铁皮石斛(Dendrobium officinale)在药食同源中分类属于名贵中药材,被广泛应用于各种滋补、营养的食品、保健品中,在我国已经有2 000多年的发展应用历史。铁皮石斛中富含多糖、联苄衍生物、石斛生物碱、类黄酮和氨基酸类等多种活性成分,铁皮石斛的功效作用有抗氧化活性、降血糖、抗肿瘤、调节机体免疫等[1-3],其药用价值在药食同源中极高,因此铁皮石斛被广泛应用于食品中。
铁皮石斛的传统药用及食用部位为茎,且研究侧重于茎方面,石斛茎采收时石斛花、叶、根通常会被忽视而做废弃处理。据文献报道铁皮石斛经微生物发酵后多糖、黄酮、酚类等活性物质含量会增加[4],可增强其抗氧化、降血糖的活性[5]。越来越多的人研究报道铁皮石斛在发酵酒中的应用。任红运等[6]、史学琴等[7]、赵红等[8]利用混菌发酵的方法,有利于铁皮石斛的各种活性物质更好地溶出,使发酵酒的风味更加丰富,营养品质提升。将铁皮石斛渗入黄酒发酵工艺中,得到的黄酒口感爽快,营养价值丰富[9]。随着铁皮石斛在创新产品深加工多样性方面的不断丰富发展,被人们忽视的铁皮石斛叶、花和根的活性成分含量等各种研究和深加工利用也开始备受关注。譬如,铁皮石斛花与人参果共同发酵得到清香爽口的人参果铁皮石斛花复合果酒[10],铁皮石斛叶与苦荞发酵得到苦荞铁皮石斛叶复合发酵酒[11]。
近年来,基于铁皮石斛茎丰富的活性物质,其在发酵酒中的应用较多,铁皮石斛花和叶在发酵酒中的应用也有极少的研究报道,而根在发酵酒中的应用几乎没有。该文从铁皮石斛根、茎、叶、花的活性成分在混菌发酵米酒的含量变化和理化指标及感官评价方面进行论述,研究4种石斛部位发酵米酒在酿酒酵母和异常威克汉姆酵母混合发酵后的品质比较,旨在扩展铁皮石斛根、花、茎、叶资源更进一步地利用,促进铁皮石斛叶、茎、花、根不同部位相关产品的深加工,提高铁皮石斛的经济附加值,提高铁皮石斛根、茎、叶和花的综合利用度。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料:铁皮石斛,贵州省贵定县绿春农业发展有限公司;有机糯米,辽宁省大连市大连德禾鑫农产品加工有限公司。
菌种:酿酒酵母FBKL2.8022(Saccharomyces cerevisiae,Sc),从贵州传统块状小曲中分离筛选[12],贵州省发酵工程与生物制药重点实验室鉴定保藏,保藏编号CCTCC NO:M2019406;异常威克汉姆酵母FBKL2.8023(Wickerhamomyces anomalus,Wa),从贵州传统块状小曲中分离筛选[13],贵州省发酵工程与生物制药重点实验室鉴定保藏,保藏编号CCTCC NO:M2019412。
试剂:α-淀粉酶(3 700 U/g)、糖化酶(≥10 万U/g),北京索莱宝科技有限公司;葡萄糖标品,阿拉丁试剂(上海)有限公司;没食子酸、芦丁、福林酚、磺基水杨酸,上海源叶生物科技有限公司;2-辛醇标准品,上海麦克林生化科技有限公司;浓硫酸、浓盐酸,重庆川东化工(集团)有限公司;氢氧化钠、六水氯化铝,四川西陇科学有限公司;苯酚,天津市永大化学试剂有限公司;无水乙醇,天津市富宇精细化工有限公司;亚硝酸钠,天津市优谱化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
YXQ-75SII立式蒸汽压力灭菌锅、SPX-250B生化培养箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;GFL-230电热鼓风干燥箱,天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司;PHS-3C精密pH计,上海日岛科学仪器有限公司;NP-30S漩涡混合仪,常州恩培仪器制作有限公司;LC-LX-H185C台式高速离心机,上海力辰邦西仪器科技有限公司;LT1002E电子天平,常熟市天量仪器有限责任公司;721紫外可见分