随着生物实验科技的更新迭代以及对于人体生理健康研究的不断深入,对于人体运动后疲劳状态下自由基生物学的探索受到来自于多个学科领域科研人员的普遍重视。目前对于运动康复实践尤其在生理机能提升的恢复训练阶段,通常以有氧耐力性运动作为主要手段[1-2]。由此分析,产后腰痛患者在运动康复过程当中,承受来自于病理部位生理机能恢复机制、运动行为超量恢复机制的双方面影响,虽不比针对某一肌群的大运动强度刺激所形成运动疲劳的生理变化明显,但产后腰痛患者通过以人体核心区域为协调的较长时间有氧运动,消耗更多的人体储备能量大幅提升每分摄氧量,是其运动生理代谢水平增长的重要体现,也是造成运动疲劳积累的另外一种表现,并且会在体内产生大量活性氧自由基,造成脱氧核糖核酸主链断裂、细胞发生异变、病变等,极易造成产后腰痛患者的二次损伤[3-4]。
铁棍山药(Dioscorea opposita Thunb.cv.Tiegun)为薯蓣科薯蓣属植物,其块茎使用方式通常分为食用和药用两种,其在中国产地集中于河南省焦作市温县、沁阳市、武陟县等地,中医学中对于铁棍山药的功效表述为健脾养胃、滋肾养肺等。铁棍山药包含了多糖、皂苷、多酚氧化酶、自由氨基酸等丰富的生物活性物质以及多种微量元素,对于人体能够起到良好的降低血糖血脂、提升免疫能力、调节激素代谢紊乱、促进组织器官生理损伤的机能康复与提升等作用,而铁棍山药富含的多糖物质被视为构成的主要活性成分,其作用价值在药学领域以及营养补充领域当中备受关注[5]。
铁棍山药的多糖提取通常选用水提醇沉法[6],产生了微波、纤维素酶等多糖提取方法。铁棍山药的多糖结构较为复杂,其生物活性与结构呈线性关系,因此提取方法的差异会造成多糖得率、提取成分、生物活性等直观的结果影响。目前对于铁棍山药多糖提取,以及铁棍山药作为营养补充干预运动后抗氧化和疲劳恢复相关研究成果较少,客观限制了铁棍山药多糖活性的应用与推广[7]。本研究以铁棍山药作为研究对象,通过水提醇沉法、微波辅助提取法、纤维素酶法、微波-酶法分别进行铁棍山药的多糖提取,并且对不同提取结果进行体外抗氧化性能测试,将不同方法提取结果配制饮品作为受试对象运动康复训练的补充剂,通过双盲试验方法,受试者于训练后及次日晨通过血液指标的采集,实现对铁棍山药抗氧化及抗运动疲劳的科学验证。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
铁棍山药,购于河南省焦作市温县;羟自由基试剂盒、超氧阴离子试剂盒、丙二醛测试盒、超氧化物歧化酶测试盒,上海酶联生物科技有限公司;无水乙醇、葡萄糖等均为分析纯、DPPH、纤维素酶、α-淀粉酶,北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
匀浆机,上海欧河设备有限公司;电子天平,天津市德安特传感技术有限公司;水浴锅、干燥箱,常州亿通分析仪器有限公司;722S分光光度仪,上海棱光技术有限公司;MAS-II Plus常压微波反应工作站(满足微波提取实验功率与温度的即刻监控与调节),上海新仪微波化学科技有限公司;Pilot2-4LD冷冻干燥机,天津中斯立孚生物技术有限公司;H1850离心机,深圳三莉科技有限公司;RE-52A旋转蒸发器,郑州华辰仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 铁棍山药多糖提取及处理方法
筛选出外形完整的铁棍山药进行表面清水处理后去除外皮,以2 mm为标准进行切片,避免因实验周期问题导致实验样本发生褐变,使用1 g/L柠檬酸以及0.2 g/L维生素C溶液对切片护色30 min,然后冷冻并且研磨粉碎后过80目筛备用。
