猕猴桃以其独特的风味和营养品质深受消费者的青睐。我国猕猴桃的种植面积和产量均位居世界第一[1]。随着猕猴桃产业由传统农业种植模式向现代化种植模式转型,其产量目前供大于求[2-3]。因此,加大猕猴桃精深加工产品的开发[4-5],对猕猴桃产业高质量快速发展具有很大的意义和前景。猕猴桃白酒作为猕猴桃精深加工产品之一,是猕猴桃经酵母发酵后再进行蒸馏而得到的水果白酒。香气特性作为评价白酒品质的重要指标之一,也可影响消费者的接受度和整体评价[6]。然而,目前关于猕猴桃酒的研究主要集中在酿造工艺优化[7-8]、酵母筛选[9-10]等方面,但不同酵母对猕猴桃白酒香气特性影响的报道较少。
气相色谱-离子迁移光谱法(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)结合了气相色谱和迁移色谱的双重优势,具有样品制备简单、分析时间短、灵敏度高等优点,已广泛应用于食品分析领域[11-13]。HE等[14]采用顶空气相色谱-离子迁移谱(headspace gas chromatography-mass spectrometry,HS-GC-IMS)对白酒蒸馏过程进行了表征,3D指纹图谱显示了不同蒸馏阶段挥发性化合物的变化。CHEN等[15]采用HS-GC-IMS结合化学计量学来检测白酒的年份。本文以猕猴桃为原料,5种不同商业酵母为发酵剂,酿造了猕猴桃白酒,并采用HS-GC-IMS检测其挥发性香气成分,通过主成分分析(principal component analysis,PCA)正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)等多元统计分析手段探究了猕猴桃白酒香气特性的差异,为猕猴桃白酒整体品质及其香气控制和提升提供了理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
猕猴桃(市售),江西新西蓝生态农业科技有限责任公司猕猴桃种植基地。酵母:申联发酵果酒曲(SLG),四川省申联生物科技有限公司;诺盟B酵母La Bayanus (La-Ba)、诺盟F酵母La Fruitee (La-Fr),帝伯仕酿酒设备有限公司;安琪果酒酵母SY款(SY)、安琪果酒酵母RW款(RW),湖北安琪酵母有限公司;FN502发酵营养剂,湖北安琪酵母有限公司。
1.1.2 试剂
C4～C9直链酮(AR),Sigma - Aldrich贸易有限公司(上海)。
1.2 仪器与设备
EL3002型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;破碎机、304不锈钢发酵罐20 L,东莞市酿哥机械设备有限公司、蒸馏器600 L,温州国都轻工机械有限公司;FlavourSpec®气相离子迁移谱联用仪,MXT-WAX毛细管色谱柱(15 m×0.53 mm×1 μm),德国G.A.S公司;20 mL顶空进样瓶,上海赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 猕猴桃白酒制备
工艺流程:猕猴桃→筛选→清洗→破碎→加酵母→调糖(→加营养剂)→装罐发酵→蒸馏→猕猴桃白酒
挑选一定质量、无破损,成熟度为八九成的猕猴桃鲜果,经清洗、破碎后待用。每1 kg猕猴桃加入0.25 g的商业酵母,使用前将酵母溶解在其质量10倍的温水糖中(35～40 ℃,含糖5%),搅拌均匀后,静置20～30 min完成活化。随后将活化好的酵母混入破碎的猕猴桃中,发酵24 h后加入猕猴桃质量1/10的白糖,随后继续发酵15 d,发酵温度不超过25 ℃。本试验在发酵第2天按照实际猕猴桃的质量加入营养剂,每1 000 kg猕猴桃加入营养剂200 g,搅拌均匀后继续发酵,当发酵液中还原糖含量低于2.5 g/L时终止发酵,过滤发酵液后蒸馏即得到本实验的猕猴桃白酒样品。
1.3.2 样品处理
样品以酵母名称命名,其中SLG、La-Ba、SY、RW和La-Fr为添加营养剂发酵的样品;SLG(-)和La-Ba(-)为未添加营养剂发酵的样品。分别称取1 g SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)、SY、RW、La-Fr样品于20 mL顶空瓶中,60 ℃,转速500 r/min孵育10 min后进样100 μL,进样温度85 ℃,每组样品取3次作为平行实验。
1.3.3 GC-IMS测试猕猴桃白酒挥发性香气物质
GC参数:色谱柱MXT-WAX(15 m×0.53 mm×1 μm),柱温60 ℃;载气为高纯N2(99.999%);载气流速0～2 min内保持2 mL/min,2～10 min内线性增长为10 mL/min,10～20 min内增长为100 mL/min,随后以100 mL/min流速继续保持20 min。
