环糊精(cyclodextrin, CD)是一种由环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase, CGTase)以淀粉为底物合成的环状低聚糖[1],一般由6～8个吡喃葡萄糖单元构成,根据糖单元数量可分为α-环糊精(6)、β-环糊精(7)及γ-环糊精(8)。环糊精具有内部疏水及外部亲水的空腔结构,可以和客体分子形成包合物进而增加其溶解性或稳定性[2]。因此环糊精被广泛应用于制药、化妆品、食品、纺织、污水处理等领域[3]。在3种环糊精中,α-环糊精水溶性高且具有抗消化酶水解特性,因此还可以作为可溶性膳食纤维促进肠道蠕动、调节肠道菌群。然而制备α-环糊精时合成和降解同时存在限制了产量的进一步提升,甚至存在明显的产量下降趋势[4],这些问题导致α-环糊精价格昂贵。因此提高α-环糊精产量是一项极有意义的研究。

CGTase的分子改造是一种提高α-环糊精产量的方法[3]。CGTase属于α-淀粉酶家族[5],含有5个结构域[4]。催化中心由TIM(α/β)8结构组成,存在9个糖分子结合位点(-7～+2亚位点)用于结合供体分子及受体分子[4]。根据受体分子的不同,CGTase催化的反应被分为环化反应、歧化反应、偶联反应及水解反应[6]。环化反应是CGTase生产环糊精的关键反应。然而由于存在多个底物结合亚位点,CGTase的环化产物是3种环糊精的混合物[4, 7]。部分来源的CGTase在合成α-环糊精上占据一定的优势,如Klebsiella pneumoniae M5a1 CGTase的环化产物中α-环糊精质量分数为73%,Thermococcus sp. B1001 CGTase的环化产物中α-环糊精质量分数为51%[4],Paenibacillus sp. 602-1 CGTase的环化产物中α-环糊精质量分数为83%[8]。但是它们对底物的利用率均较低[4]。

此外,有研究报道指出了底物结合亚位点附近的氨基酸残基位点对CGTase催化反应的影响,如-7亚位点主要影响环化反应特异性[4,7,9],-3亚位点影响环化活性[10],+1/+2亚位点主要影响受体分子的结合[6,11]等。近些年,一些研究者展示了定向进化或定点突变改造CGTase,从而提高α-环糊精占比的相关报道[3]。如LI等[12]构建Paenibacillus macerans JFB05-01 CGTase突变体D372K/Y89R的产物中α-环糊精占比提高23.2%,WANG等[13]构建Paenibacillus macerans JFB05-01的突变体Y89D的产物中α-环糊精占比提高7.6%,CHAO等[14]构建Bacillus sp.602-1 CGTase的突变体Y167H/V536A产物中α-环糊精占比提高5.4%,WANG等[9]构建Paenibacillus macerans JFB05-01 CGTase突变体R146P/D147A的产物中α-环糊精占比提高12.9%。

本研究选择了表达水平较高[15]、总转化率较高且稳定性较好[4]的B.stearothermophilus NO2 CGTase进行研究。参照之前的研究成果[7,11],本研究在CGTase的-7亚位点构建突变体E142P以提高CGTase的α-环糊精合成特异性,+1/+2亚位点构建突变体L277M、L277F及N353A以提高转糖苷反应特异性。最终,通过检测它们的转化产物,E142P/L277M是最优的生产α-环糊精的突变体,其产量为10.15 g/L,较野生型提高1.7 g/L,并且α-环糊精占比较野生型提高14.3%。本研究为α-环糊精的工业化提供了新的思路,具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂、菌株及质粒

酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、甲基橙、酚酞、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、咪唑、3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、α-环糊精、β-环糊精等,上海国药生物科技有限公司;2×Phanta Max Master Mix,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;Dpn I,大连TaKaRa生物科技有限公司。

Escherichia coli JM109作为重组DNA操作的宿主菌。E.coli BL21作为CGTase表达的宿主菌。pET20b(+)/cgtase质粒参照TAO等[15]构建。

1.2 CGTase突变体质粒构建

使用pET20b(+)/cgtase作为模板质粒,使用表1中的引物1～4构建突变体L277M及L277F的质粒。

使用pET20b(+)/L277M及pET20b(-)/L277F作为模板质粒,使用表1中的引物5～8构建突变体E142P/L277M、E142P/L277F、L277M/N353A及L277F/N353A的质粒。同时,所有质粒在目的基因的C端均含有His-tag标签,可用于蛋白纯化。在PCR仪中进行扩增后,产物使用Dpn I处理。最终转化到E.coli JM109,提取质粒并测序。测序正确的质粒转化到E.coli BL21(DE3)中用于后续目标蛋白的表达。

