面条作为亚洲传统的大宗主食品之一[1],在人们的日常生活中充当着重要的角色。据统计,我国用于加工面条的小麦粉约占小麦粉总量的40%[2]。TRAYNHAM等[3]认为传统面条营养价值并不理想,主要体现在其蛋白质含量较低,缺乏人体需要的部分矿物质及维生素。此外,汪桢等[4]认为小麦在加工工程中,其营养品质会有一定程度的损耗。BATIFOULIER等[5]也指出,制粉后的小麦,保留的维生素B1只占据总体的43%。而随着人们生活水平的不断提高,消费者对于面条的需求已逐渐转变为对面条多样化、优质化、营养化的需求。因此,在消费需求和技术升级[6]的双重要求下,谷物面条、蔬菜面条等营养功能型面条越来越受到消费者的欢迎。其中,蔬菜面条相比于普通面条而言,其维生素及矿物质等营养物质[7]均有一定增加。曹庆穗等[8]认为蔬菜面条不仅提高了面条的营养价值,还可增加消费者的食欲,使膳食多样化。
近年来,有关蔬菜面条的研究不断深入。李翼岑等[9]、杜传来等[10]、陈育楷等[11]以蔬菜面条的感官特性、熟断条率及吸水率为指标,利用优化实验已研制出不同蔬菜原料的蔬菜面条配方,张畅等[12]研究了制作蛹虫草蔬菜鱼肉面条的创新工艺。目前,大部分研究都基于蔬菜面条的配方完善与工艺升级,关于蔬菜面条贮藏期间品质变化的研究也大多停留在其色泽、蒸煮品质、质构特性等方面的探讨,而有关于其分子水平下的物质变化研究鲜有报道。
姜黄是常用的药食同源原料,因其含有丰富的姜黄素而具有较强的抗炎症活性;胡萝卜中含有丰富的胡萝卜素、叶酸及膳食纤维;紫甘蓝含有丰富的花青素、维生素及膳食纤维;菠菜中维生素、矿物质、膳食纤维含量也较高。上述4种原料均是制作蔬菜面条的优质原料,成型的面条分别具有黄、橙、紫、绿等颜色,满足消费者膳食多样化的需求。本实验在对这4种蔬菜面条在贮藏期间发生的色泽、质构特性变化的研究基础上,基于超高效液相色谱-高分辨质谱(ultra performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry,UPLC-HRMS)联用的非靶向代谢组学,分别在APCI、ESI 2种离子源的正、负离子2种电离模式下,对不同贮藏时间下的不同种类蔬菜面条样本进行数据采集,并通过火山图代谢物丰度分析、正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)等多因素分析方法,筛选其显著性差异化合物,以进一步探讨蔬菜面条在贮藏期间的代谢组变化规律。
1 材料与方法
1.1 实验材料
中筋小麦面粉,益海嘉丽金龙鱼粮油食品股份有限公司;谷朊粉,高要市蜜丹儿商贸有限公司;姜黄、胡萝卜、紫甘蓝、菠菜,均为市售。
1.2 仪器与设备
MJ-PB12Easy219破壁机,广东美的集团股份有限公司;YP-B10002电子天平,上海光正医疗仪器有限公司;拜杰JCD-5型压面机,安徽鑫佰客电子商务有限公司;DPH-9052型电热恒温培养箱,上海齐欣科学仪器有限公司;MiniSpin微型高速离心机,德国汉堡艾本德生命科学公司;Vortex-2涡旋混匀仪,上海沪析实业有限公司;CT3质构仪,美国布鲁克菲尔德公司;WR-18型精密色差仪,深圳市威福光电科技有限公司;Agilent 1290 infinity II超高效液相色谱仪,美国Agilent公司;Bruker Impact II 四级杆-飞行时间质谱仪,德国Bruker公司。
1.3 实验方法
1.3.1 蔬菜汁制备
参照陈育楷等[11]的方法,将姜黄、胡萝卜称取洗净后切成小块,将菠菜、紫甘蓝去根茎、去残叶、淋洗清洁后,适当切小,放入破壁机中,加水后榨汁(胡萝卜、姜黄和水的料液比为4∶1,菠菜、紫甘蓝和水的料液比为6∶1)。将所得汁液用网筛过滤以除去榨渣及杂质,以待后续使用。
1.3.2 蔬菜面的制作及其贮藏
