铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科草本植物,是我国药食两用的名贵中药材,位列“九大仙草”之首,主治益胃生津、滋阴清热。研究表明,铁皮石斛含有多糖、黄酮、生物碱、香豆素、酚类和氨基酸等[1]功能成分,具有调节肠道菌群、消炎抑菌、增强免疫力和降低血糖血脂等[2-3]功效。铁皮石斛的食用方式主要有鲜食、入药、泡茶、炖煮等。2020年国家卫健委新增铁皮石斛为药食同源物质,在食品领域掀起研发热潮,如以铁皮石斛为原辅料制成酒、醋、酵素等。中草药入曲利于酵母菌和霉菌等功能菌繁殖,抑制杂菌生长,从而提高小曲品质[4]。经检测发现石斛小曲的优势菌属为芽孢杆菌属、根霉菌属、曲霉菌属和威克汉姆酵母属[5],能起到较好地糖化发酵作用。糯米饮料是以糯米为主要原料,按需添加果蔬汁等辅料,发酵而成的液体饮料。糯米发酵时不仅能产生有机酸、氨基酸,还能形成特殊香气,对改善饮料品质有正向作用[6]。目前,国内外对铁皮石斛的研究集中在药理方面,利用铁皮石斛制曲,在糯米发酵时作为发酵剂进行研究的报道较少。
因此,本文以糯米饮料不同发酵阶段的醪醅为研究对象,通过化学方法、HPLC和顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术(headspace solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometry, HS-SPME-GC-MC)动态监测发酵期间的理化特性、有机酸和挥发性物质。旨在初步明晰糯米饮料发酵过程中风味物质的变化趋势,同时也为铁皮石斛深加工的拓展研究提供新方向及理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品采集
石斛小曲:30%(质量分数)铁皮石斛茎粉与大米粉混匀,经润料、灭菌、冷却后,接入0.7%根霉菌Q303,于30 ℃恒温培养48 h,低温干燥后即得石斛小曲。
糯米饮料:糯米上汽蒸煮20 min后,立即用凉白开降温至28～30 ℃,随后拌入0.8%石斛小曲,混匀后于31 ℃培养箱发酵49 h。在发酵0、12、24、36、48 h对醪醅上层、中层和下层物料进行取样并混匀,随即用无菌密封袋包装,保存于-80 ℃超低温冰箱中直至分析。
1.1.2 实验试剂
草酸、柠檬酸、乳酸、乙酸、酒石酸、磷酸二氢钾,均为分析纯,天津科密欧化学试剂有限公司;苹果酸、珀酸均为色谱纯,麦克林生化科技有限公司;甲醇、异丙醇均为色谱纯,河北百灵威超精细材料有限公司;环己酮为色谱纯(>99.5%,GC),上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.1.3 仪器与设备
PHS-3C pH计,上海科佑仪器仪表有限公司;手持式糖度计,Anton Paar上海商贸有限公司;GC-MS TSQ8000与TRACE1300气质联用,美国赛默飞世尔科技公司;50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头、DB-WAX(30 m×0.25 μm)色谱柱、高效液相色谱仪、ZORBAX SB-Aq(4.6×250 mm,5 μm)色谱柱,美国Agilent公司。
1.2 实验方法
1.2.1 理化指标的测定
总酸(酸碱滴定法),参照GB 12456—2021《食品中总酸的测定》;淀粉含量和还原糖含量(葡萄糖标准溶液反滴定法),参照DB 34/T 2264—2014《固态发酵酒醅分析方法》;氨基酸态氮(甲醛滴定法),参照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》;pH值(pH计)和糖度(糖度计)直接测定。每组试验重复3次。
1.2.2 有机酸的测定
样品前处理:准确称取1.00 g醪醅定容至10 mL,并超声10 min,离心后(10 000 r/min,10 min)取1 mL上清液过0.45 μm滤膜,用于HPLC分析。每组样品测3组平行。
HPLC分析条件:参考郑莎莎[7]的方法稍作修改。流动相为V[0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液(磷酸调节pH=2.0)]∶V(甲醇)=96∶4,进样量为10 μL,流速为0.8 mL/min,柱温为30 ℃,色谱柱为ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm),检测器为DAD检测器,检测波长为210 nm。
