种方法分别进行提取提纯制备供试品溶液:
第一组:桑椹、制黄精、木瓜,各取药材粉末1 g,加入100 mL水,加热回流提取2 h,取出,放冷,过滤,取滤液10 mL,上样于Copure HLB固相萃取小柱,后续同追风八珍酒供试品溶液的制备方法制备药材供试品溶液。
第二组:黄芪、杜仲、五加皮、枸杞子、肉桂、天麻,各取药材粉末1 g,加入100 mL 50%乙醇,加热回流提取2 h,取出,放冷,过滤,取滤液10 mL,40 ℃减压蒸至近干,上样于Copure HLB固相萃取小柱,后续同追风八珍酒供试品溶液的制备方法制备药材供试品溶液。
2.2 指纹图谱色谱条件
2.2.1 水饱和乙醚部位
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(如Sepax HP-C18色谱柱 4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈-0.1%(体积分数)磷酸溶液梯度洗脱(表2);检测波长210 nm;柱温30 ℃;进样量20 μL;流速1.0 mL/min。
表2 追风八珍酒水饱和乙醚部位指纹图谱梯度洗脱条件
Table 2 Gradient elution conditions of fingerprints of the water saturated diethyl ether part of Zhuifengbazhen wine
时间/min乙腈/%0.1%磷酸溶液/%0595201288302080402575604555751000801000
2.2.2 无水乙醇部位
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(如Sepax HP-C18色谱柱 4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱(表3);检测波长210 nm;柱温30 ℃;进样量20 μL;流速1.0 mL/min。
表3 追风八珍酒无水乙醇部位指纹图谱梯度洗脱条件
Table 3 Gradient elution conditions of fingerprints of the absolute ethanol part of Zhuifengbazhen wine
时间/min乙腈/%0.1%磷酸溶液/%05951010906020809040609510001001000
2.3 色谱峰的指认
2.3.1 水饱和乙醚部位指纹图谱色谱峰的指认
对比追风八珍酒与各药材水饱和乙醚部位指纹图谱,以保留时间及DAD光谱图定性,分别查找追风八珍酒中7种微量成分的来源。水饱和乙醚部位指纹图谱分析结果表明,追风八珍酒水饱和乙醚部位中原儿茶酸主要来源于桑椹、木瓜,绿原酸来源于五加皮,如表4所示。
表4 追风八珍酒水饱和乙醚部位指纹图谱色谱峰来源考察
Table 4 Investigation on the source of the chromatographic peaks of the fingerprints of the water saturated diethyl ether part of Zhuifengbazhen wine
化合物名称来源原儿茶酸桑椹、木瓜、杜仲(微量)、五加皮(微量)、黄精(微量)绿原酸 五加皮
追风八珍酒及其原料药材水饱和乙醚部位指纹图谱如图2、图3所示。
图2 追风八珍酒水饱和乙醚部位指纹图谱
Fig.2 Fingerprint analysis of water saturated diethyl ether parts of Zhuifengbazhen wine
图3 药材水饱和乙醚部位指纹图谱
Fig.3 Fingerprint analysis of water saturated diethyl ether parts of medicinal materials
2.3.2 无水乙醇部位指纹图谱色谱峰的指认
对比追风八珍酒与各药材无水乙醇部位指纹图谱,以保留时间及DAD光谱图定性,分别查找追风八珍酒中7种微量成分的来源。无水乙醇部位指纹图谱分析结果表明,追风八珍酒无水乙醇部位中绿原酸主要来源于五加皮、杜仲、桑椹,巴利森苷B来源于天麻,松脂醇二葡萄糖苷来源于杜仲,毛蕊异黄酮葡萄糖苷来源于黄芪,巴利森苷A来源于天麻,芦丁来源于桑椹、枸杞,如表5所示。
