我国是世界第一产梨大国,梨是我国仅次于苹果、柑橘的第三大水果[1-2]。鸭梨味美多汁,肉质细腻,营养丰富,是酿造果酒的优质原料[3-4]。目前已有鸭梨酒产品投入市场,但由于产品存在易褐变、口味寡淡、香味不足等问题,以至于消费者认可度有待提高。因此,如何丰富鸭梨酒的风味,提高鸭梨酒品质是亟待解决的问题[5]。
近年来,多菌种混合发酵果酒受到研究人员的关注。非酿酒酵母在发酵过程中能产生多种胞外酶,能代谢某些香味前体物质产生酯类、酸类、醇类、萜烯类物质等,对果酒增香、品质提升有重要作用[6]。有学者[7-9]通过对鸭梨酒的发酵方式进行优化来提升鸭梨酒质量,目前有所成效。有学者[10-14]从梨酒及梨园土壤中分离出产香力强的酿酒酵母用于梨酒发酵,使得鸭梨酒风味提升。梁丽红等[15]为探讨优选非酿酒酵母混合发酵对干红葡萄酒品质的影响,采用耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)与粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)进行混菌发酵,研究发现使用2种酵母进行接种发酵后酒中苹果酸、乳酸含量显著降低,中链脂肪酸乙酯、乳酸乙酯等的含量有所提高,能有效增加酒样的花香与果香。但2种不同的菌株在发酵过程中可能会发生竞争营养或产生具有毒性的代谢产物抑制细胞生长等[16]。赵剑雷等[17]为研究异常威克汉逊酵母(Wickerhamomyces anomalus)与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的相互作用机制,将2种酵母进行混合发酵,结果发现发酵24 h后异常威克汉逊酵母的生长受到严重影响并出现自融和凋亡的现象,酿酒酵母生长未受影响。
因此,本试验采用异常威克汉逊酵母与酿酒酵母混合发酵鸭梨酒,通过分析2种酵母不同接种方式在鸭梨酒发酵过程中菌体数量的变化,并采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)检测不同酵母发酵的鸭梨酒挥发性成分,结合主成分分析及感官品评探究单菌发酵与混菌发酵对鸭梨酒品质的影响,以期解决鸭梨酒香味寡淡等问题,为鸭梨酒产业的发展提供基础数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
材料:新鲜鸭梨(Yali),市售。菌种:威克汉逊酵母和酿酒酵母,酿酒生物技术及应用四川省重点实验室。
试剂:NaCl、葡萄糖、偏重亚硫酸钾、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水扬酸、NaOH、苯酚,均为分析纯,成都市科龙化工试剂厂。
仪器:HR1833飞利浦榨汁机,中国飞利浦公司;DH4000BⅡ电热恒温培养箱,天津市泰斯特公司;Super Alcomat高精度数显酒精浓度计,上海点将精密仪器有限公司;7890A-5975B气相色谱质谱联用仪,美国 Agilent 公司;1500酶标仪,美国 Thermo 公司;WYT-ⅡA手持式糖量计折射仪,成都格纳丝商贸公司。
1.2 试验方法
1.2.1 鸭梨酒酿造工艺流程
新鲜鸭梨→清洗、浸泡→去皮、去芯、去梗、切块→榨汁→护色杀菌→调糖→接种→发酵→倒罐→陈酿→澄清、过滤→调整成分→精滤→灌装→成品
操作要点:按85 mg/L加入偏重亚硫酸钾作抑菌剂;用白砂糖调节初始糖度至22%;酵母接种量2%(体积分数,下同);混合密封于26 ℃发酵8 d。
异常威克汉逊酵母活化:挑取平板上单菌落至酵母膏蛋白胨液体培养基中,装液量100 mL/250 mL,于28 ℃、150 r/min培养24 h(此时菌体数达到1×108 CFU/mL)备用。
