纳他霉素(natamycin),又名海松霉素或游链霉素,主要是由纳他霉素链霉菌生产的天然抗菌剂,兼具适用范围广、抗真菌性强、热稳定性好、安全性高等诸多优势[1]。纳他霉素对细胞膜含甾醇类物质的真菌有极强的抑菌和杀菌作用,例如酵母、霉菌等[2]。在最新版的食品添加剂使用标准中,将纳他霉素归属于天然食品防腐剂之一,在糕点类食品中的最大允许使用量为0.3 g/kg,残留量应小于10 mg/kg。迄今为止,纳他霉素在食品工业中已被广泛使用,例如肉制品、乳制品、果蔬、饮料以及烘焙食品等[3-6]。此外,在医学领域,纳他霉素也可作为一种高效抗菌物质,治疗由真菌感染引起的多种眼部疾病,如真菌性角膜炎、结膜等[7-8]。
纳他霉素作为一种纯天然多烯类抗生素,分子式为C33H47NO13,其抗真菌活性与多烯抗生素家族其他成员相似,主要是通过与真菌细胞中麦角甾醇的特异性功能发挥作用。研究表明,纳他霉素能够以甾醇依赖性的方式干预液泡的融合和裂变过程,进而阻断真菌的正常生长代谢过程,达到抗菌的目的[9-12]。此外,纳他霉素中的特殊结构也能与甾醇形成复合物,改变质膜的选择性渗透能力,使细胞营养成分外渗,最终死亡[13]。研究发现,0.5～6.0 mg/kg纳他霉素处理液能够抑制引起食品腐败变质的主要霉菌;而酵母类真菌一般在1.0～5.0 mg/kg的纳他霉素浓度下会被抑制[14]。纳他霉素在水和油脂中的溶解度极低,即使人体摄入了少量的纳他霉素也会随粪便排除体外,不会对人体造成任何有害影响[15]。在食品中,纳他霉素即使存在部分残留,也非常容易检出,最新的相关检测方法包括高效液相色谱法[16]、超高效液相色谱串联质谱[17],液相色谱-电喷雾串联质谱法[18]以及免疫测定[19]等。蛋糕是以面粉、油脂、白砂糖、蛋和水为原料,适当添加其他辅料,经调制、灌模、烘烤而成的糕点类食品[20]。蛋糕因其造型优美,口感香甜以及色彩艳丽,受到男女老幼的喜爱。然而因为其营养丰富,水分含量高,易导致以霉菌为主的微生物生长繁殖,不易保存。霉菌作为需氧菌,所以由其引起的污染和腐败,总是发生在蛋糕表面,故本实验采用喷洒的方式,对蛋糕进行表面防腐处理,探究纳他霉素在蛋糕贮藏过程中的抑菌作用,并通过与糕点类食品中使用最广泛的3类防腐剂的抑菌效果和成本进行对比分析,为纳他霉素在糕点类食品中的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
纳他霉素(食品级),成都雅途生物技术有限公司;丙酸钙、山梨酸钾、脱氢乙酸钠(食品级)、乙醇(95%,体积分数)、氯霉素、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖(分析纯),成都科龙化工试剂厂。
LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;DUP-9082电热恒温培养箱,上海齐欣科学仪器有限公司;PT2531烤箱,美的电器有限公司;HH-2型恒温水浴锅、SW-CI-2F苏州安泰双人双面净化工作台,常州国华电器有限公司;pHS-3C酸度计,成都世纪方舟科技有限公司等。
1.2 实验方法
1.2.1 蛋糕制作
先将鸡蛋和白糖搅拌至原体积的3倍,按照一定比例添加过筛后的低筋面粉,搅拌均匀,灌入模具中定型。随后将模具放入烘箱中烘烤(108 ℃,30 min),出炉冷却后即可倒出模具。最后装入无菌密封袋中备用。
1.2.2 防腐剂配制和添加
1.2.2.1 纳他霉素处理液的配制
准确称取一定量的纳他霉素,配制成质量浓度依次为100、200、300、400、500 mg/L的悬浮液,即本实验用于喷洒蛋糕表面的防腐剂处理液。
1.2.2.2 蛋糕表面防腐处理
将烘烤好的蛋糕置于室温下冷却至脱模,在蛋糕表面按0.013 mL/g喷洒不同浓度的纳他霉素处理液,同时以喷洒等量的蒸馏水为空白对照,在室温下晾干,使用无菌保鲜袋密封包装后置于室温下贮藏。同时配制3种蛋糕中最常用使用的防腐剂(丙酸钙、山梨酸钾和脱氢乙酸钠)处理液,作为蛋糕防腐效果研究的对照。各实验均重复3次,取平均值为最终试验结果。
