壳聚糖(chitosan,CS)是自然界的第二大天然有机物甲壳素的脱乙酰产物,具有无毒[1]、生物相容性[2]、抗氧化[3]、抑菌[4]和可生物降解[5]等优点,在食品、药品、农业、纺织、化妆品和水处理等领域存在极大的应用潜力[6-10]。由于CS分子内和分子间存在强烈的相互作用,导致其生物学性能较差,如溶解性低、抗氧化、抑菌效果不强等,限制了其应用[11]。增强CS生物活性并赋予其某些新特性的有效方法是化学修饰,接枝共聚反应是化学修饰的最常用方法[12]。H2O2和抗坏血酸(维生素C)是一种经济实惠的水溶性氧化还原引发剂,可作为接枝共聚反应的引发剂。与传统引发剂相比,H2O2/维生素C氧化还原引发剂不会产生有毒物质,且反应条件温和,可以在环境温度下进行[13]。这些优点表明,由H2O2/维生素C氧化还原系统引发的自由基反应非常适合食品、医疗领域。使用这种方法将抑菌或抗氧化因子接枝并共价固定在CS的分子上,有望改善CS的性能,使其成为新型的绿色抑菌或抗氧化材料。
对羟基苯甲酸酯是一种常见的防腐剂,在食品、化妆品等领域被广泛应用[14-15]。对羟基苯甲酸酯被认为对人体是安全无副作用的,它由对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid,PA)和羟基(—OH)经酯化反应得到。理论上,在一定条件下,PA可以与CS反应,生成无毒害的对羟基苯基酸-壳聚糖酯。由于具有酚羟基,所以理论上产物的抗氧化和抑菌活性会被大大增强。
现已有多种酚酸接枝到CS及其衍生物上的研究[16],如没食子酸、咖啡酸、阿魏酸、水杨酸和绿原酸等。但是目前通过自由基介导将酚酸PA接枝到CS的研究鲜有报道。因此,本文使用H2O2/维生素C氧化还原对,通过自由基反应,制备了3种不同枝接率的PA改性的CS(p-hydroxybenzoic acid-chitosan,PA-g-CS),以期探明PA接枝对CS的影响。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
壳聚糖(脱乙酰度95%)、DPPH,麦克林生化科技有限公司;对羟基苯甲酸(分析纯)、福林酚、乙醇等试剂,国药集团化学试剂有限公司。
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,来自中国普通微生物菌种保藏管理中心,经传代培养后使用。
Tensor 27傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)仪,德国Bruker公司;TGA/DSC 1/1100热重/差热分析仪,美国梅特勒-托利多公司;S-3000N扫描电子显微镜,日本Hitachi公司;TU1800紫外-可见分光光谱仪,北京普析通用仪器公司;Rigaku SmartLab X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)仪,日本理学株式会社。
1.2 实验方法
1.2.1 PA-g-CS制备
将1.20 g CS完全溶解于100 mL 2%(体积分数)乙酸溶液中。以PA与CS重复单元物质的量比为0.3∶1、0.7∶1与1∶1分别将PA添加到不同的三颈圆底烧瓶中。所有反应器中加入0.2 g维生素C后,通入高纯N2排除空气。然后,加入1 mL体积分数30% H2O2溶液。以N2隔绝空气,反应12 h后,使用8～14 kDa透析袋透析反应液以除去未反应的PA及其他可溶性物质。透析72 h,每8 h更换1次透析水,然后冷冻干燥得到样品PA-g-CS-Ⅰ(0.3∶1),PA-g-CS-Ⅱ(0.7∶1)和PA-g-CS-Ⅲ(1∶1)。
1.2.2 PA-g-CS接枝度测定
采用福林酚法测量PA-g-CS中的PA含量[17]。将冻干PA-g-CS粉末溶解在1%(体积分数)的乙酸中,终质量浓度1 mg/mL。将福林酚试剂稀释5倍后取2.0 mL与2.0 mL样品溶液混匀,避光30 min,加入6 mL质量分数20%Na2CO3溶液,摇匀后在室温下反应2 h,750 nm处测其吸光值。根据PA标准品建立的标准曲线计算PA-g-CS的接枝度,结果表示为mg PA/g PA-g-CS(mg PA/g)。
