婴幼儿在生长发育时期主要通过母乳或配方奶获取所需的营养,这一时期婴幼儿的身体机能迅速发展。研究普遍认为母乳喂养不仅有利于婴儿的健康成长、降低对各种疾病的易感性,还可以降低女性乳腺癌和卵巢癌的发病率[1]。中国营养学会也对母乳喂养进行了积极的宣传和指导[2]。由于多方面的因素,中国目前的纯母乳喂养率虽然在逐年增长,但仍不足40%,低于世界卫生组织50%纯母乳喂养率的全球营养目标[3]。因此,探索母乳中营养成分组成及其分布规律,研发更加具有针对性的婴儿配方食品,在特殊情况下替代母乳喂养仍然是关乎儿童健康发展的重要研究方向。
母乳中含有特定的蛋白质、脂类、维生素等,易于消化,在儿童发育的关键时期(前3个月)能提供生长发育所需的全部营养[1]。母乳中的微量营养素作为调节新陈代谢和生理作用的必需成分在婴幼儿生长发育中起到关键性作用。其中维生素A主要参与生殖、视觉发育和细胞分化,进而影响婴幼儿生长发育和免疫系统的完整性等生理过程[4],特别是对婴幼儿肺的形成至关重要,有助于肺的完全成熟和维持[5]。维生素A缺乏症是发展中国家新生儿中最常见的营养问题之一[6],尤其是对于早产儿来说,他们体内的维生素A水平明显低于足月新生儿,且在出生后的最初几周内生长代谢较高,因此对维生素A的营养需求更高[7]。
母乳中的维生素A类物质及其前体主要包括维生素A、维生素A酯及β-胡萝卜素等。β-胡萝卜素具有维生素A活性,是人体内维生素A的主要来源。维生素A酯是维生素A在人体内积累的主要形式,主要包括视黄醇棕榈酰酯、视黄醇亚油酸酯、视黄醇乙酸酯等[8]。目前,我国对不同泌乳期母乳中维生素A类物质的研究多集中在维生素A的含量变化层面[3,6,9],对母乳中类胡萝卜素的研究也多聚焦在不同分子结构的类胡萝卜素在母乳中的含量研究[10],对β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯的综合研究比较少,三者在母乳中的相关性分析以及分布变化规律尚不明确。研究方法也多采用高效液相色谱技术进行定量分析[9-10],对结合了脂肪酸的维生素A酯的研究较少。
据此,本研究收集了150份不同泌乳阶段的母乳,利用超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱(ultra-high performance liquid chromatography/quadrupole time of flight mass spectrometry,UPLC/Q-TOF-MS)检测技术定性定量分析母乳中的维生素A类物质及其前体。同时探究不同泌乳阶段下β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯的物质组成和含量分布情况,以此较为全面地展现维生素A类物质及其前体在母乳中的分布变化规律,为婴儿配方食品的生产研发提供借鉴和参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 母乳采集
母乳样品来自重庆医科大学附属第一医院产科(伦理审查批号:2020-548),由150名年龄在22～43岁的哺乳期志愿者提供。共采集到初乳样品(1～7 d)50份、过渡乳样品(8～15 d)50份、成熟乳样品(16 d以后)50份。所有哺乳期志愿者均无乳头破裂、传染性疾病、药物或毒品成瘾、抽烟酗酒等不良嗜好。收集母乳时用热毛巾温敷志愿者乳房,取20 mL样品均分为10份装入环氧乙烷灭菌的PP材质试管,然后迅速放至-80 ℃环境中贮存备用[11]。
1.1.2 试剂
维生素A(CAS:68-26-8),南京草本源生物科技有限公司;β-胡萝卜素(CAS:7235-40-7),上海源叶生物科技有限公司;视黄醇乙酸酯(CAS:127-47-9)、视黄醇棕榈酸酯(CAS:79-81-2)、乙酸铵、丙酮(HPLC)和甲醇(HPLC),Sigma-Aldrich(中国,上海);甲醇(AR),上海麦克林生化有限公司;氯仿(AR)、乙醇(AR),重庆万盛川东化工有限公司;氯化钠、无水硫酸钠,成都科隆化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