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司;S-10生物传感器分析仪,深圳市西尔曼科技有限公司;固相微萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美国Supelco公司;1260安捷伦高效液相色谱仪、7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪,安捷伦科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 米酒发酵
采用Sc和Wa进行混合发酵,分别为混菌发酵铁皮石斛根(Do-Ro),混菌发酵铁皮石斛花(Do-Fl),混菌发酵铁皮石斛茎(Do-St),混菌发酵铁皮石斛叶(Do-Fo),未添加铁皮石斛作为对照(BC)。
称取50.0 g糯米加入250 mL蒸馏水浸泡过夜,沥干水分,于121 ℃灭菌40 min,灭菌后待糯米冷却至室温,添加糖化酶0.56%、淀粉酶1.89%(添加量以糯米干重为基准)和75 mL无菌水,60 ℃水浴30 min。将Sc和Wa接种到冷却至常温的糯米中(接菌比例为Wa∶Sc=1∶10,接菌量为1×106 cell/mL)。添加铁皮石斛粉2.5 g,置于30 ℃恒温条件下培养,每24 h称重1次并记录,当失重小于0.2 g/d即为发酵停止,发酵结束后检测发酵液中的相关成分。
1.3.2 铁皮石斛米酒发酵工艺流程
铁皮石斛米酒发酵工艺流程如下:
鲜铁皮石斛→挑选分类(根、茎、叶花)→烘干粉碎→扩大培养→活化→菌种→糯米浸泡→蒸粮→糖化→接菌→发酵→过滤→陈酿
1.3.3 理化指标
pH用pH计直接测定。总酸参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法进行测定。酒精度的测定,将发酵酒样稀释100倍,利用生物氧化酶膜电化学传感器吸取25 μL进行待测酒样的酒精浓度检测。还原糖参照NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的测定 3,5-二硝基水杨酸比色法》。采用苯酚-硫酸法[14]测定石斛米酒总糖含量。
1.3.4 主要活性物质测定
多糖的测定,同1.3.3节总糖测定方法。黄酮的测定参照缪园欣等[15]测定黄酮的方法。总酚的测定参照朱明明等[16]测定总酚的方法。样品制备,铁皮石斛多糖采用水提醇沉法提取并用Savage脱蛋白[17];黄酮和总酚的提取参照刘瑾等[18]、汪江波等[9]的提取方法。
1.3.5 米酒感官评价
感官评价:选择10名专业人员,从石斛米酒的口感、色泽、香气、组织状态4个指标进行评定,满分100分,感官评分结果取平均值,评价标准见表1。
表1 米酒感官评价
Table 1 Sensory evaluation of rice wine
感官指标评分标准分数/分口感(40分)酸味纯正、甜度适中、口感柔和酸味刺激、口感一般酸味刺激、口感粗糙31^4021^30 0^20色泽(15分)色泽均匀、呈淡红色或红棕色色泽均匀、呈黄红色或浅棕色泽不匀、呈淡黄色淡棕色11^15 6^100^5气味(30分)香味协调,有石斛和发酵特有的风味香味一般,酒味不明显香味淡或无香味,有异味26^3021^25 0^20组织状态(15分)酒液均匀一致,无分层酒液均匀,略有分层酒液不均匀,有大量沉淀,分层明显11^15 6^100^5
1.3.6 挥发性风味物质测定
发酵液中挥发性成分测定参考史学琴等[7]的方法,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法。质谱数据的定性分析通过比较保留指标和鉴定化合物的质谱进行验证;以2-辛醇为内标,不考虑挥发性化合物的回收率和响应因子,对各种挥发性化合物进行定量分析。
1.3.7 数据处理
