黑果枸杞是我国传统的具有补益功能的名贵中藏药材,是青海、新疆、甘肃等省的重要经济作物,是当地农民增收的重要途径。黑果枸杞富含花青素、原花青素、多糖和微量元素,是花青素含量最高的浆果之一,有“花青素之王”的美誉[1],而花青素是最有效的天然自由基清除剂,易溶于水。此外黑果枸杞还具有一定的保健功能,如:抗氧化、抗疲劳、护肝和提高免疫力等[2-3]。
近年来,随着全国种植热潮的兴起和人工培育技术的发展,黑果枸杞种植面积和产量逐年增加,但价格逐渐下跌,影响了农民种植的积极性和产业健康发展。造成这一问题的主要原因可能是黑果枸杞加工链条短,以果干等初加工产品为主。目前科研人员已经进行了一些深加工的探索,如:开发黑果枸杞口服液、饼干、果酒、果醋和酸奶等[4-5],黑果枸杞深加工产品种类和产量逐渐增加,其中乳酸菌发酵产品受到人们的关注,原因主要是发酵过程产酸,而花青素在pH<4时结构较稳定[6],所以乳酸菌发酵是提高花青素稳定性的有效途径之一。目前已有黑果枸杞在果蔬饮料[7]中应用的相关报道,其中黑果枸杞主要起到调节色泽的作用,有研究人员制备了黑果枸杞发酵饮料,发酵后花青素含量显著增加[8]。但是饮料生产涉及灌装、杀菌和储藏等环节,过程中氧气、光照和温度等因素可能对花青素和原花青素含量造成不利影响。目前这方面未受到研究人员的重视,也未见如何避免黑果枸杞果汁加工及储藏过程中花青素和原花青素损失的报道。
干酪乳杆菌是多种果蔬的自生菌,具有良好的耐酸性,可在pH 3.5左右生存,被广泛用于食品发酵[9],其代谢产物(细菌素、生物活性多肽和短链脂肪酸等)可起到促进肠道蠕动,提高肠道功能的作用[10],并且发酵产生乳酸,使饮料具有柔和的酸味,提高产品风味品质,是黑果枸杞发酵的理想菌株。在MRS培养基中干酪乳杆菌增长速度快,由于其成本较高,且容易影响饮料风味,不宜用作扩培培养基,所以需要开发以食品原料为基础的菌种扩培培养基。本研究以黑果枸杞为原料,以干酪乳杆菌为发酵菌株,以减少花青素和原花青素在加工过程中的损失率为主要目标,重点对酶解条件、扩培培养基、发酵条件和杀菌条件进行优化,以期得到花青素和原花青素保留率高,口感好的黑果枸杞乳酸菌发酵饮料生产工艺,为黑果枸杞产品开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑果枸杞,北京同仁堂健康药业(青海)有限公司提供;干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)MYT,江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心(RWBL)保藏;NaOH、冰醋酸、酒石酸钾钠、苯酚、Na2SO3、盐酸、无水乙醇、无水乙酸钠、丙酮,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;原花青素(色谱纯),合肥博美生物科技有限责任公司;4-二甲氨基肉桂醛(色谱纯),上海源叶生物科技有限公司,果胶酶(300 000 U/g)、纤维素酶(200 000 U/g)、无水葡萄糖,睢县优宝嘉食品有限公司;安佳脱脂乳粉,新西兰恒天然集团。
1.2 仪器与设备
UV-1800PC型紫外-可见光分光光度仪,上海美谱达仪器有限公司;MAX-190型酶标仪,美国分子仪器公司;Vortex-2型涡流器,美国科学仪器公司;CF16XR-Ⅱ型离心机,日本日立公司;IS-3型pH计,上海康仪仪器有限公司;BS-224S型分析天平,赛多利斯仪器设备制造有限公司;JPBJ-611Y型便携式溶解氧测定仪,上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 培养基
MRS培养基(g/L):蛋白胨10,牛肉浸粉8,酵母浸粉4,葡萄糖20,K2HPO4 2,柠檬酸氢二铵2,乙酸钠5,MgSO4 0.2,MnSO4 0.04,吐温-80 1.0,pH 5.5～5.9,118 ℃灭菌15 min,固体培养基添加琼脂15。
扩培培养基(g/L):脱脂乳粉30,葡萄糖70,黑果枸杞汁80,调节pH 5.5～5.9,118 ℃灭菌15 min,其中黑果枸杞汁由枸杞干果1∶8(g∶mL)充分复水打浆制得。
1.4 实验方法
1.4.1 工艺流程
工艺流程如图1所示。