1.3 CGTase野生型及突变体的表达

将构建好的E.coli BL21(DE3)挑至LB(Luria-Bertani)液体培养基(含100 μg/mL的卡那抗生素)中,37 ℃、200 r/min条件下培养10 h作为种子液。按照体积分数5%的转接量将种子液转接至TB(Terrific-Broth)培养基(含100 μg/mL的卡那抗生素)中,37 ℃、200 r/min条件下培养2 h后调至25 ℃继续培养48 h后终止发酵培养。将获得的发酵液于8 000 r/min离心20 min后取上清液获得粗酶液。

1.4 CGTase的酶活力测定

1.4.1 CGTase环化反应活性检测

1.4.1.1 CGTase生成α-环糊精的酶活力检测条件

反应条件为50 ℃及25 mmol/L、pH 5.5的磷酸盐缓冲液。酶反应体系包括2 mL上述缓冲液配制的1%可溶性淀粉及0.1 mL的适量稀释的酶液。精确反应10 min后加入0.2 mL的3 mol/L HCl溶液终止反应,之后加入0.2 mL的0.44 mmol/L甲基橙溶液进行显色。生成的α-环糊精能够包埋甲基橙,使溶液在505 nm的吸光值降低,依照此制作标准曲线并计算α-环糊精的产量。α-环化反应酶活力定义为在上述反应条件下1 min内催化可溶性淀粉生成1 μmol α-环糊精所需要的酶量为1 U。

1.4.1.2 CGTase生成β-环糊精的酶活力检测条件

反应条件为50 ℃及25 mmol/L、pH 5.5的磷酸盐缓冲液。酶反应体系包括2 mL上述缓冲液配制的1%可溶性淀粉及0.1 mL的适量稀释的酶液。精确反应10 min后加入0.2 mL的0.6 mol/L HCl溶液终止反应,之后加入0.5 mL的0.6 mol/L的Na2CO3溶液并加入0.2 mL的1.2 mmol/L酚酞溶液显色。生成的β-环糊精能够包埋酚酞,使溶液在550 nm的吸光值降低,依照此制作标准曲线并计算β-环糊精的产量。β-环化反应酶活力定义为在上述反应条件下1 min内催化可溶性淀粉生成1 μmol β-环糊精所需的酶量为1 U。

1.4.2 CGTase水解反应活性检测

水解反应酶活力主要指CGTase降解可溶性淀粉生成小分子糖的能力。反应条件为50 ℃及50 mmol/L、pH 5.5的磷酸盐缓冲液。酶反应体系包括1 mL上述缓冲液配制的1%可溶性淀粉、0.9 mL上述缓冲液及0.1 mL适量稀释的酶液。精确反应10 min后加入3 mL DNS溶液终止反应,使用去离子水定容至15 mL。CGTase水解可溶性淀粉生成的小分子糖均为还原糖,能够与DNS反应并显色,依照此制作标准曲线并计算小分子糖的产量,最终检测540 nm的吸光值确定小分子糖的生成量。水解反应酶活力定义:在上述反应条件下1 min内催化可溶性淀粉生成1 μmol麦芽糖当量所需的酶量为1 U。

1.5 α-环糊精的制备

在50 ℃及50 mmol/L、pH 5.5的磷酸盐缓冲液条件下进行CGTase的催化反应制备α-环糊精。使用上述缓冲液配制5%可溶性淀粉作为底物,按照1 g底物5 U环化反应活性的加酶量添加CGTase,反应24 h并固定时间点取样。取样后煮沸灭活用于检测。

1.6 HPLC检测环糊精方法

使用HPLC检测环糊精产量,色谱柱使用Aps-2 Hypersil(4.6 mm×250 mm),柱温40 ℃,流动相为体积分数75%的乙腈,流速0.8 mL/min,检测器为2414型(示差折光检测器)。分别使用2、10、2 g/L的α-环糊精、β-环糊精及γ-环糊精作为标准品。按照1∶1的体积比添加乙腈至样品中沉淀1 h后于12 000 r/min、2 min离心去除大分子底物,用0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后即可使用。

