三穗鸭是我国有名的地方鸭品种,其鸭蛋蛋白、蛋黄重量均优于其他鸭[1],蛋白质含量丰富而均衡,营养价值很高[2-3]。三穗鸭蛋制品涉及咸鸭蛋、皮蛋等各种熟知的蛋制品行业[4-5],咸鸭蛋口感松沙,风味独特,民间称其为“青果”[6],咸鸭蛋黄是咸鸭蛋主要食用部位,除熟制直接食用外,还被广泛应用于粽子、月饼、酥饼等[7],因此咸鸭蛋是三穗鸭蛋重要的加工制品。经腌制而成的咸鸭蛋,其蛋白质被分解为氨基酸,易于吸收,具有极高的营养价值[8],但是传统工艺腌制的咸鸭蛋存在蛋清盐含量较高、咸味过重等问题,造成咸蛋清的浪费,而且高盐食品的食用对人体健康不利。有部分学者提出咸蛋清再利用技术[9-10],但这无法扩大到居民生活,难以实现咸蛋清的再回收。在此背景下,低盐咸鸭蛋腌制技术研究成为热点,涌现了如负压快速腌制技术[11-12]、磁电辅助快速腌制技术[13-15]、超声波辅助快速腌制技术[16-18]、低钠脉动压快速腌制技术[19-20]等新兴技术,低盐咸鸭蛋的成功除了可以解决咸蛋清浪费的问题,也可以为咸鸭蛋加工节约部分成本。游离氨基酸是食品中重要的风味前体物质和呈味物质,其可以通过脱氢、转氨、还原、脱羧等反应生成醇、酯、醛(尤其是含有氮、硫)等风味物质[21],蛋黄中的含硫氨基酸如甲硫氨酸可以降解产生硫醇,从而合成其他风味物质[22];游离氨基酸在滋味上的作用与其构型、环境pH、氨基酸组分、温度等都有很大关系,如D-氨基酸多呈现甜味,而L-氨基酸可呈现酸、甜、苦、鲜、咸5种味觉[21],在蛋黄中的游离氨基酸主要呈现鲜、甜、苦的滋味[23]。孙静等[24]通过对呈味氨基酸的阈值进行分析,比较了水腌咸鸭蛋与泥腌咸鸭蛋在口感上的差异,还对不同清洗消毒方式对咸鸭蛋呈味氨基酸含量及种类的影响进行了研究[25],这表明咸鸭蛋中的游离氨基酸含量和种类可以用于辅助判定咸鸭蛋的品质,但其并未对咸鸭蛋中主要的呈味氨基酸方面进行研究。明确咸鸭蛋中的主要呈味氨基酸,对提高咸鸭蛋口感、改善咸鸭蛋腌制方法、比较咸鸭蛋品质有着重要作用。主成分分析(principal component analysis,PCA)是一种降维统计方式[26],在莲藕[27]、羊肚菌[28]、乳饼[29]等的游离氨基酸综合评价上广泛应用。本试验研究三穗特色低盐咸鸭蛋在腌制不同阶段游离氨基酸的变化,并利用PCA探究对咸鸭蛋滋味影响最大的游离氨基酸种类。
1 材料与方法
1.1 实验材料与设备
NaCl、香辛料、白酒(食品级),市售;磺基水杨酸、HCl(分析纯)、CuSO4、K2SO4、NaOH,天津市瑞金特化学品有限公司;甲基红指示剂,天津市登科化学试剂有限公司;溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂,天津市科密欧化学试剂有限公司;H2SO4,成都金山化学试剂有限公司;硼酸,天津市永大化学试剂有限公司;95%乙醇、无水乙醚、石油醚,天津市富宇精细化工有限公司;碘,天津永晟精细化工有限公司;KI,天津市北联精细化学品开发有限公司;混合氨基酸标品,日本和光药业株式会社。
XHF-D高速匀浆机,宁波新芝生物科技股份有限公司;SIGMA2-16K高速离心机,德国西格玛公司;GZX-GF101-3-BS-Ⅱ电热鼓风干燥箱,上海贺德试验设备有限公司;L-8800氨基酸分析仪,日本日立公司;FA2002B分析天平,上海越平科学仪器有限公司;PHS-3C pH计,上海鸿盖仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 低盐咸鸭蛋制作工艺
三穗麻鸭蛋→洗净晾干→质量分数25%盐水腌制8 d→取出晾干→第二阶段腌制20 d→取样检测
咸蛋腌制液配制[m(腌制液)∶m(三穗鲜鸭蛋)=1∶1],第一阶段腌制液为质量分数25%的食盐溶液;第二阶段腌制液根据总质量的百分比计算,食盐质量分数10%、香辛料质量分数0.6%、白酒体积分数0.7%。
1.2.2 蛋黄蛋白质含量测定
按照GB 5009.5—2016 《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法执行。
1.2.3 蛋黄游离氨基酸测定