(1)水提醇沉法[6]:按照料液比1∶9 (g∶mL)进行混合,80 ℃恒温水浴静置240 min,8 000 r/min离心15 min,去除上清液。所获得的沉淀物经过旋转蒸发仪浓缩,依据1∶5(体积比,下同)的配比融入80%乙醇同时进行24 h的醇沉,最后以离心方式获取沉淀部分并且完成干燥处理,即可得到山药多糖。(2)微波辅助提取法[8]:将微波仪器设置功率为650 W,60 min,实验料液比为1∶12 (g∶mL);80 ℃恒温水浴240 min后,8 000 r/min离心15 min,以1∶5比例加入80%乙醇后静置24 h,通过离心方式进行沉淀提取与干燥。(3)微波-酶剂协同提取法[9]:实验料液比设定为1∶6(g∶mL)、微波仪器功率830 W、150 min,酶添加量为0.5 g淀粉酶、0.05 g纤维素酶(50 g山药粉末),85 ℃恒温水浴过程当中进行缓慢搅动加快溶解速度,8 000 r/min离心15 min,以1∶5比例加入80%乙醇后静置24 h,通过离心方式进行沉淀提取与干燥。(4)纤维素酶提取法[10]:酶添加量为3%、酶解时间设置为75 min、酶解温度设置60 ℃、料液比1∶30(g∶mL)、0.05 g纤维素(50 g山药粉末),恒温水浴过程当中进行缓慢搅动加快溶解速度,8 000 r/min离心15 min后以1∶5比例加入80%乙醇后静置24 h,通过离心方式进行沉淀提取与干燥。
以水提醇沉法为例,铁棍山药进行多糖提取得率的计算方式如公式(1)所示:
山药多糖得率/%=ρ×V/(m×10)×100
(1)
式中:ρ,提取结果当中多糖的质量浓度,μg/mL;V,提取结果的体积,mL;m,铁棍山药粉添加的质量,g。
1.3.2 铁棍山药多糖提取浓度的测定
使用苯酚-硫酸法测定研究当中所采用的不同方法提取后铁棍山药多糖含量[11]。添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL质量浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液,用蒸馏水定容至2 mL,不添加葡萄糖的对照管用于对照调零。在490 nm处测定各管的吸光值,以葡萄糖质量浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线为y=10.616x-0.021,R2=0.997。
1.3.3 铁棍山药多糖的抗氧化能力
经过4种提取方式进行铁棍山药多糖的提取后,依据提取顺序进行体外DPPH自由基、·OH的清除能力检测[12-13],记录铁棍山药不同提取方法及不同浓度多糖对体外抗氧化能力结果的数据[14-15]。
1.3.4 运动后氧自由基消除及抗疲劳能力
以水提醇沉法、微波辅助提取法、微波-酶剂协同提取法、纤维素酶提取法完成铁棍山药多糖提取,配制营养补充剂并且依次划分试验组,共分为试验组A、B、C、D组、对照组1组,每组人数12人,共60人,产后腰痛患者受试者统计年龄为(30±1.26)岁。通过双盲试验研究,在进行封闭式运动康复28 d过程中,参照GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》并且依据试验不同提取方法配制剂量为200 mg/kg体重的铁棍山药提取液,对受试者进行不间断康复训练后补充,对照组康复训练后以同体积的水替代。在每日膳食搭配当中排除番茄、胡萝卜、山竹等目前研究成果显示抗氧化能力较强食物,并且除铁棍山药补充剂外不再进行其他营养剂摄入。
所有测试组在周期内运动康复皆采取有氧耐力性运动作为训练手段,受试者、测试人员与教练员对于每日练后营养补充剂成分皆不清楚。由于运动康复整体周期变化也是受试人员身体机能恢复到提高的过程,因此在产后腰痛患者运动康复周期内,前期训练会导致体能供能物质的过量消耗,对于受试者抗氧化能力与抗疲劳能力的测试会存在显著误差,所以对于抗氧化与抗疲劳监控安排在康复周期最后一周的周二、周五,进行10 km/h的50 min匀速耐力跑训练,于康复训练的当日清晨、次日清晨以及训练后第2天清晨对所有受试人员进行空腹状态下血清睾酮和血清肌酸激酶数据采集,在最后一日的康复训练前、后即刻采集静脉血进行血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测试。
2 结果与分析
2.1 四种提取方法铁棍山药多糖得率统计
运用4种不同工艺对山药多糖进行提取,重复3次并计算平均数值,对铁棍山药多糖得率如表1所示。以水提醇沉法为参照,微波辅助提取法、纤维素酶法、微波-酶法的多糖得率均显著提高,并且节约了提取时间,这也说明在铁棍山药的多糖提取过程中对于细胞壁的破坏是影响多糖得率的重要影响因素。