Agilent 1290 infinity Ⅱ超高效液相色谱仪,美国Agilent公司;四级杆飞行时间质谱仪(具有Bruker Compass DataAnalysis 5.1数据处理软Bruker Impact Ⅱ件),德国Bruker公司;Vortex-2涡旋混匀仪,上海沪析实业有限公司;TGL-16M台式高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;KQ5200DE数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;SHZ-Ⅱ循环水真空泵、RE-52AA旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;超DW-HL398低温冷冻储存箱,中科美菱低温科技股份有限公司;BSA124S分析天平,德国Sartorious公司。
1.3 实验方法
1.3.1 母乳中维生素A类物质及其前体的提取
采用课题组已经建立的方法[12]加以改进提取母乳中的维生素A类物质及其前体:将1 mL母乳转移至50 mL离心管中,然后按照V(母乳)∶V(甲醇)∶V(三氯甲烷)=1∶5∶10的比例分别加入甲醇与三氯甲烷,混合超声5 min,再涡旋5 min。接着将3 mL质量分数0.9%的 NaCl溶液添加到该混合物中,再次超声5 min,涡旋5 min。充分混匀后,于4 ℃下静置 5 h,然后置入高速冷冻离心机中8 000 r/min,4 ℃条件下离心5 min,分离出含有β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯的下层有机相。将上层水相中加入5 mL三氯甲烷,与上述相同步骤下复提1次。将所提取的全部有机相用无水硫酸钠进行过滤,然后在30 ℃条件下进行减压旋蒸,直至所有有机液体全部除去,最后贮存在-20 ℃环境中备用。在进行UPLC/Q-TOF-MS分析前将样品取出,用300 μL V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1的混合溶剂复溶,经尼龙滤膜(0.22 mm)过滤即可。
1.3.2 UPLC/Q-TOF-MS检测条件
利用UPLC/Q-TOF-MS对β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯进行测定,UPLC型号为Agilent 1290,并配备了自动进样系统和二极管阵列检测器(diode array detector,DAD)。分析柱为C18柱(Poroshell 120, 1.9 mm),2.1 mm×100 mm,保护柱材质相同。检测方法参考实验室已经建立的方法进行[13]。UPLC流速为0.2 mL/min,流动相A为V(甲醇)∶V(水)=8∶2,流动相B为V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1,流动相中均加入50 mmol/L 乙酸铵。采用了0～15 min,25% B～100% B;15～20 min,100% B;20～25 min,25% B的梯度洗脱程序。DAD检测器记录190～800 nm波长范围内信号,在450 nm下检测β-胡萝卜素的信号强度。
质谱利用大气压化学电离源(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)对β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯进行测定。利用正离子模式(APCI+)和负离子模式(APCI-)进行MS和MS/MS扫描。正离子模式的设定参数为:质量允许范围60～3 000 m/z,雾化气流速2 Bar,干燥气体流速8 L/min,干燥气温度220 ℃。毛细管电压4 500 V,末端平板电压500 V,裂解能量7 eV。负离子模式设置参数为:质量范围300～3 000 m/z,雾化气流速2 Bar,干燥气体流速8 L/min,干燥气温度220 ℃。毛细管电压3 500 V,末端平板电压500 V,裂解能量10 eV,通过Bruker Compass Data Analysis 5.1软件对得到的质谱数据进行进一步的分析处理。
1.3.3 定性测定