1.2.3 微生物检测
1.2.3.1 培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基:按照培养基所要求的比例,调节pH值为7.4,添加适量的琼脂,分装于锥形瓶中高压蒸汽灭菌。
PDA培养基:选取大小适中的马铃薯,清洗,去皮切块,称取200 g,添加适量的蒸馏水,加热煮沸10～20 min,使用双层纱布过滤出滤液,随后向滤液中添加适量的蒸馏水稀释至1 000 mL,称取20 g葡萄糖、15 g左右琼脂和0.1 g的氯霉素(预先用少量95%的乙醇溶液溶解),在0.07 MPa(115 ℃)灭菌20 min。
1.2.3.2 霉菌与细菌检测
使用平板菌落计数法测定蛋糕表面的微生物菌落,PDA培养基用于霉菌检测,牛肉膏蛋白胨培养基用于细菌检测。
2 结果与分析
2.1 纳他霉素应用于蛋糕表面的防腐作用与效果
如图1所示,随着蛋糕保藏时间的延长,霉菌菌落数呈现不断上升的趋势。使用不同浓度的纳他霉素悬浮液处理的蛋糕,其表面的霉菌增长速率明显慢于空白组,且纳他霉素浓度越大,霉菌增长速率越慢。结果表明,纳他霉素浓度与霉菌的抑菌能力之间存在一定正相关性。100 mg/kg纳他霉素浓度处理的蛋糕和空白组蛋糕表面霉菌菌落数均于第4天超标(GB 7099—2015《食品安全国家标准 糕点、面包》中规定糕点霉菌菌落数≤150 CFU/g),而纳他霉素浓度为300 mg/kg时,蛋糕霉菌菌落数于第6天才超标,其霉菌菌落数约为空白组的一半。
图1 纳他霉素浓度对蛋糕表面霉菌菌落数的影响
Fig.1 Effect of natamycin concentration on mold colony numbers on the cake surface
从图2可以更清楚地看出,不同浓度纳他霉素抑菌效果的差异。总体来说,纳他霉素对霉菌的抑制能力随浓度的增加而增强,但当增加到300 mg/kg时,继续增加纳他霉素处理浓度,对蛋糕表面的防腐效果提升并不明显,其霉菌指标均低于食品安全标准的限定值。因此,在有效延长蛋糕货架期、减少防腐剂使用成本的同时,为提高安全性,应尽可能降低其在蛋糕中的残留量。故选择喷洒300～400 mg/kg的纳他霉素浓度,对蛋糕进行表面防腐处理,不仅可有效抑制霉菌生长,又能保证足够的安全性。
图2 纳他霉素浓度对蛋糕表面霉菌的抑菌效果
Fig.2 Bacteriostatic effect of natamycin concentration on cake mold
由图3可知,在实验时间内,蛋糕表面喷洒不同浓度的纳他霉素悬浮液后,对细菌的抑制作用差异都不明显。这也与目前广泛认同的纳他霉素抑菌机理相符[21],即纳他霉素主要是抑制真菌类微生物的生长繁殖,而对细胞膜不含甾醇类物质的细菌并无抑制效果。在第6天时,喷洒纳他霉素的蛋糕表面细菌菌落总数甚至略大于空白组,可能是因为空白组蛋糕表面霉菌的大量生长繁殖进而抑制了细菌的生长[22]。
图3 纳他霉素浓度对蛋糕表面细菌菌落数的影响
Fig.3 Effect of natamycin concentration on bacterial colony numbers on the cake surface
2.2 纳他霉素和丙酸钙在蛋糕表面防腐效果的比较
从图4中可以发现,与空白对照相比,蛋糕表面喷洒纳他霉素和丙酸钙悬浮液都能起到抑制霉菌生长的作用。在相同条件下,用500 mg/kg的丙酸钙与300 mg/kg的纳他霉素处理后的蛋糕,保藏6 d后,霉菌菌落数均为(122±1) CFU/g,可以看出,要达到同样的效果,丙酸钙需要远远更高的浓度,表明纳他霉素对蛋糕的防腐能力比丙酸钙更好。在实验时间内,未经防腐剂处理的蛋糕在第3天时霉菌菌落超标,而蛋糕表面喷洒300 mg/kg和400 mg/kg的丙酸钙后,保质期能延长2 d,在第6天霉菌菌落数超标。纳他霉素处理后的蛋糕则可将蛋糕保质期延长4 d左右,说明纳他霉素比目前市面上在糕点中使用广泛的丙酸钙的抑菌防腐效果更好[23]。