有机酸标准溶液配制:分别称取草酸、苹果酸和柠檬酸各0.05 g,酒石酸、琥珀酸各0.10 g,乳酸0.42 g,乙酸1.05 g,溶于纯净水并定容至100 mL,作为母液待用。分别取上述母液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL定容至50 mL,过0.22 μm滤膜,上机分析,每个浓度作3次平行,采用峰面积外标法进行定量分析。如表1所示,7种有机酸线性回归方程的相关系数(R2)均大于0.999,表明所测7种有机酸在浓度范围内具有良好的线性关系。
表1 七种有机酸的标准曲线
Table 1 Standard curve of seven organic acids
有机酸标准曲线R2草酸 y=9.681 5x+11.370.999 7酒石酸y=1.538 5x+0.660.999 9苹果酸y=5.001 5x+0.851.000 0乳酸 y=0.504 1x+1.170.999 9乙酸 y=12.521 0x+6.520.999 9柠檬酸y=0.967 5x+0.170.999 9琥珀酸y=0.644 3x-0.570.999 9
注:x代表浓度;y代表峰面积
1.2.3 挥发性风味物质的测定
样品前处理:准确称取2.50 g醪醅装入20 mL顶空瓶,加入5 mL饱和食盐水充分混匀,以10 μL环己酮(10 μg/kg)作为内标物质。制备完成后于60 ℃孵化20 min,后将老化的50/30 μmol/L DVB/Carboxen/PDMS萃取头插入顶空瓶中振荡提取40 min。提取完成后,立即将SPME纤维插入进样端口,于240 ℃解析5 min。
GC-MS条件:进样口温度240 ℃;升温程序为40 ℃(5 min),5 ℃/min上升到150 ℃(3 min),最后以5 ℃/min上升到240 ℃(5 min)。以高纯氦气(99.999%)为载气,载气流速为1.00 mL/min,不分流进样。
质谱条件:EI离子源,离子源温度250 ℃,电离电压70 eV,传输线温度240 ℃,扫描范围35～550 amu。
定性定量分析:具体方法参考母雨[8],稍作修改。与质谱NIST光谱数据库比对并鉴定,仅保留匹配度>800的化合物;通过内标法计算各挥发性组分的质量浓度。计算如公式(1)所示:
(1)
式中:Ci为待测挥发性组分含量,μg/kg;Cis为内标含量,μg/kg;Ai为待测挥发性组分色谱峰面积;Ais为内标色谱峰面积。
1.2.4 气味活度值
通过计算气味活度值(odor activity value, OAV),分析各风味物质对糯米饮料风味的贡献程度。计算如公式(2)所示:
(2)
式中:Ci为某种风味物质的含量,μg/kg;OTi为该风味物质的嗅觉阈值,μg/kg。
1.2.5 统计分析
利用SPSS Statistics 26分析数据,并用平均值±标准差(mean±SD)表示。采用SIMCA 14.1、Origin 2018和Tbtool对数据进行可视化。
2 结果与分析
2.1 糯米饮料发酵过程理化指标的变化
随糯米饮料发酵进行,小曲中微生物代谢引起理化指标发生变化。如图1所示,醪醅pH值和总酸呈此消彼长趋势,总酸含量增多,导致pH降低,二者在发酵期间变化显著(P<0.05),均在48 h出现峰值,总酸含量和pH值分别为2.23 g/L和4.38,这与陆雨洁等[9]利用单一根霉发酵糯米的研究结果相似。淀粉含量从25.27 g/100 g显著降低到17.53 g/100 g;还原糖和糖度含量变化则与之相反,随发酵进行显著增加(P<0.05),均在48 h时最大,分别为26.9 g/100 g和29.37 °Brix。这是因为霉菌代谢时会产生丰富糖化酶和淀粉酶,能有效分解淀粉产糖,同时产酸菌代谢导致醪醅酸度增加。氨基酸态氮含量从9.97 mg/100 g显著增加到22.99 mg/100 g,主要来自糯米中蛋白质的降解和部分酵母自溶[10]。
a-pH值;b-总酸含量;c-氨基酸态氮含量;d-淀粉含量;e-还原糖含量;f-糖度值
图1 糯米饮料发酵过程中理化指标变化
Fig.1 Changes of physical and chemical indexes in glutinous rice beverage during fermentation
2.2 糯米饮料发酵过程中有机酸分析
有机酸不仅能调节食品酸度,还能抑制杂菌,具有呈香调味作用[11]。如图2-a所示,有机酸总含量由36.16 mg/L显著上升至422.4 mg/L,在48 h时最高。乳酸、琥珀酸和柠檬酸是主要有机酸(图2-b),三者含量均显著增加(P<0.05),这与车逸心等[12]利用紫红曲霉与酿酒酵母发酵糯米时产酸结论一致。发酵结束后,新增了草酸和乙酸(图2-c)。
