香气是葡萄酒重要的感官特征,是评价葡萄酒品质的核心指标之一[1]。目前已经在葡萄酒中检测到了超过1 000余种挥发性物质,包括酯类、高级醇类、脂肪酸类、类异戊二烯类、醛酮类物质和含硫化合物等,这些化合物的种类、浓度、感官阈值以及各种香气物质之间的相互作用,共同影响着葡萄酒的香气品质[2]。在酒精发酵过程中,酿酒酵母会产生许多挥发性香气物质,包括酯、脂肪酸和高级醇等。酯类物质是葡萄酒香气物质中最重要的香气物质之一,能够给葡萄酒带来花香和果香,葡萄酒中的酯类主要分为两大类,分别是乙酸酯类和乙基酯类,乙酸酯由高级醇与乙酰-CoA通过酶促反应形成[3],乙基酯由乙醇和短或中链脂肪酸在酰基转移酶的催化作用下形成[4]。葡萄酒中的高级醇有两种合成路径,一种是氨基酸在转氨酶的作用下生成酮酸,再在脱氢酶的作用下被还原成比氨基酸少一个碳原子的高级醇,即艾利希(Ebrlich)途径[5];另一种合成路径是酵母菌利用糖酵解过程产生的α-酮酸,在脱羧酶、脱氢酶等的作用下,逐步合成各种高级醇[6]。酵母菌通过糖酵解作用产生乙酰-CoA,在乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)的作用下,将两分子的乙酰-CoA催化形成一分子的丙二酰-CoA。丙二酰-CoA作为碳链延伸供体,在脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)及酰基载体蛋白(acylcarrier protein,ACP)的作用下,生成各种脂肪酸[7]。葡萄果实中的类异戊二烯以少量的游离态和大量结合态两种形式存在,但只有游离态的类异戊二烯具有挥发性[8]。在葡萄酒酿造过程中,糖苷会在糖苷酶及酸性环境作用下水解,释放出游离态的类异戊二烯[9]。

研究发酵过程中香气成分及特征变化规律,对调控发酵过程中香气成分及特征有重要意义。唐柯等[10]对威代尔冰葡萄酒发酵过程中香气动态变化规律进行了研究,发现醇类、芳香族类、酯类、酸类、萜烯类等化合物的含量随着发酵的进行逐渐增加,并在发酵第14天时达到最高,随后含量降低并趋于稳定。陈明等[11]对蛇龙珠葡萄酒发酵过程中香气变化进行了研究,发现部分香气物质在发酵过程中始终存在,如乙酸乙酯、己酸乙酯和苯乙醇等;部分香气物质在葡萄浆果中存在,但在发酵过程中消失了,如1-己醇、反式-2-己烯醛等;还有部分香气是在发酵过程中产生的,如异戊醇、辛酸乙酯和乙酸异戊酯等。MA等[12]对新疆小芒森甜白葡萄酒发酵过程中的香气成分和特征进行了研究,发现辛酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、异戊醇和辛酸等赋予了小芒森甜白葡萄酒果香和脂肪香气。RAYMOND EDER等[13]对起泡酒瓶内二次发酵过程中香气成分和香气特征进行了研究,发现挥发性乙酯和萜烯类物质与起泡酒的果香和花香有关。

‘霞多丽’是世界上最古老、分布最广泛的酿酒葡萄品种之一[14],用其酿造的干白葡萄酒深受消费者喜爱,并且在贺兰山东麓产区也有广泛种植。左俊伟等[15]对贺兰山东麓产区‘霞多丽’干白葡萄酒的香气成分进行了研究,共检测出了49种香气物质,香气特征以青苹果、草莓为主。陶永胜等[16]对中国主要葡萄酒产区‘霞多丽’干白葡萄酒的香气特征与成分进行了研究,并确定了6种香气特征:柑橘、菠萝、紫罗兰、石灰水、青苹果和柠檬。目前,对发酵完成后‘霞多丽’干白葡萄酒的香气成分与特征研究较多,但对酿造过程中香气成分与特征变化的研究还鲜有报道。因此,本实验以贺兰山东麓产区‘霞多丽’葡萄为实验材料,通过检测发酵过程中香气成分的变化,并对发酵过程中的酒样进行香气特征感官品评,来研究发酵过程中香气成分与特征的变化规律,为‘霞多丽’干白葡萄酒香气成分与特征的调控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料:‘霞多丽’酿酒葡萄于2021年9月1日采自贺兰山东麓青铜峡产区,葡萄树为5～6年的自根苗,总糖含量(以葡萄糖计)为233 g/L,可滴定酸含量(以酒石酸计)为5.85 g/L,pH值为3.67。