将腌制完成的咸蛋熟制后去除蛋壳,分离蛋白蛋黄,在滤纸上滚动蛋黄完全去除蛋清,然后粉碎蛋黄。称取1 g左右蛋黄粉碎样品,用50 mL 0.01 mol/L HCl溶液浸提30 min;摇匀后过滤,准确吸取滤清液2 mL于离心试管中,加入体积分数8%磺基水杨酸2 mL,混匀,静置15 min;3 000 r/min离心20 min;取上清液,过0.45 μm膜后上机测定。每组实验做3个平行,计算平均值和标准偏差。
1.2.4 数据处理
在相同条件下对每个指标的测定次数不少于3次,数据记录方式为平均数±标准差,结果采用Excel、SPSS 25.0进行统计分析,Origin 2021软件画图,标准差表现为误差线。
2 结果与分析
2.1 腌制过程中蛋黄蛋白质相对含量变化分析
以湿基为基准检测腌制过程中咸鸭蛋蛋黄蛋白质相对含量的变化,结果如图1所示。腌制过程中蛋白质相对含量呈增加趋势,这与王兆燃等[8]的研究结果相同,原因是食盐渗入蛋黄,由于浓度梯度差异导致蛋黄水分减少[30],因此蛋白质的占比增加。未腌制的蛋黄蛋白质含量为14.8%,腌制28 d时,随着蛋黄中NaCl渗入量的增加,蛋黄水分含量不断降低,蛋黄蛋白质含量增加至18.2%。
图1 蛋黄蛋白质相对含量变化
Fig.1 Changes in content of egg yolk protein during pickling
2.2 蛋黄游离氨基酸含量变化分析
游离氨基酸是食品中重要的滋味物质和风味前体物质,是衡量食品风味的一个重要指标。由表1可知,在腌制的不同时间咸蛋黄中的游离氨基酸种类没有变化,均为16种,其中包括赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸7种必需氨基酸。与余平莲[31]的研究结果相比少了半胱氨酸(Cys);比孙静等[24]的水腌组多了天冬氨酸(Asp)、甲硫氨酸(Met),可能是因为鸭蛋品种、腌制方式等的差异。
表1 咸蛋腌制过程中蛋黄游离氨基酸组成变化 单位:mg/100 g
Table 1 Changes in the composition of free amino acids during salted egg pickling
注:“*”为必需氨基酸,“A”为鲜味氨基酸,“B”为甜味氨基酸,“C”为苦味氨基酸,“D”为芳香族氨基酸,(下同)。同行数值不同小写字母表示差异显著,P<0.05。
氨基酸名称0 d7 d14 d21 d28 d天冬氨酸AspA1.47±0.02c1.81±0.01b1.85±0.02b1.93±0.05a2.18±0.01a苏氨酸Thr∗B1.40±0.02b1.66±0.11b2.08±0.05a1.80±0.01b2.01±0.02a丝氨酸SerB1.53±0.00b1.85±0.01b2.06±0.02a2.00±0.03a2.19±0.01a谷氨酸GluA3.83±0.25c4.59±0.12b4.82±0.01b5.02±0.06a5.44±0.15a甘氨酸GlyB0.62±0.01b0.78±0.03b0.88±0.01a0.80±0.02a0.90±0.01a丙氨酸AlaB1.51±0.12c1.76±0.02b1.87±0.02b1.96±0.01a2.20±0.06a缬氨酸Val∗C1.50±0.06c1.74±0.01b1.86±0.03b1.82±0.01b2.26±0.07a甲硫氨酸Met∗C1.38±0.10b1.45±0.05b1.69±0.02a1.40±0.03b1.75±0.04a异亮氨酸Ile∗C1.30±0.01c1.53±0.03b1.55±0.01b1.63±0.08b1.83±0.01a亮氨酸Leu∗C3.13±0.13b3.46±0.10b3.47±0.07b3.68±0.09b4.30±0.16a酪氨酸TyrD1.96±0.17c2.43±0.06b2.69±0.05b2.82±0.01b3.20±0.11a苯丙氨酸Phe∗D2.01±0.18b2.30±0.14b2.48±0.06a2.61±0.05a2.83±0.02a组氨酸HisB0.78±0.06c0.93±0.04b0.97±0.01b1.12±0.04a1.17±0.08a赖氨酸Lys∗A2.73±0.14c3.41±0.02b3.24±0.12b4.02±0.17a4.11±0.15a精氨酸ArgC2.31±0.19b2.83±0.01b3.17±0.06a3.40±0.07a3.71±0.01a脯氨酸ProB1.06±0.02c1.32±0.09b1.44±0.02b1.49±0.05b1.70±0.02a总计28.52e33.85d36.11c37.50b41.78a