将140 g小麦面粉,10 g谷朊粉加入和面盆中,将40 mL蔬菜汁多次少量加入后,充分混匀,手工和面5 min。将面团放入压面机中,切换设备为揉面状态,当面团表面光滑无凸起时,将面团从设备中取出,包裹保鲜膜以熟化,10 min后,使面团内部结构更加稳定。熟化10 min后,将面团放入压面机中,并切换设备为压面状态,调好挡位,反复压延至得到均匀厚度为2 mm的面片时,切换设备为切面状态,得到所需蔬菜面条。将制作好的蔬菜面条自然晾干后,放入50 ℃恒温恒湿(相对湿度55%)箱中进行贮藏。分别于0、7、14、21、28 d取样,密闭封装,置于-23 ℃保存,以待后续测定。
1.3.3 蔬菜面色泽测定
色差仪采用L*a*b*色空间法分别测定不同种类的蔬菜面条的色泽,其中L*表示面条的亮度值,a*值表示面条的红绿度,b*值表示面条的黄蓝度。每个样品重复测定10次,取平均值作为最终测试结果。
1.3.4 蔬菜面质构特性测定
1.3.4.1 面条的烹煮处理
参考王灵昭等[13]的方法,取适量面条于沸水中,烹煮5 min后,立即将面条捞出,浸于凉水中10 s,后淋水5 min,放置于托盘中以待后续测定。
1.3.4.2 全质构分析(texture profile analysis, TPA)测定
采用质构仪的TPA模式测定蔬菜面条的质构特性,测试用探头为TA10,设置测前速率、测试速率、测后速率均为:0.8 mm/s,压缩程度为75%,2次压缩停留时间间隔为10 s,触发值为5 g[14];TPA主要研究指标为硬度、弹性、黏结性等。每个样品重复测定8次,去除最高值和最低值,取平均值作为最终测试结果。
1.3.5 代谢物检测分析
1.3.5.1 代谢物提取
将样品研磨至细腻粉末状,取1 g装入5 mL离心管中,加入1 mL的80%(体积分数)丙酮水溶液提取,涡旋充分振荡后,静置5 min。于8 000 r/min下离心5 min,用0.2 μm滤膜过滤后于-20 ℃保存,每1组代谢物设置6组平行样品,用于后续LC-HRMS分析。
1.3.5.2 超高效液相色谱质谱条件
采用UPLC-HRMS进行,UPLC型号为Agilent 1290,配有自动进样系统。液相分析条件:分析柱为C18柱(Poroshell 120, 1.9 μm),2.1 mm×100 mm,并配有同等材质的保护柱。UPLC流速0.2 mL/min,流动相A为V(甲醇)∶V(水)=8∶2,流动相B为V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1,流动相中均加入10 mmol/L 乙酸铵,进样量为10 μL。采用梯度洗脱程序:0～15 min,25% B～100% B;15～25 min,100% B;25.1～30 min,25% B。质谱条件为:利用ESI和APCI源对4种蔬菜面条样品分别进行正离子、负离子模式下的质谱分析,进行MS及MS/MS扫描。正离子模式设置参数为:质量范围 60～3 000 m/z,雾化气流速为2 Bar,干燥气流速为8 L/min,干燥气温度为220 ℃。毛细管电压为4 500 V,末端平板电压为500 V,裂解能量7 eV。负离子模式设置参数为:质量范围 300～3 000 m/z,雾化气流速为2 Bar,干燥气流速为 8 L/min,干燥气温度为220 ℃。毛细管电压为3 500 V,末端平板电压为500 V,裂解能量10 eV。
1.4 数据统计分析
利用MS-DIAL提供的Abf Converter将数据转换为Abf.格式后,通过MS-DIAL对数据进行峰对齐、矫正保留时间、提取峰面积操作,然后匹配MS/MS数据库及软件自建二级质谱数据库进行代谢物注释,按不同样品中同一代谢物的不同峰面积构建代谢物峰表,采用基迪奥平台对同一种类的蔬菜面条,在不同贮藏时间的数据进行两两比较,分别进行T检验、火山图分析、OPLS-DA等多元统计分析,结合变量投影重要性(variable important in projection,VIP)值、差异倍数(fold change,FC)值、P值对样本进行差异化合物的筛选。采用Excel对数据进行初步分析,后利用Origin 2019软件绘制相关变化关系图。