酿酒辅料:Excellence TXL活性干酵母、Vinozym vintage FCE果胶酶、偏重亚硫酸钾、PVPP等,法国Lamothe-Abiet公司。

试剂及标准品:氢氧化钠、亚硫酸氢钠、浓硫酸、氯化钠等均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;C8～C20正构烷烃(≥99.7%,GC);美国Sigma-Aldrich公司;香气物质标品(≥98.0%,GC),日本TCI公司。

1.2 仪器与设备

7890B气相色谱-7000D质谱联用仪、DB-WAX色谱柱(60 m×250 μm,0.25 μm),美国Agilent公司;PAL3自动进样器,瑞士CTC公司;雷磁PHS-3CpH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;ME104E电子天平,瑞士METTLE公司。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄酒酿造工艺

葡萄采收后经除梗、破碎、压榨取汁、澄清后,将葡萄汁装入5 L玻璃发酵罐中,做3个重复,以常规工艺进行发酵。酿造参数为加入60 mg/L偏重亚硫酸钾、30 mg/L果胶酶,4 ℃澄清24 h、分离后接种200 mg/L TXL活性干酵母,发酵温度控制在19～21 ℃。每天在同一时间测量比重、温度和二氧化碳散失量,当比重降至0.994以下时,结束发酵。

1.3.2 发酵过程中的取样

压榨取汁澄清后采样,记为发酵第0天。采样结束后,接种酵母,之后每2 d在同一时间点进行采样,每次采样量为650 mL,直到发酵结束。采样结束后,迅速将需要香气成分检测的样品用液氮淬灭,并将样品放入-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3.3 发酵过程中香气特征感官品评

感官品评样品与香气检测样品同时采样,每次采样结束后,立即对样品进行香气特征感官品评。感官品评小组由20名具有2年以上葡萄酒品尝经验的专业人员(年龄22～30岁、男生8人、女生12人)组成,在标准品酒室(ISO 8589—1998)使用标准品酒杯(ISO 3591—1997)进行品鉴。香气特征感官评分采用0～10分制(0分:无此类香气;1～2分:微弱且较难分辨:3～4分:能分辨但比较微弱;5～6分:能分辨但不够强烈;7～8分:能分辨且强烈;9～10分:非常强烈)[17]。香气特征词汇根据相关文献及品评小组成员共同讨论得出[15-16]。

1.3.4 挥发性成分测定

使用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技术对葡萄酒香气成分进行检测,检测方法参考张众等[18]的研究,并做略作修改。

顶空固相微萃取:将1.5 g氯化钠、5 mL酒样、10 μL 4-甲基-2-戊醇内标(1.008 3 g/L)依次加入20 mL 的顶空瓶中,并加入磁子;将顶空瓶置于集热式恒温磁力搅拌器中,并将纤维萃取头置入顶空瓶中,转速250 r/min,40 ℃萃取30 min。

色谱条件:进样口温度230 ℃;升温程序:起始柱温50 ℃,恒温1 min,3 ℃/min 升到220 ℃,保持5 min;载气高纯氦气(纯度≥99.999%),流速1 mL/min,不分流进样。

质谱条件:传输线温度235 ℃,离子源温度230 ℃,电子能量70 eV;质量扫描范围m/z 29～350。

挥发性物质定性定量分析:提取挥发性成分质谱图,通过NIST 17谱库进行检索,并根据C8～C20烷烃混合标准品的保留时间,用保留指数法(retention index,RI)计算各香气成分的保留指数从而进行定性分析[19]。对有标品的香气成分用其标准曲线进行定量,没有标品的香气成分以4-甲基-2-戊醇为内标进行半定量。对于用标准曲线定量的香气成分,对其香气活度值(odor activity value,OAV)进行计算,半定量的香气成分不计算OAV。