图4 纳他霉素和丙酸钙对蛋糕表面霉菌抑制效果
Fig.4 Inhibitory effect of natamycin and calcium propionate on cake mold
2.3 纳他霉素与脱氢乙酸钠和山梨酸钾在蛋糕表面防腐效果的比较
对比图1和图5、图6可以发现,不同浓度的纳他霉素、山梨酸钾以及脱氢乙酸钠对蛋糕表面霉菌的生长繁殖具有抑制作用。0.3 g/kg的纳他霉素处理浓度,可使蛋糕保质期延长4 d,而3 g/kg的山梨酸钾和脱氢乙酸钠处理后的蛋糕保质期仅能延长2 d,这表明,纳他霉素对蛋糕霉菌的抑制效果明显优于山梨酸钾和脱氢乙酸钠。纳他霉素对细菌不发挥作用,只对霉菌有专一性抑制能力[24-25]。结合两张图分析发现,蛋糕表面分别喷洒9 g/kg的山梨酸钾和脱氢乙酸钠后,前者第4天时的霉菌菌落数大于后者第5天时的霉菌菌落数,说明山梨酸钾对蛋糕霉菌的抑制能力弱于脱氢乙酸钠。但有很多资料表明,山梨酸钾对细菌的抑菌能力大于脱氢乙酸钠[26-27],而且山梨酸钾是公认毒性最小的防腐剂之一,所以选择山梨酸钾与纳他霉素进行复配,既具有很高的安全性,又能弥补彼此抑菌谱的不足,形成能够同时抑制霉菌和细菌的复合防腐剂。
图5 山梨酸钾对蛋糕表面霉菌的抑制效果
Fig.5 Inhibition effect of potassium sorbate on cake mold
图6 脱氢乙酸钠对蛋糕表面霉菌的抑制效果
Fig.6 Inhibitory effect of sodium dehydroacetate on cake mold
2.4 纳他霉素与山梨酸钾复配在蛋糕中防腐效果
在烘焙食品中,引起腐败变质的微生物除了霉菌外,细菌也是导致其变质的原因之一。常见的枯草芽孢杆菌孢子具有极强的耐热性,通常存在于面粉、糖和酵母等原材料中[28]。从上述实验可以看出,纳他霉素对霉菌类的真菌有很强的防腐效果,而山梨酸钾不仅对霉菌有一定的抑制能力,同时对细菌的抑制作用也优于丙酸钙和脱氢乙酸钠。因此,为了更好地延长蛋糕的保质期,实验选择纳他霉素和山梨酸钾进行复配,通过单因素正交试验,探究复配防腐剂在蛋糕中的最佳配比,为纳他霉素在蛋糕类焙烤食品中的应用提供理论参考。表1为正交试验结果的评分标准。
表1 正交试验结果评分表
Table 1 Orthogonal test score results table
细菌菌落总数/(CFU/g)霉菌菌落数/(CFU/g)得分/分 0^150 0^1010150^30010^209300^45020^308450^60030^407600^75040^506750^90050^605 900^1 05060^7041 050^1 20070^8031 200^1 35080^9021 350^1 500 90^1001>1 500>1000
通过对前期实验的分析可知,山梨酸钾含量7 g/kg时对蛋糕的抑菌效果最佳。所以,根据单因素试验中两种防腐剂的最佳处理浓度选取L9 (34)正交试验,其中,纳他霉素含量为0.2～0.4 g/kg,山梨酸钾含量为6～8 g/kg,如表2所示。
表2 复配防腐剂正交试验设计表 单位:g/kg
Table 2 Design table of orthogonal test for compound preservatives
编码水平A(纳他霉素)B(山梨酸钾)10.2620.3730.48
从表3中可以看出,经过复配防腐剂处理的蛋糕保藏5 d后,在直观分析中的最优水平组合为A3B3(纳他霉素最佳喷洒质量分数为0.4 g/kg,山梨酸钾最佳喷洒质量分数为8 g/kg),其次是A3B2。由表4可知,纳他霉素对蛋糕表面防腐效果的影响极显著,山梨酸钾对蛋糕表面防腐效果的影响不显著。
表3 复配防腐剂的正交试验结果分析
Table 3 Orthogonal test results of compound preservatives