酿酒酵母活化:将活性干酵母接种至10倍体积的鸭梨汁中于30 ℃静置培养30 min,再接种至10倍体积的鸭梨汁中静置培养,培养温度28 ℃,培养时间12 h(此时菌体数达到1×108 CFU/mL)备用。
鸭梨酒混菌发酵是将酿酒酵母与异常威克汉逊酵母分别以2%的接种量接入处理过的鸭梨汁中进行混合发酵;以酿酒酵母和异常威克汉逊酵母纯种发酵鸭梨汁作为对照。
1.2.2 酵母接种时间对鸭梨酒发酵的影响
酿酒酵母按2%的接种量接种于新鲜鸭梨汁中,于28 ℃恒温培养箱中发酵0、24、48、72 h后分别加入2%异常威克汉逊酵母,分别检测发酵液中2种酵母数量、总糖与酒精度,检测方法参照张文文等[18]的检测方法。
1.2.3 不同接种方式发酵鸭梨酒挥发性成分分析
挥发性风味物质顶空固相微萃取(head space solid phase microextraction,HS-SPME):取5 mL鸭梨酒于顶空瓶中,按0.15 g/mL加入NaCl,再加入50 μL乙酸正丁酯(8.4 g/L)作为内标混匀,置于55 ℃的固相微萃取仪中平衡15 min,将老化后的固相微萃取针头插入平衡后的样品顶空萃取30 min。
色谱条件:色谱柱 DB WAX(60 m×0.25 mm,0.25 μm):载气为高纯He,流速1 mL/min,进样口温度230 ℃;采用不分流进样模式;程序升温:初始温度为60 ℃保持2 min,然后以5 ℃/min的升温速率升至90 ℃保持2 min,再以20 ℃/min的速率升至230 ℃,保持5 min。
质谱条件:70 eV电子能量,全扫描质量范围(20～550) amu,离子源温度230 ℃,传输线温度280 ℃;四极杆温度150 ℃。
定量分析:计算如公式(1)所示:
Wi=fi×Ai/As×Ws
(1)
式中:Wi,挥发性风味化合物质量浓度,mg/L;Ws,加入内标物质质量,μg;Ai,待测组分的峰面积;As,内标物质的峰面积;fi,待测组分对内标物的质量相对校正因子。
1.2.4 感官分析
鸭梨酒感官评分标准参照尹雪林等[19]的方法并稍作修改,评价小组由15位经验丰富的感官品评员组成(8名女性和7名男性,年龄25～40岁),鸭梨酒香气描述词汇为发酵香、果香、花香、甜香、清香,评分方式采用10分制,0分代表没有闻到该香气,9分表示该香气强度很大。
1.2.5 数据处理方法
采用SPSS 19.0软件对所得的数据进行方差分析,并将所得的数据在OriginPro 2021中进行主成分分析与作图。
2 结果与分析
2.1 酵母不同接种方式对鸭梨酒发酵的影响
在混菌发酵过程中,不同的微生物间会发生争夺营养物质的行为或产生具有毒性的代谢物,抑制或杀害非同类微生物,同时,微生物不同时期主要代谢产物不同,对发酵体系中其余微生物的影响均不同,因此在多菌混合发酵体系中,适当的接种时间对酵母菌的生长繁殖与发酵活动至关重要[20]。试验分别考察酿酒酵母、异常威克汉逊酵母单菌发酵在接种酿酒酵母后分别间隔0、24、48、72 h接种异常威克汉逊酵母后发酵液中酵母菌数量与发酵过程中鸭梨酒的理化指标变化,探究不同方式对鸭梨酒发酵的影响。