1.2.3 紫外可见光谱分析
将PA、CS和PA-g-CS以4 mg/mL分别溶解于乙酸水溶液(0.4%,体积分数)中,在200～600 nm进行全波长扫描。乙酸水溶液用作空白,扫描进行3次,取平均值。扫描速度为0.5 nm/s。
1.2.4 FT-IR分析
将样品置于FT-IR仪的附件上,压头压紧后使之与晶体表面紧密接触,在衰减全反射模式下测试,扫描范围为4 000～400 cm-1。
1.2.5 结晶性检测
使用XRD仪得到CS和PA-g-CS的XRD图谱。采用Cu-Kα 射线源(λ=0.154 2 nm),测试电压40 kV,电流40 mA。测量角度2θ=10°～40°,步长0.02°,扫描速度0.1°/s。
1.2.6 热重分析(thermogravimetric analysis,TGA)
在N2气氛下以10 ℃/min的升温速率使用热重分析仪将CS和PA-g-CS从25 ℃加热到600 ℃。
1.2.7 扫描电镜
将样品固定在导电胶上,镀金后,使用扫描电子显微镜在10 kV加速电压下观察CS和PA-g-CS表面形貌。
1.2.8 抗氧化活性
参考XIE等[18]的方法,并稍作修改。50 μL(0.125～4 mg/mL)样品与200 μL 0.4 mmol/L DPPH乙醇溶液在96孔板中混合均匀,室温下反应30 min。使用酶标仪在517 nm处测量吸光度。DPPH自由基清除率计算如公式(1)所示:
(1)
式中:I,DPPH自由基清除率,%;A0,DPPH与样品溶剂的吸光度;A1,DPPH与样品的吸光度;A2,样品与溶剂的吸光度。
1.2.9 抑菌活性
参考文献[19]的方法,并稍作修改。将菌株(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)传代培养后,接种到Mueller-Hinton MH肉汤培养基(25 g/L,pH 7.2)中,37 ℃培养8 h左右。随后,使用MH肉汤培养基将所得培养物稀释至106 CFU/mL。将灭菌的MH肉汤培养基倒入到直径9 cm的无菌培养皿中。冷却并固化培养基后,将100 μL稀释的细菌悬浮液均匀地分散在固体培养基的表面。之后将5个无菌牛津杯放置在接种好的平板上。在牛津杯中添加200 μL(5 mg/mL)样品后,37 ℃培养24 h。使用游标卡尺测量抑菌圈直径,无菌生理盐水(质量分数为0.85%)用作对照。
1.3 数据分析
数据以平均值±标准差表示。使用Excel 2016和Origin 2017C软件进行数据分析及作图。使用SPSS 13.0软件进行显著性差异分析。P<0.05被认为具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 PA-g-CS的反应机理及取代度
图1展示了PA和CS之间可能的反应机理。首先,维生素C和H2O2反应产生·OH,·OH随后引发聚合反应(图1-a)。然后,生成的·OH从CS分子吸收氢原子并形成CS自由基(图1-b)。此后,反应位点附近的PA成为CS自由基的受体,形成了PA-g-CS(图1-c)。一般认为,该过程是维生素C/H2O2引发的自由基枝接反应的反应机理[20]。
图1 PA-g-CS形成可能的反应机理
Fig.1 Possible mechanism of the reaction for PA-g-CS formation
2.2 紫外-可见光谱分析
如图2所示,PA在245 nm处存在一个较宽的吸收带,这与苯环π键有关。CS在225 nm处存在一个弱峰,这是因为CS分子上存在的未完全脱去的乙酰基[21]。3种接枝物中,PA-g-CS-Ⅰ存在2个吸收峰(234、252 nm),PA-g-CS-Ⅱ在251.5 nm附近的吸收带比PA-g-CS-Ⅰ更宽,同样PA-g-CS-Ⅲ在246 nm附近的吸收带比其他2种接枝物更宽。这可能归因于接枝到CS分子的PA数量的变化,随着PA-g-CS样品中PA当量的增加,CS残基和PA残基的吸收峰逐渐合并为一个吸收带,并且这些峰逐渐向PA的峰型转变。紫外-可见光谱的差异证实了PA已成功接枝到CS上。