1.7 分子动力学(molecular dynamics, MD)结构模拟分析

以野生型B.stearothermophilus NO2 CGTase(PDB ID:1CYG)的三维结构作为模板,利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)[16]模拟突变体E142P/L277M及L277M/N353A的三维结构。利用Amber18进行MD模拟,分别采用ff14SB(蛋白残基)以及TIP3P(水分子)力场,在300 K的温度下模拟10 ns。得到的轨迹利用AMBER18的capptraj分析其均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)、均方根波动(root mean square fluctuation,RMSF)、关键氨基酸残基Cα距离、回旋半径(radius of gyration, Rg)及溶剂可及表面积(solvent accessible surface area, SASA)。

2 结果与分析

2.1 突变体质粒的构建及异源表达

参照KONG等[11]对CGTase的Leu277位点转苷水解反应的研究结果,因其具有提高歧化反应并降低水解反应的作用,本文研究L277M及L277F突变体对α-环糊精产量的影响。同时,参照ZUO等[7]对α-环糊精产量的研究,在L277M及L277F突变体的基础上组合E142P及N353A突变体进行研究。

使用E.coli JM109作为宿主,构建突变体L277M、L277F、E142P/L277M、E142P/L277F、L277M/N353A及L277F/N353A的质粒。使用E.coli BL21(DE3)作为表达宿主表达上述突变体。野生型及相关突变体CGTase的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析如图1所示,均在60 kDa附近有可溶性条带。环化反应活力检测如表2所示,所有突变体的环化反应活力均比野生型低。此外,突变体E142P/L277M及E142P/L277F的α/β值分别提高至野生型的2.52及2.07倍,说明这2个突变体的环化反应特异性向合成α-CD方向偏移。此外,由于Leu277及Gln353位点相关突变体对CGTase水解反应的抑制,所有突变体的水解反应活力均低于野生型,其中L277M/N353A及L277F/N353A组合突变体的水解活力不足野生型的50%。

2.2 L277M及L277F突变体制备α-环糊精的应用

为了确定单突变体对环糊精产量的影响,使用5%可溶性淀粉作为底物进行酶转化反应。L277M、L277F催化生成α-环糊精的最高产量分别为8.97和8.39 g/L(图3),相较于野生型(8.45 g/L,图2)均无明显增加。同时,2种突变体在α-环糊精占比方面也未体现出明显的优势,均为35%左右,较野生型下降3%(表3)。参照KONG等[11]对Leu277相关突变体的分析,该位点影响受体亚位点附近的疏水性以及提高受体底物的亲和力。根据之前的CGTase突变体的相关研究[4]:影响环糊精比例的氨基酸残基位点位于供体位点,特别是—7亚位点。因此,L277M及L277F突变体可能并不能明显提高α-环糊精的产量及占比。但是,由于2个突变体均降低了水解反应(表2),这导致反应体系中小分子糖的减少,从而能够降低α-环糊精的降解。虽然单突变体L277M及L277F能够减弱α-环糊精的降解,但由于其并未从根本改变α-环糊精的产量,因此并不能展现其优势,进而导致突变体的α-环糊精产量及占比与野生型相当。

2.3 E142P/L277M及E142P/L277F制备α-环糊精的应用

为了更好地利用L277M及L277F降低水解反应的优势,本研究引入了突变体E142P。该位点能够有效地提高产物中α-环糊精的占比(比野生型高9.65%[7]),但在反应后期存在严重的α-环糊精降解现象[4,7,9]。酶转化结果显示(图4),E142P/L277M最高催化产生了10.15 g/L的α-环糊精,而E142P/L277F最高催化产生了9.63 g/L的α-环糊精。相较于野生型,两者的产量均有提高。同时,对比ZUO等[7]报道的E142P最高催化产生约9.4 g/L的α-环糊精,该研究中的双突变体的α-环糊精产量出现了小幅的提升。同时,相较于E142P突变体,E142P/L277M及E142P/L277F在催化反应后期较为稳定,α-环糊精未出现显著的降解,这可能是由于Leu277突变体降低了水解的作用。

2.4 L277M/N353A及L277F/N353A制备α-环糊精的应用

为了进一步降低CGTase的水解反应,本研究引入了突变体N353A。该位点同样能够有效降低CGTase的水解反应,约为野生型的21.3%[7]。将其与L277M或L277F组合,尝试以组合突变体制备α-环糊精。结果如图5所示,L277M/N353A及L277F/N353A最高催化产生α-环糊精分别为7.12及8.21 g/L,较野生型更低。同时α-环糊精占比也比野生型更低(表3)。这可能是由于Asn353和Leu277在空间结构上距离较近,同时突变2个氨基酸残基位点时,该处存在的疏水簇结构[11]或电荷平衡[7]可能遭到破坏,导致CGTase的结构较野生型更不稳定。