(1)

式中:OAV,香气活度值;香气成分含量,μg/L;香气阈值,μg/L。

1.3.5 数据统计分析

使用Microsoft Office 2016和IBM SPSS Statistics 23软件进行数据统计;使用Origin 2021软件绘制堆积柱状图和雷达图,并基于其中的Heat Map with Dendrogram APP绘制聚类热图。

2 结果与分析

2.1 ‘霞多丽’干白葡萄酒发酵阶段分析

为了将‘霞多丽’干白葡萄酒的发酵阶段进行划分,对发酵时间进行聚类,如图1所示,根据香气成分含量的变化,将发酵过程划分为4个阶段:发酵初期、发酵前中期、发酵中后期和发酵末期。发酵初期包括第0天和第2天,此阶段大多数香气成分含量最低,只有壬酸、正己醇、丙醇、α-松油醇和里那醇的含量较高。发酵前中期为发酵第4天,此阶段大多数香气成分的含量明显升高。发酵中后期包括第6天和第8天,此阶段大多数香气成分的含量进一步提高,但壬酸、正己醇和里那醇的含量降低。发酵末期包括第10天和第12天,此阶段大多数香气成分的含量进一步升高,并达到最大值,但壬酸、己酸甲酯、正己醇、丙醇和己酸异戊酯的含量降低。正己醇和丙醇在在发酵前中期含量最高,在发酵末期含量降低,这是因为正己醇主要在发酵前中期,由来自葡萄皮的脂肪酸前体经酶促和化学氧化形成,不在发酵过程中产生[20],并且不断与乙酸发生反应,生成了乙酸己酯;丙醇只能由苏氨酸通过转氨作用产生,当葡萄汁中的可同化氮耗尽时,丙醇便不再产生,且随着发酵的进行不断散失[21]。

2.2 ‘霞多丽’干白葡萄酒发酵过程中香气成分总量变化

本研究共检测出47种香气成分,可分为酯、高级醇、脂肪酸、类异戊二烯和醛酮类5个类别。为研究‘霞多丽’干白葡萄酒发酵过程中香气成分总量变化,将所有香气成分的含量相加,做成堆积柱状图,如图2-a所示,香气成分总量在发酵初期最低,在发酵前中期和中后期迅速增加,在发酵末期达到最大值,与MORAKUL等[22]的研究结果一致。

在‘霞多丽’干白葡萄酒发酵过程中,不同种类香气成分的含量比例在不断变化,如图2-b所示,发酵第0天,高级醇比例最高,为79%;从发酵第2天至发酵结束,高级醇比例降低,且趋于稳定;酯类比例呈先增加后降低的趋势;脂肪酸比例呈递增趋势,在发酵结束时达到最高;醛酮类和类异戊二烯的占比较低,都低于1%。

2.3 ‘霞多丽’干白葡萄酒发酵过程中不同种类香气成分含量变化

为进一步研究‘霞多丽’干白葡萄酒发酵过程中不同种类香气成分含量变化,继续将酯、高级醇、脂肪酸、类异戊二烯和醛酮类物质的含量做成堆积柱状图。

如图3-a所示,发酵第0天,酒样中酯类物质含量最低,随着发酵的进行,酯类物质的总量递增,发酵第10天时,达到最大值,发酵结束时降低,与胡博然[23]的研究结果一致。月桂酸乙酯、癸酸乙酯等大多数乙酯的含量递增,并在发酵结束时达到最大值,但辛酸乙酯、己酸乙酯的含量在发酵结束时降低;同时乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯等乙酸酯的含量均在发酵结束时降低。酯类物质中含量最高的是乙酸异戊酯。

葡萄酒中酯类物质的释放与平衡分配系数(Ki值)呈正相关性,Ki值主要受温度和葡萄汁成分的影响[24]。发酵末期,酯类物质生产速率降低,生成量减少;并且在发酵末期,酒液中酯类物质浓度逐渐积累到一个最大值,使Ki值不断增大,增强了香气物质的挥发性,最终致使散失量大于生成量,导致发酵结束时酯类物质总量降低。