所有实验设置3个平行,所得数据通过IBM SPSS Statistics 26.0进行单因素检验并分析差异显著性,利用由Excel 2016、Origin 2018 64Bit、联川生物云平台等进行图表的绘制。
2 结果与分析
2.1 理化指标分析
米酒在发酵中,酵母菌利用糖类物质转化产生酒精、CO2等物质,依据CO2失重变化(失重<0.2 g/d)判定发酵终点。如图1所示,采用Sc、Wa混合发酵铁皮石斛4种不同部位的米酒,在发酵第6天失重已小于0.2 g/d,后期发酵状态稳定,4种米酒均在第9天达到发酵终点;未添加铁皮石斛的米酒则是在发酵第7天趋于平缓,在第10天达到发酵终点。Do-Fo米酒总失重为20.88 g,Do-Fl米酒为20.38 g,Do-St米酒为20.20 g,Do-Ro米酒为20.04 g,BC米酒为19.04 g,添加铁皮石斛的米酒在发酵期间整体失重变化无显著差异,石斛花、叶在发酵前期失重略高于石斛茎、根,但未添加铁皮石斛的米酒显著低于其他。因此,添加铁皮石斛不同部位可有效促进米酒的发酵,缩短发酵周期。
图1 米酒发酵过程中CO2失重变化
Fig.1 Changes in weight loss of CO2 during rice wine fermentation
米酒发酵后的基本理化指标如表2所示,米酒因铁皮石斛不同部位的化学成分差异而存在一定的差异。铁皮石斛花、叶、茎、根发酵米酒的酒精含量无显著差异,均显著低于BC米酒,铁皮石斛不同部位对酒精发酵均有抑制作用。添加铁皮石斛后米酒中还原糖、总糖含量显著增加,Do-Fo和Do-St米酒均显著高于Do-Fl和Do-Ro。据文献报道铁皮石斛茎多糖含量(34.61%)>叶(23.51%)>花(13.47%)[19],石斛根的多糖约是茎多糖的1/5[20],微生物发酵有利于石斛中多糖释放并降解为小分子糖类物质,因此,发酵中添加叶和茎的米酒糖含量较高,初步推测添加铁皮石斛后米酒中增加的一部分糖可能来自于原料或酵母对原料的转化。Do-Fl、Do-Fo、Do-St、Do-Ro、BC米酒的pH依次减小,总酸含量则呈现相反的变化,5种米酒pH和总酸变化相对应,pH越低,总酸含量越高,反之越低。
表2 米酒的理化指标
Table 2 Physicochemical indexes of rice wine
注:不同小写字母表示各组间差异显著(P<0.05)(下同)。
米酒酒精含量/(g/L)还原糖/(g/L)总糖/(g/L)pH总酸/(g/L)Do-Fl142.67±1.15b4.87±0.89b30.13±4.77b4.40±0.02b2.79±0.21cDo-Fo136.67±3.79b6.00±0.12a62.38±1.23a4.35±0.02bc2.89±0.26cDo-St140.67±10.97b6.04±0.04a65.09±1.21a4.32±0.02cd3.42±0.96abDo-Ro149.00±7.81b4.34±0.20b34.34±3.19b4.29±0.01d3.53±0.27aBC278.00±4.00a2.26±0.28c22.91±1.52c4.65±0.06a3.04±0.09c
2.2 主要活性物质分析
铁皮石斛中含有多糖、石斛碱、黄酮、酚类等多种功能活性物质,不同部位多糖、黄酮类、酚类等有显著差异[21]。因其不同部位活性物质差异,铁皮石斛花、叶、茎、根发酵的米酒与对照组米酒,其活性物质含量有显著差异。如表3所示,添加铁皮石斛后发酵米酒中活性物质显著增加,铁皮石斛不同部位其活性物质含量也有显著差异,因此铁皮石斛花、叶、茎、根发酵的米酒活性物质含量也存在差异。米酒中总酚含量为Do-Fl>Do-Fo>Do-St>Do-Ro>BC,而铁皮石斛不同部位总酚含量为花>叶>根>茎,这与黄彪等[22]研究几乎一致,因此Do-Fl米酒总酚含量最高为721.02 mg/L。本研究中铁皮石斛黄酮含量为花>叶>根>茎,与耿文慧等[23]的研究中铁皮石斛黄酮含量为花>叶>茎的结果相似,值得注意的是在发酵米酒中黄酮含量为Do-Fo>Do-Fl>Do-Ro>Do-St>BC,添加铁皮石斛叶发酵的米酒黄酮含量最高。