2.5 MD结构模拟分析

为解析突变体E142P/L277M的优势所在以及L277M/N353A转化率降低的原因,本研究使用MD结构模拟分析了野生型及2个突变体在10 ns内的轨迹变化。RMSD结果如图6-a所示,3个结构在10 ns内均达到平衡状态,其中L277M/N353A较其他2种结构更晚达到平衡。RMSF结果如图6-b所示,L277M/N353A的RMSF在300位氨基酸残基附近波动较大。此外,图6-c显示2个突变体中L277与N353之间的Cα距离高于野生型。上述结果表明L277M/N353A结构波动更大。针对L277及N353所在疏水簇[11]分析SASA,结果如图6-d所示,L277M/N353A的SASA明显增大,这可能是因为双突变体破坏了疏水簇结构所致。此外,L277位点突变后自旋半径增大(图6-e),这与甲硫氨酸(M)侧链长度增大有关;N353位点突变后自旋半径降低,这与丙氨酸(A)侧链长度降低有关。MD结果说明E142P/L277M突变体由于突变位点相互影响并不大,因此对α-环糊精的转化产生了正向效应。与之相反,L277M/N353A突变体由于突变位点均位于疏水簇,对该区域影响较大,导致酶催化活力降低,因此对α-环糊精的转化产生了负向效应。

3 结论

本研究从降低CGTase水解反应及提高环化反应活力对其进行分子改造。L277M、L277F及N353A突变体虽然降低了CGTase的水解反应活力,但其本身对α-环糊精的特异性生产无明显影响。L277M/N353A及L277F/N353A则导致CGTase的α/β值明显降低,因此α-环糊精转化率明显降低。最终的优势突变体为E142P/L277M,在24 h内最高催化生成了10.15 g/L的α-环糊精,较野生型α-环糊精产量提高1.7 g/L。此外突变体E142P/L277M生成的α-环糊精占比较野生型提高14.3%。整体而言,该研究为α-环糊精的生产应用提供了新的思路。

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Improvement of α-cyclodextrin yield by mutants of Leu277 about CGTase from Bacillus stearothermophilus NO2

KONG Demin1,2, ZUO Fangyuan1,2, WU Jing1,2, WANG Lei1,2*

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACT Cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase) can convert starch to cyclodextrins, including α-cyclodextrin (α-CD), β-cyclodextrin (β-CD) and γ-cyclodextrins (γ-CD). Among these cyclodextrins, α-CD has characteristics of low yield and easy degradation. In this study, a CGTase derived from Bacillus stearothermophilus NO2 was selected and the α-CD producing ability of its mutants, including E142P, L277M, L277F, E142P/L277M, E142P/L277F, L277M/N353A, and L277F/N353A, were measured using soluble starch as substrate. Compared with the wild-type, the optimal mutant E142P/L277M increased the yield of α-CD by 1.7 g/L and the proportion of α-CD in the product increased by 14.3%. Molecular dynamics (MD) simulation results showed that the influence between the sites of E142 and L277 in E142P/L277M mutant was slight. In addition, the catalytic effect of L277M/N353A was poor, and MD results showed that the overall structure of L277M/N353A was changed greatly and its SASA was increased, which were not conducive to the occurrence of transglycoside reaction. This paper provides a new idea for the molecular modification of CGTase to improve the activity of cyclization reaction and increase the yield of CGTase in the industrial production of α-CD.

Key words cyclodextrin glucosyltransferase; soluble starch; α-cyclodextrin; site-directed mutation; cyclization reaction

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034278

引用格式：孔德民,左方圆,吴敬,等.Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶Leu277突变提高α-环糊精产量[J].食品与发酵工业,2023,49(15):1-7.KONG Demin, ZUO Fangyuan, WU Jing, et al.Improvement of α-cyclodextrin yield by mutants of Leu277 about CGTase from Bacillus stearothermophilus NO2[J].Food and Fermentation Industries,2023,49(15):1-7.

第一作者：博士研究生(王蕾助理研究员为通信作者,E-mail:wangleijs@163.com)

基金项目：国家自然科学基金重点项目(31730067);江苏省自然科学基金面上项目(BK20221536);江苏省研究生科研与实践创新计划项目(KYCX21-2025)

收稿日期：2022-11-11,改回日期:2022-12-12