图2 CS、PA和PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的紫外-可见光谱
Fig.2 UV-Vis spectra of CS, PA, and PA-g-CS(Ⅰ-Ⅲ)
2.3 FT-IR光谱
图3是CS和PA-g-CS的FT-IR光谱。CS在3 450 cm-1(苯环中的OH—和NH—拉伸),2 930～2 870 cm-1(C—H拉伸),1 655 cm-1(酰胺Ⅰ,C
O拉伸),1 590 cm-1(酰胺Ⅱ,N—H弯曲),1 323 cm-1(酰胺Ⅲ,C—N拉伸,残留的N-乙酰基),1 030 cm-1(C—O—C)和896 cm-1(吡喃糖环)附近的吸收峰与先前的报道是一致的[22-23]。3种枝接物在1 730 cm-1(CO拉伸)附近均出现了一个新的吸收峰,表明PA(—COOH)和CS(—OH)发生了接枝共聚反应,形成了酯键。此外,观察到在3种接枝物的谱图中酰胺Ⅲ的吸收峰从1 323 cm-1移至1 307 cm-1,其峰强度高于CS,这证明了接枝反应也发生在氨基(—NH2)中,与LIU等[24]的研究结果一致。
图3 CS和PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的FT-IR光谱
Fig.3 FT-IR spectra of CS and PA-g-CS(Ⅰ-Ⅲ)
2.4 晶体结构
如图4所示,CS在衍射角2θ=11°和20°处有2个明显的衍射峰,分别与晶型I和II有关[25]。3种接枝物均在2θ=13°和20°处出现峰,在2θ=13°时,接枝物的弱峰取代了CS在2θ=11°时的弱峰。而且,接枝物的峰强度明显低于CS的峰强度,所以CS分子骨架上引入PA基团后,削弱或者破坏了CS分子内原有的氢键作用,使CS的结晶度减弱。这可能会导致PA-g-CS分子上更多的羟基和氨基裸露出来,从而极大地增强接枝物的抑菌、抗氧化和水溶性。同时也可能会降低接枝物的热稳定性。XRD结果再次验证了PA已成功接枝到CS上。
图4 CS和PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的XRD光谱
Fig.4 XRD spectra of CS and PA-g-CS(Ⅰ-Ⅲ)
2.5 扫描电镜观察
CS和PA-g-CS微观结构如图5所示,CS在接枝前后表面形态具有明显差异。由于CS分子之间存在强烈的氢键相互作用,CS(图5-a)具有光滑片状表面,相反,PA-g-CS的表面较粗糙,表现为疏松多孔的网络。接枝物的这种结构增加了其表面积和比表面积,这可能会使接枝物具有强烈的吸附能力。用原儿茶酸[22]和肉桂酸[26]接枝的CS得到了相似的结果。从图5-b～图5-d可以清楚地观察到,接枝度越大,PA-g-CS表面上的空隙越多,其表面积和比表面积越大。因此使得通过操控PA-g-CS的接枝率,从而控制PA-g-CS的表面形态成为可能。
a-CS;b-PA-g-CS-Ⅰ;c-PA-g-CS-Ⅱ;d-PA-g-CS-Ⅲ
图5 CS、PA-g-CS-Ⅰ、PA-g-CS-Ⅱ和PA-g-CS-Ⅲ的扫描电镜图
Fig.5 SEM of CS, PA-g-CS-Ⅰ, PA-g-CS-Ⅱ, and PA-g-CS-Ⅲ
2.6 热稳定性分析
热稳定性可以确定PA-g-CS在生产加工和使用过程中所能承受的最高温度。TGA是研究共聚物热稳定性的常规技术,微商热重(derivative thermogravimetric,DTG)是TGA的一阶导数。由DTG曲线可知(图6),CS、PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)均出现两步质量损失,在25～100 ℃,失重与水蒸气蒸发有关,CS的失重率最低,PA-g-CS-Ⅰ的失重率最高,表明PA-g-CS可能具有更强的吸湿能力。CS在100～250 ℃是稳定的,当温度>250 ℃时,CS快速分解并在300 ℃时达到峰值。PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)在140 ℃开始缓慢分解,也在300 ℃达到峰值。