真菌会产生可降解植物细胞壁的一系列酶[24-25],因此Do-Fo米酒中黄酮含量最高,这可能与酵母菌内在酶系降解铁皮石斛叶细胞壁从而释放其黄酮等活性成分有关。铁皮石斛多糖含量为茎>叶>花>根,这与张志信等[26]、尚喜雨[27]研究结果一致。铁皮石斛多糖为葡甘露聚糖,其单糖组成主要是葡萄糖、甘露糖[28-30]。发酵米酒中多糖含量为Do-St、Do-Fo>Do-Fl>Do-Ro>BC,Do-Fo和Do-St中多糖含量显著高于Do-Fl和Do-Ro,这与前文Do-Fo和Do-St米酒中还原糖、总糖结果一致。有趣的是Do-Fo和Do-St米酒中多糖含量几乎一致,这可能是因为酿酒酵母发酵能有效降解发酵所得胞外多糖,将大分子多糖降解成小分子多糖[31],把机体不易吸收的大分子物质进行降解并用于新陈代谢[32]。因此,推测酵母菌丰富的酶系能够更好地促进铁皮石斛叶中多糖溶出。
表3 米酒及铁皮石斛的活性物质含量
Table 3 The content of active substances in rice wine and Dendrobium officinale
注:不同大写字母表示各组间差异显著(P<0.05)。
指标总酚/(mg/L)黄酮/(mg/L)多糖/(g/L)米酒Do-Fl721.02±21.09a381.63±10.37a0.92±0.08bDo-Fo674.19±24.57b400.99±14.33a1.11±0.04aDo-St525.21±14.82c183.77±11.69c1.12±0.07aDo-Ro519.23±16.18c225.56±28.21b0.76±0.09cBC373.20±11.45d44.70±3.45d0.69±0.03c石斛部位Fl24.47±0.16A11.30±1.03A75.65±1.04CFo17.32±0.82B9.88±2.17A118.86±0.46BSt3.12±0.16D1.00±0.04B266.37±1.53ARo6.07±0.16C2.41±0.22B9.77±0.33D
2.3 感官评价分析
对发酵后米酒的色、香、味、形进行感官评价,评分结果如表4所示。5种米酒中Do-Fl米酒的感官评分最高,其口感和气味的感官评分也是最高的。
表4 米酒感官评价分析结果
Table 4 Results of sensory evaluation analysis of rice wine
米酒口感色泽气味酒体状态总分/分Do-St 31.20±1.20b13.70±0.48a24.70±1.49a13.30±0.48ab82.90±2.18bDo-Fo34.00±1.49a13.70±0.48a24.00±2.45a13.70±0.67a85.40±3.44abDo- Fl35.50±1.58a13.30±0.95a25.20±1.87a12.80±0.63b86.80±1.75aDo-Ro29.40±1.68b11.50±0.97b24.00±2.11a11.50±1.27c76.40±5.38cBC30.60±1.17b13.10±0.99a24.00±1.83a13.50±0.85a81.20±1.93b
2.4 挥发性风味物质分析
在5种米酒中共检测到47种挥发性物质,其中醇类物质共17种,酯类物质16种,烷烃类物质共4种,2种醛类,4种酸类,1种烯烃,1种酮,1种挥发性酚类,1种有机化合物,具体检出的挥发性风味物质见附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033542)。铁皮石斛根、花、茎、叶4个部位发酵的米酒与对照组米酒,挥发性风味物质的组成有所不同,米酒中挥发性风味物质的含量、丰度及百分比组成分如附表1和图2所示。Do-Ro、Do-Fl、Do-St、Do-Fo、BC米酒中挥发性风味物质的含量分别为60.00、61.21、51.17、64.71、100.01 mg/L;添加铁皮石斛后米酒中挥发性风味物质含量显著降低,其中主要降低的是醇类;在铁皮石斛不同部位发酵的米酒中,根发酵的米酒挥发性风味物质含量最高,花发酵的米酒挥发性成分最丰富,且米酒的挥发性风味物质以醇类和酯类物质为主。