利用UPLC/Q-TOF-MS对β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯类物质进行定性分析,即通过UPLC分离人乳中的不同物质,得到对应的色谱峰。然后利用MS对未知物质进行分子质量分析,再通过标准品的信息以及MS/MS片段对相关物质的色谱峰进行定性。
1.3.4 标准曲线绘制
取经定性确定后的商用高纯度β-胡萝卜素(BR,97%)标准品10 mg,用无水乙醇溶解配制成1 000 mg/L的标准溶液,然后梯度稀释为质量浓度10～1 000 mg/L的系列标准溶液。以此标准溶液作为母乳样品中β-胡萝卜素定量的标准品。
取经定性确定后的商用高纯度维生素A(HPLC≥98%)标准品10 mg,用V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=2∶1(质量比)混合溶剂溶解配制成100 mg/L的标准溶液,然后梯度稀释为质量浓度1～100 mg/L的系列标准溶液。以此标准溶液作为母乳样品中维生素A定量的标准品。
取经定性确定后的商用高纯度视黄醇乙酸酯(AR≥98%)、视黄醇棕榈酸酯(AR≥98%)标准品1∶1(质量比)混合后,取10 mg混合标准品用V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=2∶1混合溶剂溶解配制成100 mg/L的标准溶液,然后梯度稀释为质量浓度1～100 mg/L的系列标准溶液。以此标准溶液作为母乳样品中维生素A酯类物质定量的标准品。
在UPLC/Q-TOF-MS的检测条件下,将梯度稀释后的3组标准溶液进样分析。以峰面积为横坐标,对应质量浓度(mg/L)为纵坐标绘制标准曲线,得到β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯标准溶液的回归方程和相关系数。
1.3.5 定量测定
每个母乳样品分析2次,维生素A和β-胡萝卜素分别根据各自的标准曲线进行定量测定,而对维生素A酯的定量测定则为相对定量测定,各种维生素A酯统一采用混合维生素A酯标准曲线进行定量。
1.4 数据统计分析
本研究利用Bruker Compass Data Analysis 5.1软件对β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯进行定性定量分析,运用ChemDraw 20.0软件绘制相关的物质结构式。采用GraphPad Prism 8软件对相关数据进行分析处理结合SPSS 27.0软件与OmicShare平台进行差异性分析、主成分分析、相关性分析以及聚类热图分析。
2 结果与分析
2.1 β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯定性分析
维生素A主要形式为视黄醇,其衍生物为视黄醛和视黄酸,结构如图1所示。视黄醇为不饱和一元醇,可以与脂肪酸酯化形成各种维生素A酯。维生素A酯具有较好的稳定性,目前国内外的婴儿配方食品中多通过添加视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯进行维生素A营养强化[14],但其在母乳中的组成和分布研究还比较少。β-胡萝卜素含有2个维生素A的环结构(图1),在人体体内经过酶的作用可以有调节性地转化为维生素A[15]。
图1 维生素A与β-胡萝卜素化学结构式
Fig.1 Chemical structure formula of vitamin A and β-carotene
本实验在APCI+模式下对采集到的150份母乳样品进行UPLC/Q-TOF-MS分析。通过对保留时间、液相色谱的紫外-可见光谱特征、准确的质量、质谱测量的同位素模式以及ms2基反应的产物离子特征等因素的鉴定对维生素A相关物质进行定性。表1以保留时间为顺序展示了在30 min的进样时间里3个泌乳阶段的母乳中检测出的全部14种不同维生素A类物质以及β-胡萝卜素的相关信息。其中,除检测到视黄醇、视黄酸、β-胡萝卜素外,共检测出了9种维生素A酯,包括1种中链维生素A酯(辛酸视黄醇酯)和8种长链维生素A酯(十五碳烯酸视黄醇酯、棕榈酸视黄醇酯、十七碳烯酸视黄醇酯、硬脂酸视黄醇酯、二十碳五烯酸视黄醇酯、二十二酸视黄醇酯、二十二碳烯酸视黄醇酯、二十四酸视黄醇酯)。其他学者研究也发现视黄醇的长链酰基酯是维生素A在体内的主要化学形式[16]。
表1 母乳中维生素A、维生素A酯与β-胡萝卜素组成