表5 追风八珍酒无水乙醇部位指纹图谱色谱峰来源考察Table 5 Investigation on the source of the chromatographic peaks of the fingerprints of the anhydrous ethanol part of Zhuifengbazhen wine
化合物名称 来源绿原酸五加皮、杜仲、桑椹、木瓜(微量)巴利森苷B天麻松脂醇二葡萄糖苷杜仲毛蕊异黄酮葡萄糖苷黄芪巴利森苷A天麻芦丁桑椹、枸杞
追风八珍酒及其原料药材无水乙醇部位指纹图谱如图4和图5所示。
图4 追风八珍酒水饱和乙醚部位指纹图谱
Fig.4 Fingerprint analysis of anhydrous ethanol parts of Zhuifengbazhen wine
图5 药材无水乙醇部位指纹图谱
Fig.5 Fingerprint analysis of anhydrous ethanol parts of medicinal materials
2.4 追风八珍酒微量成分来源筛查结论
综合追风八珍酒及其药材原料水饱和乙醚部位及无水乙醇部位指纹图谱分析结果,研究表明,追风八珍酒微量成分中绿原酸主要来源于五加皮、杜仲及桑椹;原儿茶酸主要来源于桑椹及木瓜;巴利森苷A和巴利森苷B来源于天麻;松脂醇二葡萄糖苷来源于杜仲;毛蕊异黄酮葡萄糖苷来源于黄芪;芦丁来源于桑葚及枸杞。运用中药指纹图谱技术,确认了7种微量成分的来源,同时也证实了这7种微量成分来自这八味天然中药材。
3 微量成分的功效探讨
近年来,国内外众多学者开展过很多研究,证实了原儿茶酸、绿原酸、芦丁及松脂醇二葡萄糖苷等化合物具有某些特定的药理作用及功效,这些化合物是追风八珍酒药理作用的基础。
研究表明,绿原酸具有增强免疫力、抗氧化、抗菌、抗病毒、降压、抗肿瘤、降血糖、降血脂,抗炎等作用。PARK 等[1]研究发现白细胞介素1受体相关激酶4(IL-1 receptor associated kinase 4,IRAK4)是绿原酸调节免疫力的分子靶点。ABAIDULLAH等[2]首次在体内外研究绿原酸对传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的抗病毒特性,结果表明在高浓度下绿原酸是一种强抗IBV的化合物,能有效地通过黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation related gene 5,MDA5)、Toll样受体7(toll-like receptors 7,TLR7)和核转录因子(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路调节固有免疫。GUO 等[3]研究绿原酸的异构化和氧化作用对RAW264.7巨噬细胞中核转录因子E2相关因子2 (nuclear factor erythroid-2 related factor2,Nrf2)和NF-κB 信号通路的潜在免疫调节活性的影响,结果表明异构化和氧化通过Nrf2和NF-κB通路显著影响绿原酸的免疫调节。张建华等[4]考察绿原酸对小鼠细胞免疫和体液免疫的影响,结论表明绿原酸可明显增强机体细胞免疫和体液免疫的功能。刘迪等[5]从榆叶中分离纯化黄酮类化合物和绿原酸,通过动物实验和自由基清除实验研究其体内外抗氧化活性,结果表明杜仲叶绿原酸具有显著的体内外抗氧化活性。KABIR 等[6]采用分光光度法评定绿原酸的抑菌效果,结果表明绿原酸及其相关化合物不仅具有抑菌作用,而且具有杀菌效果。DING 等[7]研究绿原酸对甲型流感病毒的抗病毒作用及其可能的作用机制,结果表明绿原酸在细胞和动物模型中均可作为神经氨酸酶阻断剂抑制甲型流感病毒。李旭等[8]研究杜仲叶绿原酸提取工艺优化及对自发性高血压大鼠的降压作用,结果表明绿原酸提取物高剂量组对自发性高血压大鼠具有良好且稳定的降压效果。ZENG 等[9]研究绿原酸对乳腺癌的抗肿瘤活性,研究表明绿原酸通过损伤NF-κB/EMT信号通路,提高了乳腺癌的抗肿瘤免疫功能,发挥了抗肿瘤和抗转移的作用。