如图3-b所示,发酵第0天,酒样中高级醇类物质的总量最低,随着发酵的进行,其总量递增,发酵结束时达到最大值,与MOURET等[21]的研究结果一致。正己醇、丙醇的含量在发酵前期含量最高,随后逐渐降低;正丁醇的含量在从第2天开始保持相对稳定;2,3-丁二醇和异丁醇的含量一直递增,并在发酵结束时达到最大值;异戊醇、苯乙醇的含量在发酵第8天达到最大值,发酵结束时略有降低。高级醇类物质中含量最高的是异戊醇。

如图3-c所示,在发酵第0天,脂肪酸类物质的总量最低,随着发酵的进行,逐渐升高,发酵结束时达到最大值,与KONG等[25]研究结果一致。在脂肪酸类物质中,只有乙酸的含量递增,其余脂肪酸的含量在发酵第8天达到最大值后,均在发酵结束时降低。脂肪酸类物质中含量最高的是乙酸。

如图3-d所示,类异戊二烯类物质的总量呈现波动上升的趋势,并在发酵结束时,达到最大值,与等[20]的研究结果一致。发酵第0天,在葡萄汁中检测到了少量类异戊二烯,表明在‘霞多丽’葡萄汁中已经存在一些游离的类异戊二烯;里那醇在第2天大量生成,随后略有降低并保持稳定;其余类异戊二烯类物质均呈现递增趋势。

葡萄酒中游离态的类异戊二烯来自糖苷态类异戊二烯的水解。糖苷态类异戊二烯的水解有两种方式,一是由酿酒酵母产生的糖苷酶的酶解作用,二是在酿造环境下的酸水解。在发酵过程中,葡萄糖的浓度逐渐降低,糖苷酶受到葡萄糖的抑制作用逐渐减弱,活性增强[26];并且随着酒精发酵的进行,整个发酵体系的pH不断降低,酸水解的作用也不断增强[27],最终使类异戊二烯物质的总量在发酵结束时达到最大值。

如图3-e所示,醛酮类物质在发酵第0天含量最低,随着发酵的进行逐渐升高,在第6天达到最大值,随后呈递减趋势,与胡博然[23]的研究结果类似。

2.4 ‘霞多丽’干白葡萄酒发酵过程中香气特征变化

在发酵过程中,会产生大量的香气物质,当香气物质的OAV>1时,便会对葡萄酒的香气特征产生影响[28]。表1是‘霞多丽’干白葡萄酒发酵过程中香气物质OVA表,图4是‘霞多丽’干白葡萄酒发酵过程中香气特征雷达图,可以看到,葡萄汁的香气特征以甜香为主。葡萄汁中只有己酸、α-大马士酮和癸醛的OAV>1,葡萄汁的甜香香气特征可能与与α-大马士酮和癸醛有关。

发酵第2天,乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙醇、苯乙醇、己酸、辛酸的OAV>1,使酒样出现香蕉、苹果、梨、菠萝、蜂蜜的香气特征,柑橘香气特征的出现可能与癸醛有关。发酵第4天,除上述香气成分外,新增OAV>1的有丁酸乙酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯和异丁醇,使酒样的苹果、桃子的香气特征增强,并且上述其他香气特征也随着香气成分含量的增加进一步增强。酒样的柑橘、柠檬香气特征增强,可能与香叶醇和香茅醇的生成有关。发酵第4天,琥珀酸二乙酯的OAV>0.5,虽然<1,但可能与其他香气成分共同起作用,使酒样的甜瓜香气特征增强。

从发酵第6天到第10天,除上述香气成分外,2,3-丁二醇和癸酸从第8天开始OAV>1,分别给酒样带来果香和脂肪味,坚果香气特征增强可能与癸酸有关。酒样的苹果、香蕉、梨、菠萝、甜瓜、柑橘、柠檬、蜂蜜的香气特征评分随着丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸苯乙酯、异戊醇、苯乙醇、香茅醇的含量在发酵第8天或第10天达到最大值。