Table 1 Composition of vitamin A, vitamin A esters and β-carotene in breast milk
化合物保留时间/min分子式理论m/z观测离子[M+H]+观测m/z误差mSigma视黄醇3.8C20H30O286.229 7 C20H29[M-H2O+H]+269.226 50.11.0视黄酸3.6C20H28O2300.208 9C20H29O2[M+H]+301.216 90.83.4辛酸视黄醇酯 (C8∶0)6.1C28H44O2412.334 1 C28H45O2[M+H]+413.342 5-2.729.3十五碳烯酸视黄醇酯 (C15∶1)14.0C35H56O2508.428 0 C35H57O2[M+H]+509.439 9-3.634.5棕榈酸视黄醇酯 (C16∶0)13.1C36H60O2524.459 3 C36H61O2[M+H]+525.469 5-3.130.0十七碳烯酸视黄醇酯 (C17∶1)15.1C37H60O2536.459 3 C37H61O2[M+H]+537.469 1-1.611.8硬脂酸视黄醇酯 (C18∶0)14.2C38H64O2552.490 6 C38H65O2[M+H]+553.501 03.028.7二十碳五烯酸视黄醇酯 (C20∶5)15.5C40H58O2570.443 7 C40H59O2[M+H]+571.448 93.638.4二十二酸视黄醇酯 (C22∶0)14.6C42H72O2608.553 2 C42H73O2[M+H]+609.564 54.039.4二十二碳烯酸视黄醇酯 (C22∶1)15.3C42H70O2606.537 6 C42H71O2[M+H]+607.548 3-3.840.1二十四酸视黄醇酯 (C24∶0)15.8C44H76O2636.584 5 C44H77O2[M+H]+637.594 7-4.540.7β-胡萝卜素17.1C40H56537.445 5C40H57[M+H]+537.447 4-0.318.89
2.2 β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯定量分析
2.2.1 不同泌乳阶段的β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯
根据信噪比(S/N)为3确定检出限(limits of detection,LOD)以及信噪比(S/N)为10确定定量限(limits of quantification,LOQ)。经UPLC/Q-TOF-MS分析后得到β-胡萝卜素的标准曲线为y=62.938x+359.57,其中y为质量浓度(mg/L),x为峰面积,线性相关系数为R2=0.997。维生素A的标准曲线为y=2-5x-0.000 001 7,其中y为物质的质量浓度(mg/L),x为峰面积,线性相关系数为R2=0.996。混合维生素A酯的标准曲线为y=3-5x-0.000 008 9,其中y为物质的质量浓度(mg/L),x为峰面积,线性相关系数为R2=0.997。
根据标准曲线分别进行定量分析后,得到不同泌乳阶段的β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯含量如图2所示。由图2可知,初乳中β-胡萝卜素平均含量最高,随着泌乳周期的延长,母乳中的β-胡萝卜素逐渐减少,从初乳中的82.92 mg/L下降至过渡乳中的35.32 mg/L(初乳的42.6%),进一步下降至成熟乳中的29.19 mg/L(初乳的35.2%)。采用SPSS 27.0对不同泌乳时期的β-胡萝卜素进行单因素方差分析,结果表明在95%的置信度下不同泌乳阶段的β-胡萝卜素含量具有显著差异(P<0.05)。采用Duncan法结合LSD法多重比较分析组间差异,得到初乳与过渡乳间的β-胡萝卜素含量存在极显著差异(P<0.01),初乳与成熟乳间的β-胡萝卜素含量也存在极显著差异(P<0.01),而过渡乳和成熟乳间的β-胡萝卜素含量差异并不显著。这一发现与其他研究者的研究结果一致[17],β-胡萝卜素在3个阶段的母乳中含量逐渐下降,且在初乳到过渡乳阶段下降幅度最大。
图2 不同泌乳期母乳中的β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯含量