如图1-a所示,在单菌发酵体系中,按相同比例分别接种2种酵母进行发酵,酿酒酵母生物量显著高于异常威克汉逊酵母,并且稳定期较长,在发酵12 d后菌体数量才低于108 CFU/mL,而异常威克汉逊酵母发酵9 d后菌体数量便低于108 CFU/mL,这可能是由于随着发酵的进行,鸭梨酒乙醇含量上升,异常威克汉逊酵母不耐受高乙醇含量而提前消亡,酿酒酵母由于能耐受较高浓度的乙醇,因此存活时间较长,菌体数可以较长时间保持较高水平;由图1-b可知,酿酒酵母在发酵前期迅速消耗发酵体系中的可利用碳源,并迅速转换为乙醇,较异常威克汉逊酵母产酒速度快,在发酵8 d后乙醇含量基本维持稳定,乙醇体积分数达到11%,而异常威克汉逊酵母发酵较为缓慢,同样在发酵8 d后酒精度基本维持稳定,但此时乙醇体积分数仅为9.5%,与酿酒酵母存在较大差异,原因可能是异常威克汉逊酵母产酒效率低,同时不能耐受高乙醇浓度的环境,导致发酵提前终止并且不能发酵完全。在混菌发酵体系中,如图1-c～图1-f所示,当同时等量接种酿酒酵母与异常威克汉逊酵母时,酿酒酵母的生长繁殖受到较大影响,在发酵前2 d,异常威克汉逊酵母能正常生长,发酵进行到第4天时菌体数量开始减少,到第5天时异常威克汉逊酵母菌体数便低于108 CFU/mL,同时发酵液乙醇体积分数趋于稳定,达到10.85%,酿酒酵母菌体数在发酵8 d后开始呈下降趋势;当接种时间相差24 h时,异常威克汉逊酵母的生长受到酿酒酵母的影响较大,菌体数远低于酿酒酵母菌体数,并且接种72 h后即呈下降趋势,而酿酒酵母受异常威克汉逊酵母的影响较小,对产品乙醇含量影响不大;当接种间隔为48与72 h时,异常威克汉逊酵母受酿酒酵母影响较大,仅能短暂存活2 d,随即呈下降趋势,接种异常威克汉逊酵母对酿酒酵母的生长与鸭梨酒乙醇含量没有影响;考虑到鸭梨酒发酵需要足够的酿酒酵母产酒,同时应让异常威克汉逊酵母存活较长时间,综合选择酿酒酵母发酵24 h后接入异常威克汉逊酵母。
a-单菌发酵鸭梨酒菌体数变化;b-单菌发酵鸭梨酒总糖与乙醇体积分数变化;c-接种间隔时间0 h菌体数、总糖与乙醇体积分数变化;d-接种间隔时间24 h菌体数、总糖与乙醇体积分数变化;e-接种间隔时间48 h菌体数、总糖与乙醇体积分数变化;f-接种间隔时间72 h菌体数、总糖与乙醇体积分数变化
图1 动态监测发酵参数
Fig.1 Dynamically monitored fermentation parameters
2.2 不同酵母发酵对鸭梨酒风味的影响
如表1所示,发酵结束后,在3种发酵方式酿造的鸭梨酒中共检测出43种挥发性成分,包括16种酯类物质、13种醇类物质、3种酸类物质、6种醛类物质以及5种其他物质。与酿酒酵母(33种)、异常威克汉逊酵母(36种)单菌发酵相比,混菌发酵(39种)获得的香气成分更多,说明混菌发酵能对鸭梨酒的风味多样性起到积极的作用。3种发酵接种方式发酵出的鸭梨酒共检测出23种相同的香气成分,分别为乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、异丁醇、异戊醇、正戊醇、10-壬醇、苯乙醇、山梨醇、乙酸、己酸、辛酸、苯甲醛、糠醛、壬醛、苯乙醛、丁香酚。
表1 鸭梨酒样中挥发性组分含量
Table 1 Varieties and contents of volatiles in Yali wine samples
序号物质混菌发酵/(mg/L)酿酒酵母/(mg/L)异常威克汉逊酵母/(mg/L)香味描述1乙酸乙酯99.00±4.3558.35±3.26151.37±5.58水果香气2丁酸乙酯0.46±0.010.36±0.040.53±0.05香蕉、草莓果香3异戊酸乙酯0.09±0.02-0.04±0.01苹果、桑葚香气4乙酸异戊酯18.55±2.053.48±0.282.51±0.33香蕉水果甜香5己酸乙酯0.94±0.032.01±0.520.32±0.19菠萝香6乙酸己酯0.53±0.020.43±0.440.88±0.05苹果及樱桃香7庚酸乙酯-0.08±0.03-菠萝香气8乳酸乙酯0.31±0.010.35±0.050.