2 结果与分析
2.1 不同贮藏时间下蔬菜面条的色泽变化
不同种类的蔬菜面条颜色指标随贮藏时间变化如图1所示。结果表明:随着贮藏时间的延长,姜黄、胡萝卜、紫甘蓝、菠菜面条的L*值皆不断下降,亮度降低,面条颜色发暗,该结果与陈艳等[14]得出的小麦面条随贮藏时间变化的L*值降低的结论一致。本实验中蔬菜面条L*值在10 d内的下降趋势最明显,10 d后变化幅度较小,逐渐趋于稳定,这与郭颖等[15]的研究结果部分吻合。姜黄、胡萝卜、紫甘蓝、菠菜面条的b*值皆随着贮藏时间的延长不断上升,黄度上升,面条颜色变黄,该结果与张芹等[16]认为面条色泽变化与脂肪氧化颜色加深,挂面面筋在贮藏过程中颜色发暗有关,即b*值不断上升的研究结论一致。本实验中姜黄面条、菠菜面条的b*值上升较为显著。造成这种变化的原因一方面是小麦粉的颜色随贮藏时间的延长,逐渐由乳白色变为淡黄色[17];而另一方面的原因为植物中色素、多酚含量及稳定性差异所导致的,JIANG等[18]认为游离态酚类能显著影响面条褐变的程度。相比于L*、b*值,a*值的变化较小,几乎没有显著变化。
a-姜黄面条;b-胡萝卜面条;c-紫甘蓝面条;d-菠菜面条
图1 不同种类蔬菜面条L*、a*、b*值随贮藏时间延长的变化
Fig.1 Changes of L*, a*, b* values of different kinds of vegetable noodles with storage time
2.2 不同贮藏时间下蔬菜面条的质构特性变化
不同种类的蔬菜面条其质构特性随着贮藏时间的变化如图2所示。结果表明:随着贮藏时间的延长,4种蔬菜面条的硬度都逐渐升高,且上升趋势较为明显。闫慧丽等[19]认为面条在常温贮藏环境中,面粉中的蛋白质与淀粉并未充分结合,其面筋网络结构遭到一定程度的破坏,导致其蛋白质和淀粉在烹煮过程中流失,所以其硬度随之下降,而本实验中4种蔬菜面条硬度随贮藏时间延长而升高,导致这一不同的原因可能是本实验中,模拟加速贮藏的环境温度为50 ℃高温,高温环境加速了面条中水分的流失,而导致了面条硬度上升,这与张芹等[16]研究贮藏温度对面条品质影响中的结果相符合。随着贮藏时间的延长,4种面条的弹性皆先逐渐增大再减小,弹性是由麦谷蛋白内部的网络化结构所影响的[20],而这一变化可能是由小麦粉在贮藏期间,其低分子质量麦谷蛋白含量逐渐降低,高分子质量麦谷蛋白含量增加所导致的,而面粉中的麦谷蛋白微观网络结构的完整性随贮藏时间的延长而遭到一定程度的破坏,导致面条弹性在贮藏后期下降。随着贮藏时间的延长,蔬菜面条的黏结性总体呈上升趋势,这一变化产生的原因可能是高温使面条的内部分子作用力增强,使面条黏聚在一起的内聚力增大,所以表现为黏聚力上升。而随着贮藏时间的延长,姜黄、胡萝卜、紫甘蓝、菠菜面条的咀嚼性随硬度的上升表现为上升趋势。
a-硬度;b-弹性;c-黏结性;d-咀嚼性
图2 四种蔬菜面条质构特性随贮藏时间的变化情况
Fig.2 Changes of texture properties of different vegetable noodles with storage time
2.3 不同贮藏时间下蔬菜面条代谢物的代谢组学检测分析