不同腌制时间的氨基酸种类虽然相同,但是在总含量上存在显著性差异(P<0.05)。在腌制的0～7 d游离氨基酸总含量提升了18.69 %,天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸含量提升显著(P<0.05);7～14 d总含量提升了6.68 %,苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸含量提升显著(P<0.05);14～21 d总含量提升了3.71 %,天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、组氨酸、赖氨酸含量提升显著(P<0.05),甲硫氨酸与苏氨酸含量则显著性下降(P<0.05);21～28 d总含量提升了11.41 %,苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸含量提升显著(P<0.05),其中苏氨酸与甲硫氨酸含量再次回升,并与14 d时无显著性差异(P>0.05)。由此可见,0～7 d是游离氨基酸产生的关键时间,含量提升最多,提升含量的氨基酸种类达9种,多于其余阶段。腌制结束后,蛋黄16种游离氨基酸的总量由0 d的28.52 mg/100 g增加至28 d的41.78 mg/100 g,含量提高了46.49 %。其中7种必需氨基酸总含量由13.45 mg/100 g增加至19.09 mg/100 g,占16种游离氨基酸总量的45.69 %。谷氨酸(Glu)是含量最高的游离氨基酸,腌制结束时达5.44 mg/100 g,甘氨酸(Gly)含量最低,腌制结束时仅为0.90 mg/100 g。
咸蛋腌制过程中主要是食盐的渗入改变了其性质,有学者表明游离氨基酸的含量变化源于食盐对蛋白酶的抑制作用[32]。盐对于不同酶的活性影响不同,研究表明食盐对于超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)具有显著影响,而对溶菌酶无太大影响[33];此外,盐可以抑制马铃薯酪氨酸酶的活性,从而减缓其褐变[34];朱佳源等[35]研究发现适量食盐可以提高木聚糖酶、纤维素酶的活性,淀粉酶活性随盐量升高而加强,但是会抑制蛋白酶活性。
2.3 蛋黄游离氨基酸与滋味关系分析
2.3.1 蛋黄呈味氨基酸变化分析
根据氨基酸的呈味特性,可将这16种氨基酸分类:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)为鲜味氨基酸(delicate amino acid,DAA);苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)为甜味氨基酸(sweet amino acid,SAA);缬氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)为苦味氨基酸(bitter amino acid,BAA);苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)为芳香族氨基酸(aromatic amino acid,AAA)[22]。
由图2可知,4类呈味氨基酸在腌制过程中含量总体呈上升趋势,芳香族氨基酸及苦味氨基酸随腌制时间延长,含量显著性增加;甜味氨基酸在0～14 d含量显著性增加(P<0.05),14～21 d含量显著性下降(P<0.05),21～28 d含量再次显著性上升(P<0.05)并达到峰值;鲜味氨基酸含量在0～7 d显著性上升(P<0.05),在7～14 d无显著性变化(P>0.05),14 d后随腌制时间延长含量显著性增加(P<0.05)。腌制28 d结束后,鲜味氨基酸总量增加至11.73 mg/100 g,甜味氨基酸总量增加至10.17 mg/100 g,苦味氨基酸总量增加至13.85 mg/100 g,芳香族氨基酸增加至6.03 mg/100 g。0～7 d时在高浓度盐水中腌制,盐分主要渗透入蛋白部分,蛋黄部分盐浓度较低,蛋白酶活性未受到抑制,游离氨基酸含量上升快;7 d后转为较低浓度盐水腌制,随着蛋白中盐分逐渐向蛋黄转移,蛋白酶活性受到抑制[4],游离氨基酸含量受到了影响,但是游离氨基酸含量总体仍呈上升趋势,这是由于试验咸蛋是低盐腌制,因此抑制作用不强。