IMS参数:β射线,氘源,正离子化模式;温度45 ℃;漂移气为高纯N2(99.999%),流速为150 mL/min。
1.4 数据处理
采用配套软件GC × IMS Library Search(内置NIST数据库、IMS数据库)对化合物进行定性分析;系统自带Reporter插件对比样品之间的谱图差异,Gallery Plot插件用于指纹图谱对比;SPSS 24.0软件对数据进行处理,实验结果以平均数±标准差表示;Origin 2021绘图;TBtools绘制热图与聚类热图;通过SIMCA 14.1软件进行PCA、OPLS-DA分析,计算预测变量重要性投影(variable importance in projection, VIP)。
2 结果与分析
2.1 猕猴桃白酒GC-IMS光谱对比分析
采用HS-GC-IMS对7组猕猴桃白酒香气成分进行分析,图1为Reporter插件制作的二维俯视图(图1-a、图1-b)和差异化谱图(图1-c、图1-d)。在二维俯视图中,迁移时间和反应离子峰(RIP)均归一化处理,反应离子峰右侧的每一个点代表一种挥发性有机物,颜色表示其浓度。由图1-a和图1-b可知,7种猕猴桃白酒挥发性成分相似度较高,大多数信号出现在保留时间200～750 s,漂移时间1.0～1.7 s的范围内,这说明不同发酵条件下的猕猴桃白酒挥发性香气成分组成相似。
a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr二维俯视谱图;b-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)二维俯视谱图;c-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr差异化谱图;d-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)差异化谱图
图1 猕猴桃白酒GC-IMS谱图
Fig.1 GC-IMS spectrum of kiwifruit liquor
为了更好地比较不同酵母以及营养剂对猕猴桃白酒香气的影响,以SLG为参照谱图,并将其与其他样品的谱图进行比较,得到差异化谱图(图1-c、图1-d)。图1-c中不同酵母发酵条件下,SY和RW与SLG相比,挥发性物质浓度较高,其次是La-Ba;La-Fr挥发性物质浓度与SLG较为相似。图1-d中,在未添加营养剂的条件下,SLG(-)的红色面积高于SLG,La-Ba(-)与La-Ba也存在明显差异。可以看出,不同猕猴桃白酒样品之间的挥发性香气化合物含量仍然存在差异,这反映在位置、数量和相应的峰强度上。
2.2 挥发性香气化合物的鉴定
为了更直观地表现出不同样品挥发性物质的变化规律,借助Gallery Plot插件来绘制挥发性物质的指纹谱图。如图2所示,在7组猕猴桃白酒样品中,共检测出45种信号峰,已定性出33种挥发性物质(表1),其中包含酯类12种、醇类5种、酮类6种、醛类5种、呋喃类3种、其他类2种,未定性化合物12种。
表1 猕猴桃白酒挥发性物质定性分析
Table 1 Qualitative analysis of volatile compounds in kiwifruit liquor
序号化合物CAS#分子式分子质量保留指数文献参考值保留时间/s迁移时间/ms1辛酸乙酯C106321C10H20O2172.31 4541 452[16]1 144.3591.486 462乳酸乙酯C97643C5H10O3118.11 360.61 350.4[17]935.2691.535 883己酸乙酯C123660C8H16O2144.21 245.61 237[17]733.7831.797 794乙酸异戊酯C123922C7H14O2130.21 137.91 125.9[17]549.0821.741 395丁酸乙酯C105544C6H12O2116.21 050.91 040.9[17]418.9741.554 976乙酸异丁酯C110190C6H12O2116.21 027.81 020.2[17]391.6291.609 747甲酸异戊酯C110452C6H12O2116.21 066.7/438.6691.645 238乙酸丙酯C109604C5H10O2102.1994.2986[16]355.5641.475 8192-甲基丙酸乙酯C97621C6H12O2116.2980.1/344.4061.559 7610丙酸乙酯C105373C5H10O2102.1973.6963[16]339.3681.454 1911乙酸乙酯C141786C4H8O288.1904.3895.9[17]290.1931.333 