18±0.04青草味9琥珀酸二乙酯0.68±0.05-0.40±0.02愉悦香气10辛酸乙酯17.14±1.588.52±0.5112.62±0.68梨香及荔枝香11乙酸苯乙酯17.46±2.6111.49±0.8412.50±0.33愉悦花香12癸酸乙酯0.54±0.050.78±0.080.89±0.11梨和白兰地香韵13水杨酸甲酯-0.09±0.02-14月桂酸乙酯0.09±0.030.19±0.03-甜香、花果香、朗姆酒香15亚油酸乙酯0.26±0.05-0.33±0.0516硝酸异山梨酯1.04±0.11-0.95±0.08酯类总计157.09±10.9286.13±6.10183.52±7.5217异丁醇3.58±0.361.74±0.114.24±0.2118正丁醇-0.14±0.020.12±0.03水果香192-甲基正丙醇0.26±0.05-0.45±0.02203-甲基-1-丁醇25.48±1.25-21.88±0.85青草香、植物香21异戊醇79.41±2.59100.25±3.3857.52±2.24水果香、花香22正戊醇95.52±3.99112.47±5.5448.46±3.18辛辣味、青草香23己醇3.98±0.156.89±0.55-水果香241-辛醇-0.07±0.01-柠檬香251-壬醇1.21±0.310.61±0.150.56±0.0826香叶醇0.62±0.130.49±0.05-玫瑰花香27苯乙醇20.92±0.5810.05±0.3125.95±0.73玫瑰及茉莉花香28山梨醇4.57±0.880.92±0.055.39±0.08果香29芳樟醇0.50±0.05-0.20±0.03花香醇类总计236.05±10.34233.63±10.17164.77±7.4530乙酸5.69±0.442.00±0.3810.51±0.81强刺激性气味31己酸1.61±0.150.48±0.031.08±0.08甜香、水果香32辛酸1.17±0.080.53±0.091.05±0.07水果香、花香、油脂臭酸类总计8.47±0.673.01±0.5012.64±0.9633苯甲醛0.72±0.050.43±0.060.86±0.09坚果味34糠醛0.83±0.030.43±0.090.13±0.02桂皮油香气35癸醛0.35±0.040.41±0.04-油脂香36壬醛0.23±0.030.15±0.030.13±0.01青草味
续表1
序号物质混菌发酵/(mg/L)酿酒酵母/(mg/L)异常威克汉逊酵母/(mg/L)香味描述37月桂醛0.07±0.01-0.05±0.01水果香38苯乙醛0.16±0.020.11±0.010.18±0.02水果香醛类总计8.47±0.183.01±0.2312.64±0.1539β-大马酮0.36±0.020.18±0.01-苹果及李子干味40苯乙酮0.20±0.03-0.33±0.02愉悦香气41丁香酚0.53±0.010.34±0.030.29±0.03丁香花香气424-乙烯-愈创木酚0.50±0.01-0.24±0.04焙烤香、果香、辛香43萜品油烯0.43±0.02-0.15±0.02果香其他总计2.02±0.090.52±0.041.01±0.11