试验号因素第5天A(纳他霉素)B(山梨酸钾)空白1空白2细菌分数霉菌分数总分11111000212220003133300042123000522310006231200073132031.58321304293321042K100.50.6670.667K200.6670.6670.5K31.8330.6670.50.667R0.8330.1670.1670.167
表4 复配防腐剂的正交试验结果方差分析(第5天)
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment results of compound preservatives (fifth day)
注:**表示差异显著。
因素偏差平方和自由度FF临界值显著性A(纳他霉素)6.7222120.0366.94∗∗B(山梨酸钾)0.056216.94误差 0.114
结合图1、图5的结果,从图7中可以发现,复配防腐剂对蛋糕表面细菌与霉菌的抑菌能力更强,这表明纳他霉素与山梨酸钾复配液在蛋糕表面可以发挥抑菌防腐的协同作用。使用最佳配比防腐剂复配液喷洒蛋糕表面后,可以使蛋糕的保质期延长至10 d以上,且两项微生物指标均符合国家标准要求(细菌菌落总数≤104 CFU/g,霉菌菌落数≤150 CFU/g),而未使用防腐剂的蛋糕只有2 d的保质期。同时对蛋糕表面残留量的检测发现,纳他霉素残留量为5.4 mg/kg,山梨酸钾为0.107 7 g/kg,均远小于GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》所规定的最大残留量10 mg/kg和1 g/kg。
图7 最佳配比防腐剂对蛋糕表面霉菌和细菌的抑菌效果
Fig.7 Bacteriostatic effect of optimal preservative ratio on mold and bacteria on cakes
2.5 纳他霉素在蛋糕中应用的成本分析以及与其他防腐剂的比较
蛋糕作为广受男女老幼喜爱的糕点食品,虽然纳他霉素对蛋糕表面的霉菌有较好的抑制作用,但考虑到食品加工中蛋糕的生产量大、适用人群广,因此也需要综合考虑防腐剂的使用成本。因此,在达到同样抑菌效果的条件下,各防腐剂在蛋糕中的使用成本,结果如表6所示。
由表5、表6可知,纳他霉素的市场价格虽远高于其他3种防腐剂的价格,但由于在蛋糕中的实际使用量最小,并且对霉菌的抑菌效果最好,从综合角度考虑,在蛋糕类糕点食品中,纳他霉素具有低成本,安全性高等优势。总之,可以认为纳他霉素是作为蛋糕防腐保鲜的最佳防腐剂之一。
表5 常见防腐剂的市场销售价格
Table 5 Market prices of common preservatives
名称价格/(元/kg防腐剂)纳他霉素 900丙酸钙 30山梨酸钾 60脱氢乙酸钠35
表6 常见防腐剂在蛋糕中的使用残留量及成本分析
Table 6 Residue and cost analysis of common preservatives in cakes
注:成本=价格×使用残留量/106。
防腐剂使用残留量/(mg/kg蛋糕)成本/(元/kg蛋糕)纳他霉素 5.40.004 86山梨酸钾 2430.014 58脱氢乙酸钠138.860.004 86丙酸钙 8.10.000 243
3 结论与讨论
纳他霉素作为一种天然食品生物防腐剂,具有较高的安全性,可应用于蛋糕类的焙烤食品防腐保鲜。在低成本和低剂量的条件下,既可以保证食品的原有风味,又能发挥较强的抑菌作用,延长蛋糕的保质期。综合考虑,将纳他霉素喷洒于蛋糕表面进行防腐保鲜,具有非常好的应用前景。纳他霉素最佳使用浓度为300～400 mg/kg,与安全性高的山梨酸钾进行复配,可产生协同作用,使蛋糕保质期延长至10 d以上。其最优复配液的使用质量分数为纳他霉素0.4 g/kg,山梨酸钾8 g/kg,此时既能保证蛋糕的品质,又具有很高的安全性。
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