袁俊[10]通过对小鼠口服耐糖体内实验,比较小鼠空腹服用淀粉及同时服用淀粉和绿原酸血糖浓度的变化,结果表明绿原酸可以抑制淀粉所致的血糖浓度上升,而这一抑制作用可能是通过抑制α-淀粉酶来实现的。ZHONG等[11]研究绿原酸对肥胖小鼠的降脂作用及其解脂机制,结果表明绿原酸可以改善肥胖小鼠血脂和肝功能,其机制可能与过氧化物酶体增生物激活受体γ辅激活子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 α,PGC-1α)/解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)通路有关。LUO 等[12]采用活的痤疮丙酸杆菌诱导ICR小鼠耳部皮肤炎症模型探讨绿原酸对痤疮的影响及其机制,结果表明绿原酸有效地挽救了痤疮丙酸杆菌诱导的ICR小鼠耳肿胀、红肿和红斑皮肤,并通过降低NF-κB信号通路的活性显著下调炎性细胞因子的表达。
原儿茶酸具有增强免疫力、抑菌、抗炎、抗氧化等作用。GUO等[13]评估了SPF鸡对原儿茶酸的体液和细胞反应,结果表明原儿茶可以通过增强体液免疫和细胞免疫反应来改善家禽健康。芦平等[14]研究原儿茶酸对副溶血弧菌的抑菌活性和减毒作用,并揭示原儿茶酸抑菌的作用机制,结果表明原儿茶酸主要作用于细胞膜,通过影响细胞膜的完整性和通透性抑制副溶血弧菌的生长,在亚抑菌浓度下便可有效减弱副溶血弧菌毒力。KAEWMOOL等[15]通过调节小胶质细胞沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1),考察原儿茶酸对小胶质细胞活化诱导的神经细胞死亡是否具有抗炎作用,结果表明SIRT1介导原儿茶酸的抗神经炎症作用可以改善小胶质细胞活化诱导的神经元死亡。近年研究表明,原儿茶酸具有体内外抗氧化活性的药理作用[16]。
芦丁具有免疫调节、抗氧化及抗炎等作用。GANESHPURKAR等[17]通过迟发型超敏反应、碳廓清试验、白细胞动员试验和环磷酰胺诱导的骨髓抑制测定芦丁对细胞免疫的影响,通过血凝抗体滴度测定芦丁对体液免疫的影响,研究结果表明芦丁具有通过细胞和体液介导的机制增加免疫活性的作用。此外,芦丁及其代谢产物被证实还具有抗氧化及抗炎作用[18]。
松脂醇二葡萄糖苷具有降血压、改善骨质疏松等作用。韩莉娟[19]分别采用正常动物、模型动物、离体器官,在整体和离体水平研究了松脂醇二葡萄糖苷不同给药方式、给药周期对于血压的调节作用,结果表明松脂醇二葡萄糖苷是一种高效、安全的天然降压活性成分。ZHANG 等[20]探讨松脂醇二葡萄糖苷对地塞米松诱导的大鼠骨质疏松的影响,结果表明松脂醇二葡萄糖苷通过增加骨量和调节骨代谢对地塞米松诱导的骨质疏松表现出保护作用。
毛蕊异黄酮苷具有治疗骨关节疾病、抗肿瘤、抗氧化等作用。JIAN 等[21]探讨毛蕊异黄酮苷在骨髓基质细胞系ST2细胞中的成骨作用及其机制,结果表明毛蕊异黄酮苷通过调控骨形态发生蛋白BMP/WNT信号通路促进ST2细胞成骨分化,毛蕊异黄酮苷可以改善骨质减少性疾病和促进骨再生。厉婷等[22]探讨毛蕊异黄酮苷对卵巢上皮性癌细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用及其可能机制,结论表明毛蕊异黄酮苷能够通过抑制人卵巢上皮性癌细胞SKOV3增殖,并诱导其凋亡,从而发挥抗肿瘤作用,其机制可能与p53和Caspase-3通路激活有关。刘靖丽等[23]考察中药黄芪中黄酮类化合物的抗氧化活性强弱,研究表明毛蕊异黄酮苷具有较强的抗氧化活性。
4 结论与讨论
本研究鉴定了追风八珍酒中主要有绿原酸、原儿茶酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、巴利森苷A及芦丁等微量成分,对含量进行了测定,并确认了这些微量成分分别来自于哪几味天然中药材原料。近些年来,众多学者开展过很多试验,证实了这些化合物具有增强免疫力、抗菌、抗氧化、降血压等多方面的功效,其中绿原酸、原儿茶酸及芦丁均具有增强免疫力的作用。此研究为追风八珍酒具有增强免疫力等功效提供了科学依据,同时为保健酒微量成分的研究提供了一种可以借鉴的方法。
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