图1 黑果枸杞乳酸菌发酵饮料制作流程
Fig.1 Producing procedure of L.ruthenicum fermentation beverage
操作要点:
前处理:剔除坏果、杂质,选取色泽饱满、无机械损伤的干枸杞,并清洗,90 ℃热烫5 s,枸杞和水按照比例浸泡30 min,将浸泡过的枸杞打浆,得枸杞汁。
菌株活化:在无菌环境下,将保藏的菌种接种于MRS固体培养基上活化后,挑取平板上单菌落接种于MRS液体培养基中,37 ℃下培养12 h,传代2次,直至菌浓度达到108～1010CFU/mL。
菌株扩培:将活化后的菌株以1%(体积分数,下同)的比例接种于扩培培养基中,培养20～24 h,当菌株浓度达到108～109CFU/mL时,将此培养液以3%的比例接种于枸杞汁中进行发酵。
过滤:将发酵液在5 000 r/min、4 ℃离心10 min,取上清液,用0.22 μm滤膜过滤。
灌装:将过滤后的发酵液装入容器中并封口。
杀菌、冷却:将灌装后的发酵液于85 ℃灭菌25 min,取出冷却至常温即获得黑果枸杞乳酸菌发酵饮料。
1.4.2 酶解条件优化
在37 ℃条件下,分别选取果胶酶2 g/L、纤维素酶2 g/L、果胶酶1 g/L+纤维素酶1 g/L,酶解3 h,进行酶的种类优化;选取果胶酶1 g/L+纤维素酶1 g/L,对酶解时间(0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 h)进行优化,分别考察各因素对黑果枸杞汁中花青素和原花青素含量的影响。
1.4.3 扩培培养基优化
氮源选用脱脂乳粉,碳源选用葡萄糖,生长因子选用黑果枸杞汁(黑果枸杞汁制备方法同1.4节)。在葡萄糖100 g/L+脱脂乳粉(10、30、50、70 g/L),葡萄糖(10、30、50、70、100、120 g/L)+脱脂乳粉100 g/L,葡萄糖100 g/L+脱脂乳粉100 g/L+生长因子(20、40、60、80、100 g/L)的条件下,分别考察各因素对培养基中乳酸菌菌落总数的影响。
1.4.4 发酵工艺优化
在料水比(1∶15、1∶30、1∶50、1∶100)(g∶mL,下同),接种量3%,37 ℃发酵12 h;料水比1∶30,接种量3%,37 ℃发酵(3、7、12、15、24、27 h)的条件下,分别考察各因素对黑果枸杞饮料的总酸、还原糖、花青素、原花青素和感官评分的影响。
1.4.5 杀菌工艺优化
考察不同杀菌条件(75 ℃ 5～40 min、85 ℃ 5～30 min,以每5 min为一个梯度)[11],对花青素保留率、原花青素保留率以及色差(ΔΕ*)的影响。
1.4.6 指标测定
总酸含量测定参照GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》;还原糖含量测定参照NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的测定 3,5-二硝基水杨酸比色法》;花青素含量测定采用pH示差法[12];原花青素含量测定采用4-二甲基氨基肉桂醛法[13];色差采用色差计测定[14]。
微生物指标测定参照GB/T 4789.2—2016 《食品微生物学检验 菌落总数测定》、GB/T 4789.3—2016 《食品微生物学检验 大肠菌群计数》、GB/T 4789.15—2016 《食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》
参考GB/T 7101—2022 《食品安全国家标准 饮料》中感官要求,邀请10名受过专业培训的感官评价员成立感官品评小组,从色泽、气味、滋味和组织状态4个方面对产品进行感官评价,取平均值作为产品的最终得分。感官评价细则如表1所示。
表1 感官评定表
Table 1 Evaluation indices of sensory
指标标准评分色泽(20分)紫黑色,有光泽16^20紫黑色,光泽较差11^15浅紫色,色泽偏暗0^10气味(30分)香气协调,清雅的枸杞香及柔和发酵香,无异香21^30香气尚协调,枸杞香及发酵香尚明显,无明显异香11^20香气不协调,有异香0^10滋味(30分)口感细腻,酸味柔和,无异味21^30口感较好,酸味尚柔和,无明显异味11^20口感较差,有异杂味0^10组织状态(20分)流动性好,均匀,不分层,无沉淀物16^20有轻微浑浊,或有少量沉淀11^15浑浊,沉淀较多0^10