a-有机酸的总含量变化;b-7种有机酸含量相对百分比;c-7种有机酸含量变化
图2 糯米饮料发酵过程中有机酸含量变化
Fig.2 Changes of organic acids contents in glutinous rice beverage during fermentation
乳酸含量最高(11.1～229.71 mg/L),酸味柔和,略带乳香和涩感[13]。其次为柠檬酸(6.55～93.41 mg/L),具有清爽的酸味,有消除疲劳、炎症和预防糖尿病等作用[14]。然后是琥珀酸(10.28～74.68 mg/L),具有特殊鲜酸味、辣味,在发酵36 h后趋于平缓,可能是作为反应底物参与到其他代谢途径[15]。苹果酸带有生青味、酸涩味,可通过苹果酸-乳酸途径转化成酒精和乳酸,致其含量在发酵36 h后略有下降,这与张婷等[16]研究结论相似。酒石酸口感粗糙、生硬,含量在发酵24 h达到最高[(37.05±5.1) mg/L],随后快速下降,这可能与其生成酒石酸氢钾或被降解成乳酸有关[17]。草酸和乙酸含量较低,均在发酵24 h时才被检测到。草酸具有涩味,多以不溶性草酸钙形式存在于植物中[18];乙酸酸味刺激浓烈,具有醋味。
2.3 发酵糯米饮料发酵过程挥发性风味物质的动态变化
2.3.1 挥发性风味物质组成
由附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033657)可知,利用石斛小曲作为发酵剂,在糯米饮料发酵过程中共鉴定出58种挥发性风味物质,包括18种酯类、12种醇类、10种醛类、4种烷烃、3种酸类、3种酚类、2种烯烃、2种内酯、1种酮类和3种其他类。0、12、24、36、48 h醪醅分别鉴定出34、41、53、53、50种挥发性风味物质,各阶段总含量显著增加(P<0.05),依次为16.37、48.25、117.68、221.17、281.27 μg/kg。随发酵进行,醇类和酯类成为糯米饮料的主体香气物质,这与苏佳佳等[19]用甜酒曲发酵糙米时挥发性风味研究结果一致。
醇类在发酵期间含量最高,从2.74 μg/kg显著上升至194.21 μg/kg。醇类能赋予食品醇甜和果香,少量高级醇能使香气更饱满[20];主要由氨基酸的Ehrlich代谢[21]、酿酒酵母发酵、葡萄糖代谢及亚油酸降解等产生。醇类总占比67.78%,各阶段醇类含量依次为2.74、25.61、85.63、155.93、194.21 μg/kg。乙醇、异戊醇和苯乙醇显著增加(P<0.05),是主要的醇类物质,均在发酵48 h含量最高,分别为90.22、62.67、33.62 μg/kg。乙醇、异戊醇属于高级醇,能赋予糯米饮料较高香气值,同时也促进其他香气成分溶解[22];如乙醇能提供苹果甜香、异戊醇散发白兰地香和草香。苯乙醇呈类似玫瑰花香和茉莉花香,使糯米饮料更醇香,给人柔和愉悦的感觉[23]。
酯类在发酵期间种类最多(8～18种),大部分酯类呈花果香,主要由游离的酸类和醇类发生酯化反应、酵母菌代谢及酯化酶作用产生[24]。酯类含量总占比23.4%,变化趋势同醇类,伴随酵母菌活力降低,其增速在发酵36 h后趋于平缓,5个发酵阶段酯类含量依次为6.05、13.01、20.77、50.68、69.72 μg/kg。糯米饮料中乙醇含量较高,因此酯类以脂肪酸乙酯为主,如正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、十四酸乙酯、棕榈酸乙酯和油酸乙酯等。发酵后棕榈酸乙酯、油酸乙酯和十四酸乙酯成为主要酯类物质。棕榈酸乙酯、油酸乙酯和十四酸乙酯属于高级脂肪酸乙酯,棕榈酸乙酯呈微弱果香和奶油香气,能降低涩味,增加醇厚感[25];十四酸乙酯具有果香和鸢尾油香气[26];油酸乙酯散发香蕉香气。
此外,还含有少量醛类,能促进香气释放,协调各香气组分[27]。醛类总占比5.81%,各阶段含量依次为5.63、7.09、7.48、8.62、10.97 μg/kg。苯甲醛和壬醛是发酵阶段主要的两种醛类物质,但二者变化情况存在差异。苯甲醛呈特殊杏仁味和樱桃香味,在36 h时才被检测到,含量从2.03 μg/kg增加到4.96 μg/kg。壬醛能赋予愉悦的花果香、脂肪香,有报道称其为米香味的关键呈香物质[28],结合其存在于整个发酵过程,且无明显变化,推测其来自糯米原料。
烷烃类、酸类、酚类、烯烃类、内酯类、酮类及其他类挥发性风味物质含量虽低,但也是形成糯米饮料风味的重要成分。上述所有挥发性风味物质在发酵过程逐步积累,互相协同、转化,就形成了糯米饮料独特的香气风格。