在600 ℃下,CS和PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的残留物质量分别为36.2%、22.6%、28.9%和25.7%。TGA和DTG结果表明CS在250 ℃以下稳定。PA-g-CS于140 ℃开始分解。与CS相比,PA-g-CS的热稳定性降低,这与前人的研究相符[21-22]。然而,PA的取代度并未对PA-g-CS的分解温度有明显影响。该结果类似于阿魏酸接枝的CS[27]。热稳定性降低可能是因为PA-g-CS的结晶度降低引起的。
图6 CS、PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的TGA和DTG曲线
Fig.6 TGA and DTG curves for CS, PA-g-CS(Ⅰ-Ⅲ)
2.7 抗氧化活性
如图7所示,与CS相比,PA-g-CS在0.125～4 mg/mL时DPPH自由基清除能力显著提高(P<0.05),该结果与WU等[28]将没食子酸接枝到CS的结果一致。此外,CS、PA及PA-g-CS的DPPH自由基清除能力均与质量浓度呈正相关。在一定的质量浓度范围内,PA-g-CS的DPPH自由基清除能力与枝接率呈正相关,PA-g-CS-Ⅲ的DPPH自由基清除率显著高于PA-g-CS-Ⅰ和PA-g-CS-Ⅱ(P<0.05)。此外,相对于PA,PA-g-CS具有更强的DPPH自由基清除能力。这与CHO等[29]将没食子酸接枝到CS上的结果相似。这些发现表明,接枝到CS上的PA对DPPH自由基清除能力具有协同作用。这可能是由于接枝后CS分子间和分子内氢键被破坏,导致接枝产物有能力提供更多的氢原子。这与上述PA-g-CS的结晶度降低的结果相符。同时,PA部分的电子转移能力也可能是接枝物清除DPPH自由基能力增强的原因。
图7 CS、PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)和PA的DPPH自由基清除活性
Fig.7 The DPPH radical-scavenging activity of CS, PA-g-CS(Ⅰ-Ⅲ), and PA
2.8 抑菌活性
用2种常见的致病菌大肠杆菌(G-)和金黄色葡萄球菌(G+)对各种膜的抗菌性能进行了评价,结果如表1所示。与CS膜相比,PA-g-CS膜具有更强的抗菌活性(P<0.05),这表明PA接枝CS膜的抗菌性能得到了提高,PA和CS的协同作用可以增强其抗菌作用。与大肠杆菌相比,CS膜和PA-g-CS膜对金黄色葡萄球菌均表现出更强的抗性。CS和PA-g-CS膜对金黄色葡萄球菌的抗菌活性高于对大肠杆菌的抗菌活性,这可能与革兰氏阴性菌细胞膜上的脂多糖层能有效阻止抗菌物质穿透细胞膜,从而具有一定的耐药性有关[30]。
表1 CS和PA-g-CS(Ⅰ～Ⅲ)的抑菌圈直径 单位:mm
Table 1 The diameters of the inhibition zone of CS and PA-g-CS (Ⅰ-Ⅲ)
注:同行不同小写字母表示在P <0.05水平下有显著差异。
菌株CS膜PA-g-CS-Ⅰ膜PA-g-CS-Ⅱ膜PA-g-CS-Ⅲ膜大肠杆菌11.3±0.6a13.9±0.5b16.3±0.8c29.0±1.0d金黄色葡萄球菌13.4±0.6b15.2±0.6e18.7±0.8f22.2±1.1g
3 结论
紫外-可见光谱和FTIR图谱分析都表明PA与CS之间形成了共价键。XRD和TGA图谱表明,与CS相比,PA-g-CS的结晶度和热稳定性降低。扫描电镜图谱表明,PA-g-CS的微观化学结构的改变导致宏观表面形态从光滑变为粗糙。接枝度越高,表面越粗糙且多孔,这使得通过控制接枝度来控制PA-g-CS的表面形态成为可能。抗氧化和抑菌测试表明,CS和PA的共价结合增强了PA-g-CS的生物学特性,接枝度相对较高的产品表现出更强的抑菌和抗氧化活性。因此,有望将PA-g-CS开发为新型防腐剂、抗氧化剂和可降解活性包装材料。
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