1.5 数据统计
采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析,GraphPad 8.0软件绘图,每个样品测3次平行,结果以平均值±标准偏差的形式表示。
2 结果与分析
2.1 酶解工艺优化
黑果枸杞中约含有20%的果胶、纤维素等大分子物质,可能会影响出汁率和黑果枸杞汁中花青素和原花青素的含量,使用果胶酶和纤维素酶处理可以部分酶解黑果枸杞中的果胶、纤维素、半纤维素和木质素等物质[15-16],不仅有利于促进风味和功能物质的释放,改善口感[17],还有利于后续的过滤和澄清。
2.1.1 酶种类对花青素和原花青素含量的影响
采用果胶酶和纤维素酶对黑果枸杞进行处理,由图2可知,酶解3 h后果汁中花青素和原花青素含量均显著增加,这说明果胶酶和纤维素酶均对功能成分的释放有显著的促进作用,且果胶酶和纤维素酶共同酶解的效果优于单酶,2种酶共同酶解后花青素含量179.75 mg/L,较未酶解提高了12.5%,原花青素含量63.86 mg/L,较未酶解提高了18.3%。这说明2种酶共同作用对黑果枸杞中的大分子物质(如果胶和纤维素等)酶解效果更好,有利于花青素和原花青素的溶出[18],所以最终选用果胶酶和纤维素共同酶解黑果枸杞汁。
a-花青素;b-原花青素
图2 果胶酶和纤维素酶酶解后黑果枸杞汁中花青素和原花青素含量
Fig.2 Contents of anthocyanins and proanthocyanidins in L.ruthenicum juice after enzymatic hydrolysis with pectinase and cellulase
注:不同字母表示含量差异显著(P<0.05)(下同)。
2.1.2 酶解时间
选用果胶酶和纤维素酶进行复合酶解实验,结果如图3所示,随着酶解时间的增加,花青素和原花青素含量均显著增加,酶解3.5 h后,花青素含量达到最大值182.10 mg/L,原花青素含量在酶解3 h后没有显著差异(P>0.05),所以最终确定的酶解时间为3.5 h。
a-花青素;b-原花青素
图3 酶解不同时间后黑果枸杞汁中花青素和原花青素含量
Fig.3 Contents of anthocyanins and proanthocyanidins in L.ruthenicum juice after enzymatic hydrolysis at different times
2.2 扩培培养基优化
工业上多用20%～30%的脱脂乳培养基或者降低脱脂乳的含量(3%～5%)加入一定的碳源和生长因子制备成复合培养基,相较之下复合培养基的营养物质含量丰富且成本低。因此本研究以脱脂乳粉为氮源,葡萄糖为碳源,枸杞汁为生长因子,以菌落总数为指标进行优化,以期获得菌株生长情况好、价格低廉且可以直接应用于黑果枸杞饮料中的菌种扩培培养基。
由图4可知,随着氮源、碳源和生长因子添加量的增加,菌落总数呈现先增加后平稳的趋势,最终确定培养基配方:脱脂乳粉30 g/L、葡萄糖70 g/L、枸杞汁80 g/L,经过实验验证,在扩培培养基中生长24 h后,乳酸菌菌落总数为1.8×109 CFU/mL,与在MRS培养基中生长24 h后的菌落总数(2.1×109 CFU/mL)相当,说明优化后的培养基可以满足干酪乳杆菌扩培的要求。
a-脱脂乳粉;b-葡萄糖;c-枸杞汁
图4 脱脂乳粉、葡萄糖和枸杞汁添加量对乳酸菌菌落总数的影响
Fig.4 Effect of addition amount of skimmed milk powder, glucose, and L.ruthenicum juice on lactic acid bacteria count
2.3 发酵工艺优化
2.3.1 料水比