酯类物质是果酒特征香气成分的主要贡献者,主要是通过发酵过程中酸类与醇类物质的酯化作用生成,当酯类物质含量达到一定浓度时能够增加果酒香气的复杂性,赋予果酒一定的花香、果香等复合香气[21-23]。由表1可知,在3种接种方式中,异常威克汉逊酵母单菌发酵的鸭梨酒酯类物质含量最高,以乙酸乙酯为主,占总酯类物质含量的82.48%,其次为辛酸乙酯与乙酸苯乙酯,分别占总酯类物质含量的6.88%与6.81%,3种物质占酯类物质的90%以上,为鸭梨酒带来较为强烈的梨香、荔枝香、花香等[24];酿酒酵母单菌发酵的鸭梨酒酯类物质种类最少,共计12种,同时酯类物质含量也最低,仅为86.13 mg/L,较异常威克汉逊酵母发酵的鸭梨酒少97.39 mg/L,较混菌发酵的鸭梨酒少70.96 mg/L。混菌发酵的鸭梨酒酯类物质种类最多,总计14种,其中含量较高的分别是乙酸乙酯(99.00 mg/L)、乙酸异戊酯(18.55 mg/L)、辛酸乙酯(17.14 mg/L)、乙酸苯乙酯(17.46 mg/L),其中乙酸乙酯含量与异常威克汉逊酵母发酵的鸭梨酒相比减少52.37 mg/L,但比酿酒酵母发酵的鸭梨酒多40.65 mg/L,乙酸异戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯含量与2种酵母分别发酵的鸭梨酒相比有不同程度的增加,此外较酿酒酵母相比,新增异戊酸乙酯、琥珀酸二乙酯、亚油酸乙酯、硝酸异山梨酯。由此可见,将酿酒酵母与异常威克汉逊酵母混合接种到鸭梨汁中进行发酵能有效改善由酿酒酵母单菌发酵带来的风味单一且寡淡的问题。
高级醇是酵母在果酒酿造过程中产生的主要代谢产物之一,主要是由糖代谢、氨基酸脱氧脱羧作用生成,适量的高级醇不仅能给果酒带来醇甜的口感,还能与酸类物质进行酯化反应合成酯类物质,对果酒风味的形成有着重要作用[25-26]。当含量超过300 mg/L时会给酒带来辛辣等不愉快的味道,还可能会使饮用者产生神经系统充血和头痛的症状[27]。如表1所示,3种接种方式发酵得到的鸭梨酒中共计检测出13种醇类物质,高级醇含量均低于300 mg/L,其中3-甲基-1-丁醇、异戊醇、正戊醇、苯乙醇含量较高,占醇类物质的90%以上,异常威克汉逊酵母发酵得到的鸭梨酒醇类物质含量最低,仅为164.77 mg/L,酿酒酵母单菌发酵与2种酵母混菌发酵中含量较高,分别为233.63与236.05 mg/L。混菌发酵的鸭梨酒中异戊醇、正戊醇含量显著高于异常威克汉逊酵母单菌发酵的鸭梨酒、低于酿酒酵母单菌发酵的鸭梨酒,而异丁醇、苯乙醇、山梨醇等均低于异常威克汉逊酵母发酵的鸭梨酒、高于酿酒酵母发酵的鸭梨酒。
酸类物质、醛类物质、酮类物质、酚类物质等对果酒的呈香呈味有较大的影响,酸类物质主要影响果酒的口感与后味,主要是起到助香、减少刺激的辅助作用[28-29]。在3种发酵方式中均检测出乙酸、己酸、辛酸3种酸类物质,异常威克汉逊酵母发酵的鸭梨酒中乙酸含量(10.51 mg/L)较酿酒酵母单菌发酵的鸭梨酒中乙酸含量(2.00 mg/L)高,当2种酵母混菌发酵时,乙酸含量处于中等水平,说明异常威克汉逊酵母对鸭梨酒中乙酸的产量有积极影响,但由于受到酿酒酵母的抑制,产量较单菌发酵时低。醛酮类化合物性质较活泼,属于中间体化合物,在发酵及陈酿时极易被氧化还原成相应的酸与醇,同时适量的醛酮类物质(如苯甲醛、糠醛等)能赋予酒体特殊的杏仁香、焦甜香等,对酒体风味有促进作用[30]。
2.3 不同接种方式风味物质主成分分析
主成分分析是从多个变量中通过线性变换从中挑选出少数重要变量的数据处理方法。将3种酒样共有的23种风味物质进行主成分分析,得到不同主成分的方差贡献率和主成分载荷图,主成分特征值、方差贡献率和累计贡献率见表2,载荷图见图2。如表2可知,以特征值>1为依据,3个样品中共提取了2个主成分,其中PC1与PC2方差贡献率分别为57.000%和35.434%,累计贡献率为92.434%,基本可以解释原变量的绝大多数信息。
表2 主成分的特征值及方差贡献率
Table 2 The eigenvalue and variance contribution rate of PCA