2.3.2 差异挥发性风味物质的确定
如图3所示,通过正交偏最小二乘判别法(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)挖掘相邻两阶段醪醅中挥发性风味的差异。0～12、12～24、24～36、36～48 h醪醅样品在得分图上均能明显分离,各相邻两阶段模型的R2Y值和Q2值均大于0.9,依次为0.999、0.999、0.926、0.996和0.979、0.965、0.977、0.961,表明该模型稳定,拟合度和预测能力较高,能用来分析糯米饮料发酵过程的风味差异[29]。
a-0、12 h;b-12、24 h;c-24、36 h;d-36、48 h
图3 相邻两阶段挥发性风味物质OPLS-DA得分图
Fig.3 OPLS-DA score chart of volatile flavor substances in two adjacent stages
在发酵过程中共筛选出33种具有重要显著差异的挥发性风味物质(VIP>1.0,P<0.05),包括11种酯类、7种醇类、醛类6种、烷烃类2种、酸类2种、酚类2种、内酯类1种、其他类2种。如图4所示,5个阶段醪醅共聚为两大类,12 h和24 h首先发生聚类,再与0 h聚为一大类,36 h和48 h聚为另一大类;这表明0～24 h醪醅中挥发性风味具有较高相似度,并与36～48 h醪醅存在差异。醇类物质和脂肪酸乙酯随发酵进行在热图中逐渐呈红色,如乙醇、苯乙醇、苯甲醇、异戊醇、油酸乙酯、棕榈酸乙酯、乙酸苯乙酯等,表明这些物质随发酵进行成为了糯米饮料的主要风味物质。
图4 发酵过程中重要显著差异挥发性风味物质的变化
Fig.4 Changes of volatile flavor compounds with important and significant differences during fermentation
2.3.3 挥发性风味物质的OAV分析
通过计算OAV,进一步确定糯米饮料各发酵阶段的特征香气物质。当OAV≥1时,该风味物质对风味特征有重要贡献,OAV越大,贡献程度越大[30]。由表2可知,各发酵阶段共得到3种OAV≥1的特征香气物质,分别为1-辛烯-3-醇(0.54～2.06)、苯乙醇(0～3.34)和壬醛(2.48～2.86)。1-辛烯-3-醇和壬醛香气阈值较低,即使含量较低也对糯米饮料风味有重要贡献。1-辛烯-3-醇是发酵12～48 h醪醅中的特征香气物质,散发蘑菇香和蔬菜香,可能来源于糯米中亚油酸的氧化分解[31]。壬醛(花果香、脂肪香)在各发酵阶段OAV均大于1,且随发酵时间延长无明显波动。苯乙醇(玫瑰花香和茉莉花香)OAV最大,是发酵36～48 h醪醅的特征香气物质,这可能与石斛小曲中较高含量的Wickerhamomyces有关[32]。大多数酯类和醇类香气阈值较大,即使含量高,对糯米饮料风味也无明显贡献。
表2 发酵过程中特征风味物质(OAV ≥ 1)
Table 2 Characteristic flavor compounds during fermentation (OAV ≥ 1)
名称阈值/(μg·kg-1)OAV0 h12 h24 h36 h48 h1-辛烯-3-醇10.54±0.61.60±0.371.91±0.492.74±0.322.06±0.43苯乙醇3.170.00±0.000.17±0.020.86±0.022.16±0.013.34±0.01壬醛1.12.48±0.053.09±0.122.98±0.102.95±0.132.86±0.15
3 结论
本研究分析了以石斛小曲为发酵剂,糯米饮料发酵过程中理化指标、有机酸及挥发性风味物质的变化情况。结果表明,醪醅pH和淀粉含量随发酵时间延长呈显著降低的趋势(P<0.05);总酸、氨基酸态氮、还原糖和糖度则显著增加(P<0.05)。发酵期间共有7种有机酸被检测到,总含量显著增加(36.16～422.4 mg/L),主要有机酸为乳酸、琥珀酸和柠檬酸,发酵结束后新增了草酸和乙酸。5个阶段共检测出58种挥发性风味物质,以醇类和酯类为主,挥发性风味总含量随发酵时间延长显著增加(P<0.05);其中,棕榈酸乙酯、油酸乙酯和十四酸乙酯、乙醇、异戊醇和苯乙醇的含量较高;同时基于OPLS-DA确定了33种在发酵中具有重要显著差异的风味物质(VIP>1.0,P<0.05)。通过计算OAV共获得3种OAV>1的特征香气物质,即1-辛烯-3-醇、苯乙醇和壬醛。这为糯米饮料的风味研究提供参考价值,也为石斛深加工及其拓展应用提供新的研究方向。
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