1512乙酸甲酯C79209C3H6O274.1834.3832[16]247.7841.196 3913异戊醇DC123513C5H12O88.11 222.8/700.2761.494 4314异戊醇MC123513C5H12O88.11 224.51 229[16]702.7251.243 1415正丁醇C71363C4H10O74.11 160.51 147.2[17]592.0881.388 5916异丁醇C78831C4H10O74.11 109.31 101[16]499.3561.377 45172-丁醇C78922C4H10O74.11 0401 028[16]405.851.340 14183-羟基-2-丁酮C513860C4H8O288.11 298.21 295.6[18]817.4191.329 98193-辛酮C106683C8H16O128.21 289.8/803.1631.306 9120二乙基酮C96220C5H10O86.1997.4/358.4461.357 921环戊酮C120923C5H8O84.11 145.5/563.1341.326 1722丙酮C67641C3H6O58.1837.7838.5[18]249.6711.112 0723甲乙酮C78933C4H8O72.1914.5/296.9681.240 08242-丁烯醛C123739C4H6O70.11 068.2/440.6131.047 7325丁醛C123728C4H8O72.1916.2907[16]298.1381.285 3826丙醛C123386C3H6O58.1821.9809[16]240.9311.143 18
续表1
注:“/”表示未查询到参考数值。
序号化合物CAS#分子式分子质量保留指数文献参考值保留时间/s迁移时间/ms27异丁醛C78842C4H8O72.1832.3836.1[19]246.6641.278 1728异戊醛C590863C5H10O86.1927.7923.6[19]305.9291.406 329糠醛C98011C5H4O296.11 496.71 490[16]1 255.0321.089 97302-正丁基呋喃C4466244C8H12O124.21 117.41 119[16]512.9451.175 33312-乙基呋喃C3208160C6H8O96.1962/330.6251.055 1832四氢呋喃C109999C4H8O72.1849.5846.1[18]256.4241.209 8333环己烷C110827C6H1284.2732.7/196.941.223 99
a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr样品指纹谱图;b-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)样品指纹谱图
图2 猕猴桃白酒挥发性物质指纹谱图
Fig.2 Fingerprint of volatile compounds in kiwifruit liquor
从图2中可以看出不同发酵条件下的猕猴桃白酒挥发性物质含量存在明显差异,在红色区域A中,SLG样品乙酸丙酯、2-丁醇、甲酸异戊酯、丁醛、甲乙酮、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、2-甲基丙酸乙酯、丙酸乙酯的含量远远高于La-Ba、SY、RW、La-Fr样品;而区域B中,SY和RW在糠醛、3-羟基-2-丁酮、乳酸乙酯、3-辛酮、丙醛、2-乙基呋喃、正丁醇、辛酸乙酯、2-正丁基呋喃的含量较高;La-Fr样品则在区域C处的物质含量高于其他样品,如己酸乙酯。因此,酵母的种类对猕猴桃白酒特征香气物质有较大的影响。
此外,营养剂对猕猴桃白酒香气的影响如图2-b所示,对于SLG酵母而言,营养剂的添加与否对样品香气影响程度较大,从图2中明显可以看出,SLG和SLG(-)两组样品在区域D、区域E中物质含量具有较大差异,如区域D中的物质主要为甲酸异戊酯、2-丁醇、2-甲基丙酸乙酯、丁醛、乙酸丙酯、己酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯、甲乙酮、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯,以酯类物质为主,这些物质在SLG样品中含量较多,说明SLG样品相比于SLG(-)具有更浓郁的果香和花香。而在区域E中,未添加营养剂的样品SLG(-)则含有更多的糠醛、乳酸乙酯、3-辛酮、正丁醇、环戊酮、异戊醛。对于La-Ba酵母而言,营养剂的影响并不明显,但也存在一定的差异性,如F区域所示,未添加营养剂的样品La-Ba(-)中3-羟基-2-丁酮、2-正丁基呋喃、2-乙基呋喃的含量大于La-Ba样品。当然,无论何种发酵条件,7组猕猴桃白酒中都含有大量的异戊醇和异丁醇(图2黄色区域),这赋予了猕猴桃白酒水果香、甜香和醇香。