表1 不同提取方法对铁棍山药多糖得率的影响
Table 1 Effect of different extraction methods on polysaccharide yield of D.opposita Thunb.cv.Tiegun
提取方法多糖得率/%提高/%提取时间/min水提醇沉法7.54±0.082/240微波辅助提取法9.30±1.00323.3460微波-酶提取法13.83±0.98183.42150纤维素酶提取法11.55±0.10853.1875
铁棍山药的多糖物质多存储于细胞内部,而铁棍山药细胞壁为纤维素、果胶等物质构成,因此能够采用添加单一的酶制剂,例如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等,或以添加复合酶等制剂均能达到提升铁棍山药细胞壁裂解的功效[6,16],进而促进提取过程当中多糖的释放。铁棍山药通过采用微波-酶剂协同提取法所获得多糖得率为13.83%,在各提取方法中得率最高的,相对于水提醇沉法所获得多糖得率提升了83.42%,且反应用时缩短90 min。此外微波辅助提取法(9.30%)与纤维素酶提取法(11.55%)相比较而言,后者铁棍山药多糖得率较高,这表明在反应过程中酶剂对于铁棍山药细胞壁裂解的效果优于机械式破壁。
与水提醇沉法相比,微波辅助法的铁棍山药多糖得率仅小幅提升,也表明微波作用在一定程度上也可能会造成铁棍山药多糖降解,从而破坏多糖结构,客观的导致铁棍山药多糖的生物活性降低。
2.2 铁棍山药多糖提取杂质去除方法
铁棍山药多糖提取物中主要杂质为蛋白类及酚类,为避免因杂质产生的误差,提取后采用Sevag法去除蛋白类杂质[17],在完成8次除杂操作之后,利用紫外光谱扫描提取物,波长260和280 nm处无吸收峰,则说明蛋白类杂质已被清除。使用Folin-Ciocalteu试剂检测酚类物质残留[18-19],呈阴性则说明提取物中无酚类杂质。
2.3 铁棍山药多糖体外抗氧化活性比较
2.3.1 铁棍山药多糖清除DPPH自由基的能力
如图1所示,对DPPH自由基清除能力的量效关系相关性较好,随着多糖浓度的提升清除活性增强。多糖质量浓度2 mg/mL时,水提醇沉法的体外DPPH自由基的清除率为69.32%,微波辅助法的清除率为83.11%,微波-酶法及纤维素酶法清除统计结果分别为94.51%和88.21%。将多糖质量浓度调至3 mg/mL时,纤维素酶、微波辅助酶2种提取方法的DPPH自由基清除率都超过了92%。
图1 不同提取方法铁棍山药多糖的DPPH自由基清除能力
Fig.1 DPPH free radical scavenging activity of polysaccharide from D.opposita Thunb.cv.Tiegun by different extraction methods
2.3.2 铁棍山药多糖清除·OH的能力
山药多糖分子末端的半缩醛羟基能还原自由基。如图2所示,微波-酶协同法提取多糖的·OH清除能力最突出,而水提醇沉法提取的多糖效果最差。多糖质量浓度2 mg/mL时,水提醇沉法提取多糖的·OH清除能力为65.01%,微波辅助提取法为75.04%,微波-酶提取法及纤维素酶提取法为88.56%和87.83%,不同浓度下2组差异不明显。多糖质量浓度3 mg/mL时,纤维素酶提取法以及微波-酶提取法多糖对·OH的清除能力均超过95%。
图2 不同提取方法所得铁棍山药多糖的·OH清除能力
Fig.2 ·OH Scavenging activity from D.opposita Thunb.cv.Tiegun by different extraction methods
2.4 铁棍山药多糖的抗疲劳比较
如表2所示,有氧耐力运动对产后腰痛受试人员的MDA下降水平影响较大,4组试验受试者训练后即刻完成血清MDA值采集,相比安静状态时MDA下降非常显著(P<0.01),对照组运动后血清MDA值与安静状态时同样呈现出下降趋势,具有显著差异(P<0.05)。而训练后即刻采集血清的SOD值均呈明显上升趋势,并且具有极显著差异(P<0.01)。