Fig.2 Contents of β-carotene, vitamin A, and vitamin A ester in breast milk during different lactation periods
图2表明母乳中维生素A的平均含量随着泌乳周期的延长呈现逐渐下降的趋势,从初乳中的681.66 mg/L下降至过渡乳中的498.67 mg/L,然后下降至成熟乳中的305.82 mg/L。采用SPSS 27.0对不同泌乳时期的维生素A进行单因素方差分析,结果表明,在95%的置信度下不同泌乳阶段的维生素A含量具有显著差异(P<0.05)。采用Duncan法结合LSD法多重比较分析组间差异,得到初乳与成熟乳间的维生素A含量存在极显著差异(P<0.01),初乳与过渡乳间的维生素A含量差异不显著,过渡乳和成熟乳间的维生素A含量差异也并不显著。其他研究者也得到了相似的结论[9],说明随着泌乳期的延长,母乳中维生素A含量逐步下降,且下降趋势较为稳定。
研究发现,母乳中的维生素A酯含量较少,部分母乳中甚至没有检测到维生素A酯的存在。初乳中维生素A酯平均含量为114.60 mg/L,过渡乳中维生素A酯平均含量为159.10 mg/L,成熟乳中维生素A酯平均含量为129.04 mg/L。采用SPSS 27.0对不同泌乳时期的维生素A酯进行单因素方差分析,结果表明,在 95%的置信度下不同泌乳阶段的维生素A酯含量并不具有显著差异,这说明不同泌乳阶段下母乳中的维生素A酯含量较为稳定。母乳中的脂质主要由甘油三酯、磷脂以及其他低丰度脂组成,其中甘油三酯含量越占脂质总量的98%～99%[18]。由此可见母乳中的脂肪酸大多以游离形式或甘油三酯形式存在,仅存在少量脂肪酸能够与维生素A结合形成维生素A酯。
母乳中的维生素A类物质的含量受多重因素的影响,包括产妇的饮食情况、健康情况、生活状态、泌乳阶段、乳样采集方法等[6]。因此,由图2可知母乳中各组分含量具有很大的个体差异,泌乳初期的母乳中含有大量的β-胡萝卜素和维生素A,随着泌乳期延长均逐渐减少,这可能是因为在婴儿发育初期需要摄入较高水平的维生素A类物质以供生长发育以及肝脏储积[19]。而且母亲在分娩后初期普遍会加强营养摄入,食物种类以肉、禽、蛋等高脂高蛋白食物为主,这也会对母乳中维生素A类物质的含量产生一定的影响[20]。
2.2.2 三个泌乳阶段母乳中维生素A酯的类型分布
维生素A酯的形成和水解是脂溶性微量营养素维生素A代谢的关键过程。不同泌乳期的母乳中维生素A酯的含量大致相似,但组成成分有所不同。如图3所示,通过UPLC/Q-TOF-MS在3个阶段的母乳中共检测到9种维生素A酯。其中初乳中检测到了5种维生素A酯,棕榈酸视黄醇酯(C16∶0)和二十四酸视黄醇酯(C24∶0)的含量相对较高。过渡乳中检测到了8种维生素A酯,十五碳烯酸视黄醇酯(C15∶1)、硬脂酸视黄醇酯(C18∶0)和二十四酸视黄醇酯(C24∶0)的含量相对较高。成熟乳中检测到了5种维生素A酯,棕榈酸视黄醇酯(C16∶0)和二十四酸视黄醇酯(C24∶0)的含量相对较高。3个泌乳阶段均检测到了棕榈酸视黄醇酯(C16∶0)、十七碳烯酸视黄醇酯(C17∶1)、硬脂酸视黄醇酯(C18∶0)、二十四酸视黄醇酯(C24∶0)。HARRISON[16]研究发现,在维生素A含量充足的情况下,人体内的视黄醇酯形式主要为棕榈酸视黄醇酯和硬脂酸视黄醇酯。而母乳中除了这2种维生素A酯含量较高外,发现二十四酸视黄醇酯(C24∶0)是整个泌乳阶段中含量最高的维生素A酯,这说明母乳中视黄醇酯存在形式可能与人体内略有差异,以此满足婴幼儿生长初期的特殊营养需要。
图3 不同泌乳期母乳中的不同结构维生素A酯含量分布
Fig.3 Distribution of different structural vitamin A esters in breast milk during different lactation periods
母乳中的常量脂肪酸包括油酸、亚油酸、棕榈酸,它们约占母乳脂肪酸总量的70%左右[21]。但是研究在母乳中仅发现了部分棕榈酸视黄醇酯(C16∶0)及硬脂酸视黄醇酯(C18∶0),并未发现油酸视黄醇酯(C18∶1)与亚油酸视黄醇酯(C18∶2)。本课题组在进行胆固醇酯组成分布时也观察到相似情况,母乳中含量较高的常量脂肪酸组分相对应的胆固醇酯含量并不高[12]。这可能是因为在婴幼儿生长发育初期,身体器官快速发育,需要大量能量供给。因此母乳中的大部分脂肪酸会选择性结合甘油sn-2位的羟基,这种分布位点有利于婴儿吸收利用,更好地提供能量以供生长发育[22]。