基于UPLC-HRMS技术分别在APCI、ESI 2种离子源的正、负离子2种电离模式下对不同贮藏时间下的不同种类蔬菜面条样本进行数据采集。将0、28 d的蔬菜面样品进行比较,经过预处理的数据在APCI、ESI离子源正离子模式下保留了17 336个峰,负离子模式下保留了19 674个峰,剔除可能的假阳性代谢物后,共鉴定出6 568种代谢物,以FC>2,VIP>1,P值<0.05作为筛选标准后,在正、负离子模式下分别筛选出243种、129种差异代谢物,共得到372种差异化合物含量信息。从整体而言,无论是APCI离子源下的2种模式,还是ESI离子源下的2种模式,正离子模式下所检测出的差异化合物比负离子模式下的差异化合物更为丰富,说明正离子模式下对蔬菜面条中的差异化合物的检测覆盖率更高、种类更丰富。
2.4 不同贮藏时间下蔬菜面条代谢物OPLS-DA
2.4.1 OPLS-DA
OPLS-DA作为偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)的扩展[21],因其可以在有监督的前提下进一步放大样本组间差异,更好地表达样本的离散趋势,且相较于PLS-DA,滤除了与分类信息无关的噪音,进一步提高模型的解释和预测能力,已成为代谢组学中常用的分析方法。对预处理后的蔬菜面条样本数据采用有监督的OPLS-DA,并进行建模处理。这里以ESI离子源下的贮藏时间为0、28 d的胡萝卜面条的OPLS得分图为例,对其进行分析阐述。其正、负离子模式下的OPLS得分图如图3所示。
a-ESI离子源正离子模式下的OPLS-DA得分图;b-ESI离子源负离子模式下的OPLS-DA得分图
图3 ESI离子源正、负离子模式下的胡萝卜面条OPLS-DA得分图
Fig.3 OPLS-DA score chart of carrot noodles in positive and negative ion modes of ESI ion source
由图3可知,贮藏时间分别为0、28 d的胡萝卜面条样品,在OPLS-DA模型中较好地分成2组,每组里包含6个数据点,表明2组样品数据有较好的可重复性,因此可用于后续分析。此外,2组样本都置于95%置信区间内,区分显著,表明贮藏时间分别为0、28 d下的胡萝卜面条,其相关代谢物有显著差异,差异体现在代谢物类别、数量、浓度等方面。其中正离子模式下的胡萝卜面条得分图中,R2X=0.933,R2Y=0.98,Q2Y=0.971;而负离子模式下的胡萝卜面条得分图中,R2X=0.931,R2Y=0.975,Q2Y=0.965。其中R2X、R2Y分别对应该模型对于自变量X、因变量Y的解释率,Q2Y表示模型的预测能力,且三者值越接近1,表示模型的预测及解释能力越可靠。因此,上述2个模型稳定性较好,具有稳健可靠的预测及解释能力,能很好的解释贮藏时间分别为0、28 d的胡萝卜面条样本间的差异。
2.4.2 OPLS-DA模型检验
不同于主成分分析(principal component analysis,PCA)、非线性映射等无监督的统计分析方法,有监督的多变量统计分析方法,如PLS-DA、OPLS-DA可以进一步放大样品组间差异,更好地表达其离散趋势,方便进一步筛选差异化合物。同时,有监督的多变量统计分析方法也存在一定缺点,即模型可能出现过拟合现象,表现为当用模型来预测新的样品集时,其预测能力较差。因此对于此类模型,仍需验证模型的可靠性,避免其出现过拟合现象。本实验采用OPLS-DA置换检验方法来检验模型。这里仍以ESI离子源下的贮藏时间为0 d和28 d的胡萝卜面条的OPLS-DA置换检验模型为例,对其分析进行阐述。其正、负离子模式下的OPLS-DA置换检验图如图4所示。
a-ESI离子源正离子模式下的OPLS-DA置换检验图;b-ESI离子源负离子模式下的OPLS-DA置换检验图
图4 ESI离子源正、负离子模式下的胡萝卜面条OPLS-DA置换检验图
Fig.4 OPLS-DA replacement test chart of carrot noodles in positive and negative ion modes of ESI ion source