2.3 香气化合物分析
图3为猕猴桃白酒香气化合物的相对含量柱状图(图3-a)与热图(图3-b)。从柱状图中可以发现,7种猕猴桃白酒中醇类与酯类物质为主要贡献成分,能够为猕猴桃白酒提供果香、花香与甜味[20-21]。SLG、La-Fr猕猴桃白酒中酯类物质相对含量大于醇类物质,而La-Ba、SY、RW猕猴桃白酒其结果正好相反。此外,营养剂对猕猴桃白酒香气物质的影响也有差别。例如,在添加营养剂的情况下,SLG白酒样品中酯类物质相对含量大于醇类,而未添加营养剂时,SLG(-)样品中醇类物质相对含量却远大于酯类物质。但是,营养剂对酵母La-Ba似乎影响不大,无论添加与否,2种白酒样品的醇类物质含量均大于酯类物质,这与指纹谱图中描述的结果相符。从热图(图3-b)中可发现,7种猕猴桃白酒中含量较多的酯类物质为乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸乙酯,这些酯类物质赋予猕猴桃白酒浓郁的果香与花香,醇类物质主要为异戊醇和异丁醇,且与其他香气物质相比含量更高,另外丙酮、2-丁烯醛的含量也较高,共同构建了猕猴桃白酒的风味。
a-柱状图;b-热图
图3 猕猴桃白酒中香气化合物百分比柱状图与热图
Fig.3 Percentage histogram and heat map of aroma compounds in kiwifruit liquor
2.4 多元统计分析
2.4.1 猕猴桃白酒挥发性香气PCA
基于猕猴桃白酒香气物质数据进行PCA,以揭示样品间的规律性和差异性。首先,对变量为不同酵母的5组猕猴桃白酒样品进行分析,如图4-a、图4-b所示,在得分图(图4-a)中可以看出,PC1和PC2分别占总方差的44.8%和28.0%,前2个主成分的累积贡献率达72.8%,这表明它们足以解释数据中的总方差。其中SY、RW样品位于第一象限,SLG、La-Fr、La-Ba样品分别位于第二、三、四象限,说明5组样品间香气具有较大的差异,能够很好地区分。此外,从载荷图(图4-b)中能够发现,位于第一象限的3-辛酮、3-羟基-2-丁酮、乳酸乙酯、2-乙基呋喃、2-丁基呋喃、正丁醇在SY和RW样品中含量较高;而第二象限的2-丁醇、丁醛、甲酸异戊酯、乙酸丙酯则在SLG样品中含量较高;同理,La-Fr样品中富含异戊醇M、乙酸乙酯;而异戊醛、2-丁烯醛、异丁醇位于右下角,意味着La-Ba样品中这3种香气物质含量较高。
a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr样品得分图;b-载荷图;c-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)样品得分图;d-载荷图
图4 猕猴桃白酒香气物质的PCA
Fig.4 PCA of aroma compounds in kiwifruit liquor
其次,研究营养剂对猕猴桃白酒香气的影响,在得分图(图4-c)中可以看出,营养剂的添加情况对样品的香气具有很大的影响,样品之间有效区分,PC1和PC2累计贡献率高达86.7%,结合载荷图(图4-d)可以发现,未添加营养剂的样品La-Ba(-)含有较多的2-正丁基呋喃、辛酸乙酯,SLG(-)样品则富含异戊醛、异丁醇、丙酮、糠醛。综上结果表明,不同的发酵条件导致了猕猴桃白酒香气成分的显著差异。
2.4.2 猕猴桃白酒挥发性香气OPLS-DA
OPLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法,能够建立物质表达量与样本间关系模型,来实现对样本类别的预测[22]。如图5所示,根据7组猕猴桃白酒样品挥发性香气物质建立OPLS-DA模型,其中图5-a～图5-c用于分析不同酵母对猕猴桃白酒香气的影响,图5-d～图5-f用于分析营养剂对猕猴桃白酒香气的影响。如图5-a所示,5组猕猴桃白酒样品间均能有效区分,显示了与PCA相同的结果,其中该模型累计贡献率占85.7%,R2X=0.988,R2Y=0.997,Q2=0.992,当R2和Q2处于0.5～1时,说明该模型有较好的预测能力[23],可以用于区分不同酵母发酵的猕猴桃白酒样品。此外,还对模型进行了置换检验(n=200),以评估判别模型是否对数据过度拟合,如图5-b所示,左侧的所有绿色R2值和蓝色Q2值都低于右侧的原始点,且Q2点的回归线与垂直轴(左侧)截距为负数,说明该模型没有过度拟合,预测能力较好,能够用于不同酵母对猕猴桃白酒香气影响的判别分析。同样,对SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)这4组样品数据建立OPLS-DA模型,如图5-d所示,4组样品组内重复性良好,组间具有明显差异,前2个主成分累计贡献率占95.1%,R2X=0.996,R2Y=0.998,Q2=0.997,模型稳定性良好。从图5-e可以发现,Q2回归线与纵坐标轴的截距小于零,表示模型不存在过拟合,模型验证有效,因此认为该结果可用于研究发酵营养剂对猕猴桃白酒香气的影响。