图2 呈味氨基酸含量变化图
Fig.2 Change of flavor amino acid content during pickling
注:不同小写字母代表差异显著,P<0.05。
由图3可知,鲜味、甜味、芳香族氨基酸含量均在腌制的0～7 d变化量最大,鲜味氨基酸总量增加至9.81 mg/100 g,甜味氨基酸总量增加至8.30 mg/100 g,芳香族氨基酸总量增加至4.73 mg/100 g,苦味氨基酸在21～28 d变化量最大,由11.93 mg/100 g增加至13.85 mg/100 g,其次是0～7 d,由9.62 mg/100 g增加至11.01 mg/100 g。数据表明腌制第一阶段,是呈味氨基酸产生的关键阶段。
图3 腌制不同时间呈味氨基酸变化量
Fig.3 Changes of flavor amino acids at different times of pickling
由图4可知,咸鸭蛋黄在呈味特性上的规律为:苦味氨基酸>鲜味氨基酸>甜味氨基酸>芳香族氨基酸。在呈味氨基酸总量中苦味氨基酸含量占比最高,达33.15%,鲜味氨基酸含量占比28.08%,甜味氨基酸含量占比24.34%,芳香族氨基酸含量占比14.43%。
图4 腌制期间咸蛋黄呈味特性雷达图
Fig.4 Radar map of flavor characteristics of salted egg yolk during pickling
2.3.2 蛋黄游离氨基酸主成分分析
将咸蛋腌制过程中检测到的各种游离氨基酸作为自变量,对其进行主成分分析,得出主成分的相关矩阵特征值、方差贡献率以及累计贡献率,判断对于咸蛋滋味有主要贡献作用的氨基酸种类,结果如表2、图5所示。
表2 成分特征值、方差贡献率及累计贡献率
Table 2 Component eigenvalues, variance contribution rate and cumulative contribution rate
主成分特征值贡献率/%累积贡献率/%114.51261.01661.01621.03836.17397.18830.3822.38899.57640.0680.424100.00
图5 主成分分析碎石图
Fig.5 Principal component analysis gravel diagram
经主成分分析共提取4个主成分,前2个主成分的成分特征值均大于1,且累积贡献率高达97.188%,其中主成分1贡献率最大为61.016%,表明主成分1对咸蛋黄影响程度最大,故选取前2个主成分作为有效成分。主成分特征向量与载荷值矩阵如表3所示,载荷数值表示影响程度,正负表示方向。
表3 主成分特征向量与载荷矩阵
Table 3 Principal component loading matrix
氨基酸主成分1主成分2特征向量载荷值特征向量载荷值天冬氨酸AspA0.260.991-0.07-0.074苏氨酸Thr∗B0.230.8640.430.438丝氨酸SerB0.260.9760.140.147谷氨酸GluA0.260.994-0.06-0.065甘氨酸GlyB0.240.9260.300.308丙氨酸AlaB0.260.996-0.07-0.074缬氨酸Val∗C0.250.9640.080.080甲硫氨酸Met∗C0.190.7410.610.622异亮氨酸Ile∗C0.260.986-0.11-0.114亮氨酸Leu∗C0.250.937-0.15-0.149酪氨酸TyrD0.260.998-0.04-0.041苯丙氨酸Phe∗D0.260.992-0.08-0.084组氨酸HisB0.250.954-0.27-0.276赖氨酸Lys∗A0.240.896-0.43-0.437精氨酸ArgC0.260.988-0.08-0.082脯氨酸ProB0.261.000-0.02-0.021