由图5-a可知随着水添加量的减少,总酸含量逐渐增加,说明乳酸菌能很好的利用枸杞中的营养物质产酸,但是总酸含量的增加导致pH降低,制约乳酸菌继续生长。虽然料水比1∶30和1∶15时花青素保留率及原花青素保留率没有显著性差异(图5-b、图5-c),但是料水比1∶30时酸度适宜(图5-a),具有较好的口感(图5-d),因此最终选择的料水比为1∶30,这与闫世芳等[19]的结果一致,此时花青素保留率为112.48%,原花青素保留率为83.64%。值得注意的是原花青素的损失量基本与花青素的增加量相同,说明有可能在发酵过程中有一部分原花青素降解为花青素,弥补了花青素的损失,所以导致花青素含量增加。
a-总酸;b-花青素;c-原花青素;d-感官评分
图5 不同料水比的黑果枸杞汁发酵前后总酸、花青素、原花青素含量及感官评分
Fig.5 Content of total acid, anthocyanin, proanthocyanidin, and sensory score of L.ruthenicum juice fermented with different solid-liquid ratio
2.3.2 发酵时间
由图6-a可知,随着发酵时间的增加,总酸含量呈现先增加后不变的趋势,还原糖含量呈现先降低后不变的趋势,这可能是由于乳酸菌发酵利用了枸杞中的还原糖,而乳酸的产生会导致pH降低,从而抑制干酪乳杆菌的生长,导致总酸含量不变。如图6所示发酵过程中花青素含量先平稳后增加,原花青素含量显著降低,花青素的增加可能是由于发酵过程中的溶出以及原花青素在酸性条件下的分解[20]。在发酵过程中,总酸含量随时间逐渐增长,经感官评价小组评估,发酵15 h时酸度适宜,口感柔和,感官评分最高(图6-c),因此选择了发酵时间为15 h,最终总酸含量3.54 g/L。
a-总酸和还原糖;b-花青素和原花青素保留率;c-感官评分;d-花青素和原花青素含量
图6 不同时间发酵时总酸、花青素、原花青素含量和感官评分
Fig.6 Contents of total acid, anthocyanins, proanthocyanidins and sensory score of L.ruthenicum juice at different fermentation times
2.4 杀菌工艺优化
杀菌是饮料生产过程中的一个重要环节,其工艺参数对产品品质和货架期都有重要的影响[21]。杀菌时花青素和原花青素的损失程度除了受温度和时间影响外,还受到光照、氧气等其他因素的影响,但是这些因素很多时候没有引起重视,所以本文对杀菌过程中氧气和光照对花青素和原花青素保留率的影响进行了研究。
2.4.1 温度和时间
本研究制备的饮料pH<4,为酸性饮料,巴氏杀菌可满足杀菌要求,由表2可知,75 ℃、30 min及85 ℃、25 min时菌落总数、霉菌和大肠杆菌均未检出。随着杀菌温度和时间的增加,花青素和原花青素的保留率均显著性降低,说明长时间高温杀菌对花青素和原花青素的损伤较大,所以在选择杀菌条件时应尽量选择较低的杀菌强度。随着温度和时间的增加,饮料色差增加,但ΔΕ*>3时,肉眼才可以察觉到差异,即在本研究选择的杀菌时间范围内,由杀菌造成的色差影响均可接受。综合以上结果,最终确定的杀菌参数为85 ℃加热25 min,此时花青素保留率79.20%,原花青素保留率83.71%。
表2 黑果枸杞饮料不同杀菌条件下的理化指标及微生物指标
Table 2 Physicochemical and microbial indexes of L.ruthenicum beverage under different sterilization conditions
注:每一列不同字母表示差异显著(P<0.05);-表示未检出。
杀菌条件理化指标微生物指标/(CFU/mL)温度时间/min花青素保留率/%原花青素保留率/%色差菌落总数霉菌和酵母大肠杆菌未杀菌10010003×10632611075 ℃594.80±0.55a95.45±0.86a0.51±0.01g48452-1092.26±0.34ab93.01±0.91ab0.83±0.09f21616-1589.90±0.66bc91.86±3.11ab0.96±0.05ef160--2085.31±0.79de87.55±1.23bc1.05±0.33de80--2581.43±0.58ef85.22±3.09cde1.71±0.93cd12--3077.69±0.73f82.51±1.92de2.49±0.16b---4070.90±1.38g75.86±2.17ef2.72±0.01a---85 ℃593.28±0.95ab94.29±2.05a0.82±0.34f34226-1092.08±1.39ab92.84±1.74ab1.03±0.18de1184-1586.76±1.04bc90.65±3.25abc1.15±0.58d26--2082.03±3.81ef87.09±0.14cd1.82±0.11c10--2579.20±0.58f83.71±1.21de2.13±0.32b---3072.16±0.65g81.53±2.53f2.87±0.65a---