a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr样品得分图;b-模型验证;c-VIP值;d-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)样品得分图;e-模型验证;f-VIP值
图5 猕猴桃白酒香气物质OPLS-DA
Fig.5 OPLS-DA of aroma compounds in kiwifruit liquor
此外,将33种挥发性物质对猕猴桃白酒香气的贡献进行VIP量化分析,在图5-c红色框中可以看出,以不同酵母发酵的猕猴桃白酒,VIP>1的特征化合物分别为乙酸异戊酯、乙酸乙酯、异丁醇、2-丁醇、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、二乙基酮、2-甲基丙酸乙酯;而在营养剂的影响下(图5-f),有10种VIP>1的特征化合物,分别为乙酸异戊酯、乙酸乙酯、异丁醇、2-丁醇、正丁醇、乙酸异丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯、环戊酮、2-正丁基呋喃。为了使结果更具说服力,并使选定的关键香气物质更具代表性,将2个VIP值结果共同的化合物作为最终特征化合物,即乙酸异戊酯、乙酸乙酯、异丁醇、2-丁醇、乙酸异丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯被鉴定为在不同发酵条件下有助于区分猕猴桃白酒样品的香气。
2.5 聚类热图分析
如图6所示,为了更好地了解猕猴桃白酒样品间的差异性和相似性,通过初步鉴定的7种特征香气化合物对变量为不同酵母以及营养剂的猕猴桃白酒进行聚类分析。在不同酵母发酵条件下(图6-a),依据7种特征香气化合物可将SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr白酒样品大致分为两大类,即样品RW、La-Ba、SY和样品SLG、La-Fr,该结果与PCA和OPLS-DA相同。同样,对SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)4组白酒样品进行聚类分析,结果如图6-b所示,4组样品可分成3类,与上述多元统计分析结果相符。因此,可初步认为乙酸异戊酯、乙酸乙酯、异丁醇、2-丁醇、乙酸异丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯为猕猴桃白酒特征香气物质。
a-SLG、La-Ba、SY、RW、La-Fr样品聚类热图;b-SLG、SLG(-)、La-Ba、La-Ba(-)样品聚类热图
图6 猕猴桃白酒聚类热图
Fig.6 Cluster heat map of kiwifruit liquor
3 结论
为了探究不同酵母以及营养剂对猕猴桃白酒香气的影响,本实验采用HS-GC-IMS并结合多元统计策略对其进行分析。结果表明,不同发酵条件下猕猴桃白酒的香气成分组成相似,但在含量上存在差异。GC-IMS共定性出33种挥发性香气物质,其中酯类12种、醇类5种,7组猕猴桃白酒样品均以酯类和醇类物质为主。以不同酵母为变量条件下,SLG与La-Fr样品中酯类物质含量大于醇类物质,而La-Ba、SY、RW样品则结果正好相反,说明发酵酵母能够显著影响猕猴桃白酒风味。对比SLG与SLG(-)样品的指纹谱图,其在酯类与醇类物质含量上存在明显不同,而La-Ba与La-Ba(-)结果较为相似,这说明营养剂对不同酵母的作用程度不同,进而改变猕猴桃白酒品质。PCA与OPLS-DA结果表明,猕猴桃白酒样品间存在显著差异,根据VIP值>1,初步鉴定出了7种特征香气物质:乙酸异戊酯、乙酸乙酯、异丁醇、2-丁醇、乙酸异丁酯、二乙基酮、丁酸乙酯,并用这7种特征香气物质对不同发酵条件下的猕猴桃白酒分别进行聚类分析,结果与PCA和OPLS-DA一致,说明这7种香气物质能够被初步鉴定为猕猴桃白酒的特征香气物质,为探究酵母以及营养剂对猕猴桃白酒的香气影响提供了理论参考。
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