母乳中的维生素A酯以及甘油酯的脂肪酸组成可以在一定程度上影响母乳的营养成分和理化性质。采用SPSS 27.0对不同阶段母乳中的9种维生素A酯含量进行主成分分析。首先标准化(Z-score法)处理原始数据,通过KOM检验法和Bartlett球体检验法进行因子分析的实用性检验。得到KOM值为0.779(≥0.6),Bartlett球体检验值为576.505,Sig值<0.001,说明主成分分析适用于研究母乳中的维生素A酯分布。由表2可知,提取前2个成分可以解释全部维生素A酯的87.384%,因此提取这2个主成分分别记为Y1和Y2以反映母乳中各种维生素A酯对主成分载荷的相对大小和影响的方向。根据Y1和Y2主成分方程计算出主成分得分和以各个主成分方差贡献率占2个主成分总方差贡献率的比率为权重计算得到的综合得分。表3得到的主成分得分及综合得分可以看出主成分Y1得分较高的维生素A酯为二十四酸视黄醇酯(C24∶0)和十五碳烯酸视黄醇酯(C15∶1),主成分Y2得分较高的维生素A酯为棕榈酸视黄醇酯(C16∶0)。
表2 主成分分析结果
Table 2 Results of principal component analysis
成分初始特征值提取载荷平方和总计方差百分比累积百分比/%总计方差百分比累积百分比/%13 911.09165.10265.1023 911.09165.10265.10221 338.62022.28287.3841 338.62022.28287.3843478.4417.96495.3484142.0742.36597.712588.2461.46999.181644.8780.74799.92873.4080.05799.98580.8690.014100.00090.0250.000100.000
表3 主成分得分及综合得分
Table 3 Principal component score and composite score
成分主成分Y1得分主成分Y2得分综合得分排名十五碳烯酸视黄醇酯 (C15∶1)0.9420.1350.6431二十四酸视黄醇酯 (C24∶0)0.9300.0360.6133二十二碳烯酸视黄醇酯 (C22∶1)0.881-0.2150.5265辛酸视黄醇酯 (C8∶0)0.880-0.2110.5274二十二酸视黄醇酯 (C22∶0)0.871-0.1930.5246硬脂酸视黄醇酯 (C18∶0)0.8080.4250.6212二十碳五烯酸视黄醇酯 (C20∶5)-0.743-0.466-0.5889十七碳烯酸视黄醇酯 (C17∶1)0.726-0.2920.4087棕榈酸视黄醇酯 (C16∶0)-0.2960.9460.0188
2.3 相关性分析
2.3.1 β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯的相关性分析
维生素A原类胡萝卜素是人体摄入维生素A的重要途径,其中β-胡萝卜素占86%,是最主要的维生素A前体物质[23]。β-胡萝卜素在可溶性胞质酶BCMO1的作用下分解代谢形成视黄醛,然后在视黄醛脱氢酶的作用下转化为视黄醇(维生素A),未被人体吸收利用的维生素A会以脂肪酸酯的形式贮存在肝星状细胞中[24]。视黄酸可以通过负反馈机制调节β-胡萝卜素的转化效率,从而控制人体内维生素A水平。因此可知三者之间具有一定的相关性,通过SPSS 27.0软件对母乳中三者的含量进行相关性分析,结果见表4。
表4 母乳中β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯与相关性分析
Table 4 Analysis of the correlation between vitamin A, vitamin A esters, and β-carotene in breast milk
β-胡萝卜素维生素A维生素A酯皮尔逊相关性10.416a0.096β-胡萝卜素显著性(双尾)<0.0010.421个案数150150150皮尔逊相关性0.416a1-0.029维生素A显著性(双尾)<0.0010.806个案数150150150皮尔逊相关性0.096-0.0291维生素A酯显著性(双尾)0.4210.806个案数150150150