各成分的载荷系数决定着咸蛋黄中各游离氨基酸对主成分影响程度大小,载荷系数越大,则该物质对主成分的贡献越大。由表3可知,第1主成分中除甲硫氨酸(Met)外,其余15种可检出游离氨基酸均有较高相关性(均大于0.8),其中相关性较为突出的是脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、异亮氨酸(Ile)(均大于0.98),为咸蛋的滋味提供了重要作用;对第2主成分贡献较大的物质是甲硫氨酸(Met)。因此,可认为检出的16种游离氨基酸均对咸鸭蛋蛋黄腌制过程中的滋味有贡献作用,但是脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、异亮氨酸(Ile)8种呈味氨基酸对咸鸭蛋黄的滋味影响最大。8种氨基酸中4种呈味氨基酸各占2种,鲜味氨基酸含量为7.62 mg/100 g,甜味氨基酸含量为3.9 mg/100 g,苦味氨基酸含量为5.54 mg/100 g,芳香族氨基酸含量为6.03 mg/100 g,鲜味氨基酸含量最高。分析结果表明,虽然苦味氨基酸在含量上高于鲜味、甜味、芳香族氨基酸(图2～图4),但咸鸭蛋黄中氨基酸的呈味是以鲜味为主,芳香族、苦味、甜味氨基酸为辅的共同作用。
2.3.3 不同腌制时间咸鸭蛋黄的综合评价
由于主成分分析中前2个指标反映了咸鸭蛋黄腌制过程中16种游离氨基酸信息的97.188%,因此利用主成分分析对不同腌制时间的咸蛋黄游离氨基酸进行综合评价可行。采用PCA法得到2个新综合指标Y1、Y2,得到其线性关系为:
Y1=0.26ωAsp+0.23ωThr+0.26ωSer+0.26ωGlu+0.24ωGly+0.26ωAla+0.25ωVal+0.19ωMet+0.26ωIle+0.25ωLeu+0.26ωTyr+0.26ωPhe+0.25ωHis+0.24ωLys+0.26ωArg+0.26ωPro
Y2=-0.07ωAsp+0.43ωThr+0.14ωSer-0.06ωGlu+ 0.30ωGly-0.07ωAla +0.08ωVal+0.61ωMet-0.11ωIleH-0.15ωLeu-0.04ωTyr-0.08ωPhe-0.27ωHis-0.43ωLys-0.08ωArg-0.02ωPro
式中,数字部分是特征向量值,ω+氨基酸名称缩写代表不同腌制时间各氨基酸的含量。
以2个主成分所对应的特征值占所提取主成分总的特征值之和的比例作为权重,构建主成分综合模型:Y=0.933Y1+0.067Y2,算出综合主成分值,即综合评分。由表4可知,随着腌制时间的延长,综合评分逐渐升高,评分最高的是腌制28 d的咸鸭蛋。
表4 不同腌制时间咸鸭蛋黄的成分得分和综合评价
Table 4 Component score and comprehensive evaluation of salted duck egg yolk at different pickling times
腌制时间/dY1Y2Y07.16-0.926.6278.50-1.237.86149.07-0.868.40219.44-1.678.702810.50-1.569.70
3 结论
在腌制过程中,咸鸭蛋黄所含的蛋白质相对含量显著升高,提高了1.23倍;在不同腌制时间咸鸭蛋黄中检测出的游离氨基酸种类相同,含有包括7种必需氨基酸在内的16种游离氨基酸,但是游离氨基酸总含量在不同腌制时间有显著性差异(P<0.05),28 d腌制结束的咸蛋黄总游离氨基酸含量相比于0 d提高了46.49%。0～7 d是呈味氨基酸上升最快的阶段,苦味氨基酸总含量最高,占总游离氨基酸含量的33.15%,鲜味氨基酸含量占比28.08%,甜味氨基酸含量占比24.34%,芳香族氨基酸含量占比14.43%。
对咸鸭蛋黄游离氨基酸进行主成分分析得出16种游离氨基酸对咸鸭蛋黄的滋味均有贡献作用,而脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、异亮氨酸(Ile)8种氨基酸对咸蛋黄滋味影响最大,其中鲜味氨基酸含量高于其余3种,咸鸭蛋黄中氨基酸呈味是以鲜味为主,甜味、芳香族、苦味氨基酸相辅的共同作用。
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