表2 运前后不同组血清MDA、SOD变化
Table 2 MDA and SOD in different experimental groups before and after transportation
组别采样时间MDA/(nmol/mL)SOD/(nmol/mL)试验组A安静状态4.83±0.9157.68±13.07训练后3.97±0.6383.93±10.28试验组B安静状态5.12±0.6756.82±11.84训练后3.86±1.1986.57±9.63试验组C安静状态4.91±0.6459.66±12.35训练后3.16±0.5997.35±10.63试验组D安静状态5.01±1.0360.47±13.82训练后3.24±0.4696.16±9.47对照组安静状态4.75±0.8659.15±12.16训练后4.27±0.7372.41±10.37
所有试验组的受试者在2次单周长时间亚极量康复运动后,次日晨采集血清肌酸激酶的增长幅度皆比较明显,康复训练后第二日晨的测试结果也呈继续下降的趋势,在第二次康复运动前基本恢复到基础值,如图3所示,试验组C、D两次恢复速度非常显著,分别为53.07%、51.82%和55.78%、49.75%,但2组受试人员血清肌酸激酶恢复速度差异并不明显。对照组血清肌酸激酶恢复速度相对较慢,次日晨恢复速度分别为28.26%和28.61%。
图3 不同试验组康复训练晨间血清肌酸激酶变化情况
Fig.3 Morning serum creatine kinase test in different experimental groups
如图4所示,在单周2次长时间亚极量康复运动后,次日晨采集血清睾酮下降幅度皆比较明显,在训练结束后第二日晨间4个试验组上升幅度均较大,第2次康复运动前血清睾酮采集结果显示,4个试验组不仅恢复到正常值,并且表现出不同超量恢复现象,恢复速度分别为62.27%、57.39%、65.88%、63.23%,两次测量结果组间差异不显著。对照组血清睾酮恢复速度较慢,并且在第2次康复运动前没有表现出超量恢复现象,仍然处于恢复期。
图4 不同试验组康复训练晨间血清睾酮变化情况
Fig.4 Morning serum testosterone test in different experimental groups
3 讨论
在日常生活当中,人体内环境能够满足氧自由基动态平衡,并且在正常范围内能够实现生理免疫功能以及体内信号传递功能等。目前对于动物及人体的氧自由基运动变化研究多集中于单次高强度活动后即刻水平,生物体的清除能力很难继续维持体内氧自由基的稳定状态。从生理学研究角度分析,骨骼肌的运动主要依靠肌细胞内K+、Na+、Ca2+的流动,随着运动时间的延长,人体抗氧化能力减弱,细胞蛋白质多肽链断裂,发生结构变化,碱基丧失,形成细胞畸变,此外骨骼肌细胞膜的磷脂双分子层结构会与氧自由基发生过氧化反应,使细胞膜通透性发生改变,细胞膜内外电位失衡大量Ca2+堆积,从而抑制细胞进行ATP合成,最终肌纤维失去控制能力,形成炎症变化以及痉挛状态,导致运动损伤与疼痛加剧[20-21]。
铁棍山药多糖的主链主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖构成[6],对于氧自由基的清除作用主要是通过羟基提供的H+[22-23],结合体内游离的·OH消除;此外铁棍山药多糖中不同单糖、糖苷键、构型会对人体DPPH自由基清除能力有一定影响,但清除能力均较强[5],并且有效激活、快速提升SOD的活性,降低脂质过氧化物MDA、总胆固醇等的整体水平[24],以此实现对细胞内氧自由基数量的控制,加快人体对运动后抗氧化应激的反应时间。