一个可靠的有监督模型要求其回归线在Y轴上的截距小于0,即Q2<0,即可证明该模型不存在过拟合现象,模型可靠。由图4可知,正、负离子模式下的Q2<0,表明OPLS-DA模型不存在过拟合现象,进一步验证了所建OPLS-DA模型能有效地区分2组样本。
2.5 不同贮藏时间下蔬菜面条差异化合物丰度变化分析
在ESI和APCI正、负离子模式下,在鉴定出6 568种代谢物中,本实验以差异倍数FC>2,VIP>1,P值<0.05作为显著差异化合物筛选标准,对同种类蔬菜面条的不同贮藏时间下的样品两两进行比较,绘制火山图。在鉴定出的372种差异化合物中,APCI离子源下筛选出219种差异化合物,ESI离子源下筛选出153种差异化合物,综合比较,APCI离子源下筛选出的代谢物更为丰富,同时因其正离子模式下代谢物检出覆盖率更高,因此,以APCI离子源正离子模式下的检测样本分析贮藏时间为0、28 d的蔬菜面代谢物丰度,结果如图5所示。以胡萝卜面条代谢物为例(图5-b),APCI离子源下通过比较该2组样品共得到126种差异化合物,其中上调的代谢物有81种,下调的代谢物有45种。
a-姜黄面条;b-胡萝卜面条;c-紫甘蓝面条;d-菠菜面条
图5 APCI离子源正离子模式下的贮藏时间为0、28 d的4种蔬菜面条代谢物火山图
Fig.5 Volcano map of four vegetable noodles metabolites stored for 0 d and 28 d in positive ion mode of APCI ion source
2.6 不同贮藏时间下蔬菜面条显著性差异化合物筛选
代谢物的FC能够反映该代谢物在2组样本之间的表达倍数关系,由于FC的绝对值越大,表示该代谢物在2组样本间的含量差异越大,因此通过更严格的筛选标准,即FC>2.5,VIP>1、P<0.5,进一步比对筛选,并统计出4种不同种类蔬菜面条随着贮藏时间变化而鉴定出的显著性差异化合物,姜黄面条、胡萝卜面条、紫甘蓝面条、菠菜面条随着贮藏时间变化而鉴定出的显著性差异化合物如表1所示。
表1 四种蔬菜面条随贮藏时间变化而鉴定出的显著性差异化合物
Table 1 Significantly differential metabolites identified in turmeric noodles with storage time
注:代谢物右上数字表示代谢物的来源:1,姜黄面条;2,胡萝卜面条;3,紫甘蓝面条;4,菠菜面条;↑,上调;↓,下调。
代谢物名称分子式贮藏时间0 d7 d14 d21 d28 d变化咖啡酰奎宁酸1C16H18O92 57329 47535 41929 96321 039↑异戊二烯醇1C20H34O9 95720 30112 10824 511214 953↑马钱子碱2C21H22N2O21 72265 86275 58183 33162 977↑烟酰胺2,4C16H18N4O2125 890179 424199 077171 835306 099↑275 88595 717285 033243 608237 750↑4玉米赤霉烯醇2C18H24O56 80852 33248 98610 82121 417↑十六烷二酸2C16H30O4736 119180 39631 588 8931 666 2921 867 758↑鞘氨醇2C26H39NO380 49174 98973 32972 57566 977↓胡萝卜甾醇2C35H60O67 79427 08734 62752 59558 764↑多酚A2C33H52O89 77221 07437 09429 77535 735↑(E)-白藜芦醇3C20H22O920 21218 293157 