发酵第12天,2,3-丁二醇、癸酸乙酯的OAV继续增加,上述酯、高级醇和脂肪酸类物质的OAV均降低,导致苹果、香蕉、梨、菠萝、甜瓜、蜂蜜、柑橘、柠檬、坚果的香气特征评分降低。月桂酸乙酯的OAV>1,可给酒样带来花香,洋槐花香气特征评分在第12天到达最大值,可能与月桂酸乙酯有关。

3 结论

在‘霞多丽’干白葡萄酒的发酵过程中,根据香气成分含量的变化,可将发酵过程分为发酵初期、发酵前中期、发酵中后期和发酵末期4个阶段。随着发酵的进行,香气成分总量呈递增趋势,并在发酵结束时达到最大值;高级醇、脂肪酸、类异戊二烯类物质的总量呈递增趋势,在发酵结束时达到最大值;酯类物质总量在第10天达到最大值,在发酵结束时略有降低;醛酮类物质总量在第6天达到最大值,随后逐渐降低。葡萄汁的香气特征以甜香为主,随着发酵的进行,出现了梨、苹果、桃子、甜瓜、菠萝、香蕉、柑橘、柠檬、蜂蜜、坚果和洋槐花的香气特征并逐渐增强;桃子、甜瓜、蜂蜜、坚果、柑橘的香气特征在发酵第8天到达最大值,梨、苹果、菠萝、香蕉、柠檬的香气特征在发酵第10天到达最大值,洋槐花的香气特征在发酵结束时到达最大值。

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Changes in aroma compounds and characteristics of ‘Chardonnay’ dry white wine from the Eastern Foot of Helan Mountain during fermentation

ZHENG Mingpeng1,LI Yajun1,ZHANG Zhong2,HE Xi1,CHEN Fangyuan1,CHEN Jiansheng3,ZHANG Junxiang4,5*

1(College of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)2(College of Life Science, Ningxia University, Yinchuan 750021, China) 3(Ningxia Junxiang Winery Corporation, Yinchuan 750021, China)4(School of Food Science, Ningxia University, Yinchuan 750021, China) 5(Ningxia Grape and Wine Research Institute, Yinchuan 750021, China)

ABSTRACT To investigate the change patterns of aroma components and characteristics of ‘Chardonnay’ dry white wine from the Eastern Foot of Helan Mountain during fermentation, the volatile compounds and olfactory profiles of wine samples were analyzed using the headspace solid-phase microextraction gas-chromatographic mass-spectrometry (HS-SPME-GC-MS) technique and quantitative descriptive analysis (QDA) method. The results showed that the total amount of aroma components, the contents of higher alcohols, fatty acids, and isoprenoids increased as the fermentation proceeded, reaching the maximum at the end of fermentation. The total amount of esters got the highest value on the 10th day and decreased slightly when the fermentation terminated. The concentrations of aldehydes and ketones increased to the peak on the 6th day and then decreased steadily. The aroma of grape juice was described as sweety, which was gradually transferred into stronger flavors of pear, apple, peach, melon, pineapple, banana, citrus, lemon, honey, nut, and acacia flower. The highest sensory scores of peach, melon, honey, nut, and citrus were registered on the 8th day, which of pear, apple, pineapple, banana, and lemon were on the 10th day, and that was at the end of fermentation for acacia flower. This study provides a theoretical basis for the regulation of aroma components and characteristics of Chardonnay dry white wine.

Key words Chardonnay dry white wine; aroma components; aroma characteristics; fermentation process

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034015

引用格式：郑明朋,李亚军,张众,等.贺兰山东麓‘霞多丽’干白葡萄酒发酵过程中香气成分与特征变化[J].食品与发酵工业,2023,49(16):188-195.ZHENG Mingpeng,LI Yajun,ZHANG Zhong, et al.Changes in aroma compounds and characteristics of ‘Chardonnay’ dry white wine from the Eastern Foot of Helan Mountain during fermentation[J].Food and Fermentation Industries,2023,49(16):188-195.

第一作者：硕士(张军翔教授为通信作者,E-mail:zhangjunxiang@126.com)

基金项目：宁夏回族自治区重点研发计划项目(2021BEF02014)

收稿日期：2022-10-18,改回日期:2022-11-10