2.4.2 光照强度
在优选的杀菌条件下探究光照对饮料中花青素和原花青素保留率及色差的影响,结果如图7所示,光照强度对原花青素保留率有显著性影响,对花青素保留率和产品色差没有显著性影响。避光杀菌后原花青素保留率提高4.5%,说明光照主要影响饮料中的原花青素含量,对花青素和产品色泽的影响较小,这可能是因为原花青素对光照较敏感[22]。所以最终选择在杀菌时避光。
a-花青素保留率;b-原花青素保留率;c-色差
图7 避光与不避光杀菌时花青素、原花青素保留率及色差变化
Fig.7 Retention rate of anthocyanins, proanthocyanidins, and color difference during sterilization with and without light
2.4.3 氧气含量
在优选的杀菌条件下探究氧气含量对饮料中花青素、原花青素和色差的影响,由图8可知,发酵液中氧气含量为6.0 mg/L。进行梯度除氧后杀菌,结果表明,氧气浓度对原花青素保留率和色差没有显著性影响,对花青素保留率有显著影响,氧气浓度越低,花青素保留率越高,在料液中氧气含量低于0.5 mg/L时,花青素保留率基本保持不变,此时花青素保留率较不除氧时提高4.8%,说明氧气含量主要影响饮料中的花青素含量,这可能是因为花青素易受氧气的影响[23]。所以在杀菌时控制料液中氧气含量小于0.5 mg/L。
a-原花青素保留率;b-花青素保留率;c-色差
图8 不同氧气含量黑果枸杞饮料杀菌时花青素、原花青素保留率及色差变化
Fig.8 Retention rate of anthocyanins, proanthocyanidins, and color difference during sterilization under different oxygen content
2.5 产品质量评价
2.5.1 感官指标
色泽:紫黑色,色泽均匀,有光泽;滋味和气味:拥有黑果枸杞独有的风味和乳酸菌发酵的独特香气,酸甜适口,口感细腻;组织形态:产品澄清透明,流动性好,无肉眼可见的杂质和沉淀。
2.5.2 理化指标
黑果枸杞乳酸菌发酵饮料,离心沉淀率0.078%,产品稳定性好。成品总酸含量3.54 g/L,还原糖含量4.73 g/L,花青素含量163.51 mg/L,原花青素含量54.90 mg/L。理化指标符合GB/T 7101—2022《食品安全国家标准 饮料》及GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》等国家标准。
2.5.3 微生物指标
黑果枸杞乳酸菌发酵饮料微生物指标符合GB/T 7101—2022《食品安全国家标准 饮料》及GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》等国家标准,致病菌未检出。
3 总结与展望
本文主要研究了如何在黑果枸杞乳酸菌发酵饮料加工过程中减少花青素和原花青素的损失,通过对酶解条件、扩培培养基、发酵工艺以及杀菌条件进行优化,得到了黑果枸杞乳酸菌发酵饮料的最优生产工艺。酶解显著提高了黑果枸杞汁中的花青素和原花青素含量,发酵显著提高了花青素的含量和稳定性,但是杀菌会造成花青素和原花青素的大量损失,通过优化杀菌参数和控制环境因子,可以有效减少花青素和原花青素在杀菌过程中的损失。本研究利用干酪乳杆菌发酵制备的黑果枸杞饮料不仅口感柔和、风味优良,花青素和原花青素的保留率也得到了明显的提高,后续将继续研究黑果枸杞乳酸菌发酵饮料储藏过程中主要功能成分的含量变化及其保护技术。
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