本研究中铁棍山药多糖得率最高为微波-酶剂提取法(13.83%),其次分别为纤维素酶提取法、微波辅助提取法和水提醇沉法。不同方法提取的铁棍山药多糖均具有较高的体外抗氧化活性,且在浓度范围内呈现浓度依赖性。其中,由微波-酶剂协同提取法获得的多糖DPPH自由基、·OH清除能力最强,在多糖质量浓度3 mg/mL时,对DPPH自由基清除率达到96.37%、·OH清除率为95.32%。采用微波-酶剂提取法多糖的抗氧化活性大于微波辅助法,微波辅助酶提取法效率优势明显,其在酶制剂裂解细胞壁的基础上,通过微波共同作用实现效果递增优势,由于淀粉酶和纤维素酶能够结合微波机械作用,以相对温和的方式裂解铁棍山药细胞壁,客观提升了铁棍山药细胞内部的水分及极性物质热量生成速率,导致其对细胞壁的压力增加进而加速细胞破裂,达到对溶出多糖成分提取的效果。因多糖提取工艺不同,在制备条件、操作等外界因素影响下,对铁棍山药多糖的提取也会造成差异,此外,微波的非热效应对化学键也会产生作用,有几率导致减弱亦或者发生断裂,降解为单糖、低聚糖等被筛除。铁棍山药多糖包含单糖种类较多,提取工艺所造成的单糖组成以及摩尔比差异会直观影响提取多糖的活性,而目前相关研究结论并不统一,因此对于此类表征实验研究仍有广阔的潜力与空间。
而微波-酶剂提取法与纤维素酶提取法多糖体外抗氧化活性无显著差异,表明微波可促进铁棍山药多糖提取,但是同时可能会对铁棍山药提取多糖的活性产生影响。采用纤维素酶法的提取过程较微波处理更加温和,其能够降低机械提取所造成多糖的降解率,使多糖具有更高抗氧化性。此外,纤维素酶提取法提取周期较短,且所需的设备相对简单,最终多糖得率也较高(>11.0%)。但对于酶剂的类别、使用剂量则需要进行反复筛选,从经济性以及实用性角度考虑要尽量减少不必要的损耗。
在对人体实施不同运动强度、运动量的刺激之后,皆会引起体内氧自由基的增加[25-26],其增长幅度直接取决于运动强度和量的整体关系,也有研究表明在非高强度、大量运动刺激下,人体的血清MDA、SOD值与安静状态下无差异[16,27]。试验组受试者会随着训练量的不断叠加最终形成运动强度的刺激,从而导致体内抗氧化酶得到迅速动员,如表2所示,试验组C、D的SOD水平显著上涨,分别为63.17%、59.02%,可平衡体内大量生成的氧自由基,因此所有受试者训练后MDA水平均降低。抗氧化趋势与体外抗氧化能力的结果基本相符。依据试验组血清肌酸激酶与血清睾酮的测试结果分析,对产后腰痛患者进行亚极量有氧耐力康复运动,并且进行不同铁棍山药多糖提取液补充,试验组与对照组患者都表现出了显著的运动恢复水平,这与针对性的康复运动手段有直接关系,从短期效果看试验组患者表现出更快速的恢复能力,并且身体机能在训练后第二日呈现出不同的超量恢复状态,尤其以微波-酶提取法配制的营养补充剂干预(试验组C)效果最为明显,血清肌酸激酶2次训练后次日晨分别下降53.07%、55.78%,血清睾酮的训练后第2日晨上升65.88%。但总体而言,4个试验组间恢复的差距并不明显,也客观说明试验组产后腰痛患者在运动康复后期,具备了一定的连续运动能力。
此外,本研究对于女性产后腰痛进行运动康复4个试验组进行28 d不间断训练后铁棍山药多糖提取液营养补充,不仅弥补了运动当中水分的流失,也满足了受试者运动恢复过程中糖的即刻摄入,同时补充剂的口感、味道也对受试者运动后神经疲劳以及本能的运动抗拒心理起到缓解作用[28]。更短周期的运动机能水平恢复不仅帮助患者能够以更积极的心态参与到运动康复训练当中,也能够帮助患者在超量恢复的基础上快速提升生理运动能力水平。
4 结论
通过水提醇沉法、微波辅助提取法、微波-酶提取法、纤维素酶提取法进行铁棍山药的多糖提取,实验显示微波-酶提取法的多糖得率最高,体外氧自由基清除能力与运动状态下产后腰痛患者抗氧化能力干预结果相似。铁棍山药多糖的结构能有效激活人体的抗氧化酶活性,降低细胞过氧化反应水平,提升产后腰痛患者运动康复过程中氧自由基清除能力,补充运动中糖、蛋白质、维生素等物质的消耗,从而增强人体抗氧化、抗疲劳能力,消除疼痛感,加速生理机能恢复[29]。铁棍山药作为日常人们主要食物之一,价格相对低廉,易吸收,并且还具有多样性的药用价值,其诸多优点会随着科学技术的发展以及相关研究的不断进行而受到更加广泛的关注,采用最优化加工工艺制作铁棍山药营养补充剂,能够完善产后腰痛运动康复中的营养补充体系,也将成为运动训练营养补充结构中重要的组成部分。
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