759209 726186 977↑榄香烯3,4C19H20O34 4996 9263 21742 28053 906↑33 7983 28118 61322 14222 651↑4银杏内酯A3,4C20H24O916 43117 17965 745115 13156 767↑316 13516 76084 065111 16655 239↑4磷脂酰甘油酯3C40H75O10P3 6391 47411 06024 36115 498↑异硫素4C25H32N2O498 73799 37382 54843 2321 742 248↑泛硫乙胺4C22H42N4O8S26 1162 4556 31233 02423 094↑儿茶素四甲醚3,4C19H22O65 7967 2615 80612 96121 525↑45 85336 71515 80114 99937 261↑3茄酸1C21H20O7245 664105 610155 886100 42484 822↓亚油酸1C18H32O2212 777175 860125 24475 48774 052↓油酸1C18H34O239 99428 65527 24120 11010 153↓γ-亚麻酸1C18H30O231 23626 65029 18328 73212 722↓山奈酚-7-O-葡萄糖苷1C21H20O1115 26214 74226 2407 5054 009↓莨菪碱2C17H23NO31 025 484165 489160 889512 634167 254↓甘草素2C26H32O551 99947 17149 59238 20438 519↓[6]-姜酚4C17H26O4394 248499 993364 906110 01744 400↓
由表1可知,随着贮藏时间的延长,蔬菜面条的显著性差异化合物中,花椒碱等生物碱,烟酰胺等维生素、胡萝卜甾醇等植物甾醇等物质含量呈现上调变化,可能与花椒碱、胡萝卜甾醇等在贮藏过程中由结合态转变成为游离态有关。亚油酸、γ-亚麻酸等脂肪酸,甘草素等黄酮类化合物,茄酸、莨菪碱等生物碱,多酚类化合物与萜苷类化合物等物质含量呈现下调变化。亚油酸、γ-亚麻酸等不饱和脂肪酸因其氧化速率较快,导致其含量不断降低,且贮藏温度越高,脂肪氧化速率越快[22]。菠菜、胡萝卜中维生素C、多酚等抗氧化活性物质含量较高,具有良好的抗氧化活性,而随着贮藏时间的延长,多酚类化合物含量随之下降,营养价值降低。本实验发现的差异化合物可以进一步作为蔬菜面质量与品质控制的指标,通过对比差异化合物的理化性质与变化规律进一步完善蔬菜面条加工工艺与贮藏条件,以求最大程度保留其营养价值,而关于部分生物碱等小分子物质在蔬菜面条中的变化与面条品质关系的探讨还有待进一步研究。
3 结论
通过本实验结果发现,随着贮藏时间的延长,姜黄、胡萝卜、紫甘蓝、菠菜4种蔬菜面条在色泽、质构特性、代谢化学成分3个方面都发生了显著变化。随着贮藏时间延长,4种蔬菜面条的L*值都不断下降,表现为面条亮度降低,颜色发暗;而b*值随贮藏时间的延长不断上升,表现为面条黄度上升,颜色变黄;a*值无明显变化。随着贮藏时间的延长,4种蔬菜面条的硬度都逐渐升高,弹性逐渐增大后减小,黏聚性总体增大。通过非靶向代谢组学分析方法获得的6 568种代谢物信息中,根据筛选标准(FC>2,VIP>1,P<0.05)共筛选出372种差异化合物,其中有24种显著性差异化合物(FC>2.5,VIP>1,P<0.05)。随着贮藏时间的延长,4种蔬菜面条中的多酚类、黄酮类、脂肪酸类物质都表现为显著下调,而部分植物甾醇、维生素、生物碱等物质表现为显著上调。研究结果可为后续蔬菜面条营养保健功能及质量标准控制提供借鉴和参考。
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