成分主成分特征值方差贡献率/%累计方差贡献率/%113.11057.00057.00028.15035.43492.43430.7193.12595.55940.5372.33397.89250.2481.07798.96960.1130.49099.45870.0880.38599.84380.0360.157100.000
图2 香气成分主成分分析散点图
Fig.2 Scatter plot of PCA of flavor components
由图2可知,3种接种方式发酵得到的鸭梨酒在PCA图中得到了较好的区分,2种酵母混菌发酵的鸭梨酒主要分布在PC1与PC2的正半轴,异常威克汉逊酵母发酵的鸭梨酒主要分布在PC1的正半轴与PC2的负半轴,酿酒酵母发酵的鸭梨酒在PC1与PC2的负半轴。2种酵母混菌发酵的鸭梨酒处于第一象限,风味物质较为丰富,有乙酸异戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、异丁醇、10-壬醇、苯乙醇、山梨醇、己酸、辛酸、苯甲醛、壬醛、苯乙醛共12种物质,这些物质能赋予酒体梨、苹果、桑葚、玫瑰花、茉莉花等香味。异常威克汉逊酵母发酵的鸭梨酒位于第四象限,主要包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸己酯、癸酸乙酯及乙酸共5种物质,能赋予酒体香蕉、草莓、菠萝、梨等水果香。
2.4 不同接种方发酵鸭梨酒感官评价
不同酵母由于生长代谢不同,其产物也不尽相同,对鸭梨酒的发酵及感官都有一定的影响。根据定量分析的关键词对不同接种方式发酵的鸭梨酒进行感官品评,结果如图3所示,酿酒酵母发酵的鸭梨酒具有较好的发酵香与清香,异杂味少,但甜香、花香、果香较弱,酒体单薄、寡淡,其原因可能是酿酒酵母具有较强的发酵产酒能力,同时发酵副产物少;异常威克汉逊酵母发酵得到的鸭梨酒果香、花香与甜香较为突出,其原因可能是异常威克汉逊酵母具有产酯能力强的特点,例如高产乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等,因此能明显增强果酒的果香、花香与甜香,但异常威克汉逊酵母发酵的鸭梨酒发酵香、酒香较弱,其原因可能是其生长较酿酒酵母慢,且发酵产酒能力弱,发酵结束后酒精度较低;2种酵母混菌发酵的鸭梨酒具有较好的发酵香、清香与果香,风格典型,优于酿酒酵母发酵的鸭梨酒与异常威克汉逊酵母发酵的鸭梨酒,但甜香与花香较异常威克汉逊酵母发酵的鸭梨酒略低。
图3 感官分析雷达图
Fig.3 The radar chart of sensory analysis
3 结论
试验分析酿酒酵母与异常威克汉逊酵母不同接种方式对鸭梨酒发酵过程中酵母数量与鸭梨酒风味的影响。结果表明,在混菌发酵体系中,酿酒酵母与非酿酒酵母存在相互抑制关系,先接种酿酒酵母后接种异常威克汉逊酵母,异常威克汉逊酵母生长将受到抑制,并且随接种间隔时间的加大而增强;混菌发酵的鸭梨酒风味成分较酿酒酵母发酵的鸭梨酒更丰富,并且能降低正戊醇、异戊醇等部分高级醇的含量;对23种共有挥发性成分进行主成分分析,共提取到2个主成分,PC1与PC2方差贡献率分别为57.000%和35.434%;通过感官分析,2种酵母混菌发酵的鸭梨酒较两种酵母单菌发酵的鸭梨酒果香与发酵香有较大的提升,香味更为丰富。综上所述,不同接种方式对鸭梨酒中主要发酵菌种及风味成分与感官有较大的影响,采用2种酵母进行混菌发酵有利于增加酒体风味的复杂性,提高酒的品质。
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