注:a表示在0.01级别(双尾)相关性显著
由表4可知,母乳中β-胡萝卜素与维生素A之间显著性概率值<0.001,说明二者在母乳中的含量变化具有显著相关性;皮尔逊相关系数为0.416,说明二者存在较弱的正相关关系。可见在母乳中β-胡萝卜素可以转化为维生素A,且转化情况受到负反馈机制动态调节影响,并不是单纯的线性转化关系。而维生素A酯与β-胡萝卜素和维生素A之间均不具有相关性(显著性>0.05),说明β-胡萝卜素和维生素A并不是调节维生素A酯含量的主要因素。维生素A酯的含量变化受到饮食状况、维生素A水平、脂质水平、视黄醇酯水解酶等多种因素的影响,由于维生素A酯是维生素A在体内的主要贮存形式,因此其含量也会受生长发育情况动态调节,所以在3个母乳阶段均处于一个相对稳定的状态,并不会在单一条件的影响下产生显著变化[25]。
2.3.2 各维生素A酯间的相关性分析
将不同泌乳阶段下母乳中的各维生素A酯含量进行Z-score归一化处理后,采用Pearson相关系数进行聚类热图分析,分析结果如图4所示。母乳中的九类维生素A酯呈现出一定的聚类性,可以划分为两类。一类为棕榈酸视黄醇酯(C16∶0)和二十碳五烯酸视黄醇酯(C20∶5),它们与其他7种维生素A酯大多无相关性,或呈负相关。另一类为剩下的7种维生素A酯,它们相互之间均呈显著的正相关,其中辛酸视黄醇酯(C8∶0)、二十二酸视黄醇酯(C22∶0)、二十二碳烯酸视黄醇酯(C22∶1)两两之间的代谢关联性最强,呈十分显著正相关(P≤0.001),且具有极强的相关性(皮尔逊相关系数为0.91)。这说明在不同的泌乳阶段下三者含量变化影响因素以及影响程度基本一致,但具体的内在关联性还需要进行更为深入的代谢组学研究。
图4 九种维生素A酯的聚类热图分析
Fig.4 Cluster heat map analysis of nine vitamin A esters
3 讨论与结论
本研究利用UPLC/Q-TOF-MS检测技术定性定量分析不同泌乳阶段的母乳中β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯类物质。在3个阶段的母乳中共发现9种维生素A酯,其中初乳中检测到了5种,过渡乳中检测到了8种,成熟乳中检测到了5种。通过质谱分析发现这9种维生素A酯中只有1种中链维生素A酯,其余8种都是长链维生素A酯,这说明长链视黄醇酯是维生素A酯在母乳内的主要化学形式。通过定量分析发现母乳中含量较高的维生素A酯为棕榈酸视黄醇酯(C16∶0)、硬脂酸视黄醇酯(C18∶0)和二十四酸视黄醇酯(C24∶0),其中二十四酸视黄醇酯(C24∶0)是整个泌乳阶段中含量最高的维生素A酯,说明母乳中视黄醇酯存在形式具有独特性,以此满足婴幼儿生长初期的特殊营养需要。
利用SPSS 27.0分别对3个泌乳阶段的母乳中β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯含量进行差异性分析,发现在95%的置信度下不同泌乳阶段的β-胡萝卜素和维生素A含量均具有显著差异(P<0.05),且随着泌乳期的延长逐渐减少,而维生素A酯在3个泌乳阶段间不具有显著差异,说明随着泌乳期的延长维生素A酯含量较为稳定。对三者间含量进行相关性分析,发现β-胡萝卜素与维生素A含量变化呈现正相关关系(皮尔逊相关系数为0.416),维生素A酯含量与另外2种物质并不具有相关性。以此推测母乳中β-胡萝卜素与维生素A含量变化受到负反馈机制动态调节影响,而维生素A酯含量受多种因素影响,并不会在单一条件的影响下产生显著变化。对9种维生素A酯进行主成分分析提取出2个主成分可以解释全部维生素A酯的87.384%,聚类热图分析也发现母乳中的维生素A酯可以大致分为两类,其中7种维生素A酯间呈显著的正相关,另外2种与它们大多无相关性,或呈负相关。本项研究主要分析了不同泌乳阶段的母乳中β-胡萝卜素、维生素A及维生素A酯含量变化以及相互关系,为婴幼儿配方食品的配方研发提供借鉴与参考。同时,母乳中不同维生素A酯之间表现出一定的相关性,但它们的关联性依据及影响因素还需要进一步研究。
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