a-米酒中挥发性风味物质聚类热图;b-挥发性风味物质个数3D柱状堆积图;c-挥发性风味物质百分比含量3D柱状图
图2 米酒中挥发性风味物质组成及差异
Fig.2 Composition and differences of volatile flavor compounds among rice wine
注:图a中的数字对应附表1的物质序号。
醇类物质是酒中重要的呈香物质,适量的挥发醇可以增加酒体的醇香,对酒的香气贡献作用大[33]。5种米酒中含量较多的高级醇主要有异丁醇、正丁醇、2,3-丁二醇、苯乙醇,适量的高级醇可使酒体更加协调,苯乙醇可赋予米酒更丰富的花果香味;2,3-丁二醇会产生类似黄油、奶油的香味,是为数不多的可呈香的多元醇之一[34];乙醇对米酒的呈香、发酵酒精具有积极作用。相较于BC米酒,添加铁皮石斛发酵的米酒中醇类物质含量显著减少,主要是乙醇、异戊醇的减少;相反苯乙醇、异丁醇含量增加;Do-Fl米酒中醇类物质含量最多,种类也较为丰富,一缩二丙二醇、3-己烯-1-醇、丙醇是铁皮石斛花发酵的米酒中特有的3种醇类物质;Do-St米酒中醇类物质含量虽最少,但其种类较多,米酒中独有的2-庚醇具有花果香,芳樟醇(阈值为6 μg/L)具有花果香、草木香[35];1-戊醇是Do-Fo米酒中检出的一种特有的醇类物质。
酯类主要为酒提供水果、鲜花、甜味和牛奶风味[36],发酵米酒中呈酯香的酯类主要是辛酸乙酯(阈值5 μg/L,主要参考贾丽艳等[37]的研究,下同)、月桂酸乙酯(阈值400 μg/L)、乙酸乙酯(阈值12.27 mg/L)[38]。相较于BC,添加铁皮石斛后,Do-Fl和Do-St米酒中酯类物质种类减少,大部分酯类含量也减少;相反Do-Ro和Do-Fo米酒中酯类含量显著增加,Do-Ro中最主要的正己酸乙酯增加了约4倍。铁皮石斛根、花、茎发酵的米酒中均检出的乙酸异戊酯呈现果香味;米酒均含有的辛酸乙酯、癸酸乙酯(阈值为200 μg/L)具有花果香味,在Do-Ro米酒中含量最高,此外,辛酸乙酯还具有白兰地的酒香味。Do-Ro米酒中酯类物质含量最高为10.58 mg/L,在米酒中的百分比为16.35%,也是占比最高的。Do-Ro米酒中差异性挥发风味物质主要是酯类物质,包括癸酸乙酯、十四酸乙酯、棕榈酸乙酯、正己酸乙酯(阈值14 μg/L)、3-苯丙酸乙酯等,这些酯类物质大多数具有酯香,可丰富米酒的香气;Do-Fo、BC米酒中均有12酯类物质,是种类较为丰富的米酒。
5种米酒中主要的挥发性风味物质主要是醇类和酯类,除此以外米酒中还检出了少量的挥发性烷烃类、醛类、酸类等风味物质,这些物质在米酒中含量虽少,但是对米酒的香气品质也存在影响。Do-Ro、Do-Fl、Do-St、Do-Fo、BC米酒中含量较少的挥发性酸类、醛类等物质的百分比含量分别为0.40%、1.73%、1.49%、1.44%、1.03%。发酵酒中具有较高香气活性的苯甲醛可赋予米酒果仁香[39];Do-Fl米酒中的3-羟基-2-丁酮呈奶香味,萘具有焦香,米酒中特有的茶香螺烷[40]来自于铁皮石斛花。
综上所述,铁皮石斛花、茎、叶、根4个部位发酵的米酒因为原料或者原料与酵母菌之间的相互作用使得4种铁皮石斛米酒挥发性风味存在一定的差异。其中Do-Fl米酒挥发性风味物质种类最丰富,含量也较高仅次于Do-Ro米酒,而在前文感官评价分析中Do-Fl米酒得分最高且其在气味方面的得分也是最高的。因此,铁皮石斛花发酵的米酒相较于其他部位发酵的米酒具有更好的风味品质。
3 结论
本论文采用酿酒酵母和非酿酒酵母两株酵母菌混合发酵铁皮石斛米酒,比较铁皮石斛花、茎、叶、根发酵米酒的理化指标、活性物质、挥发性风味物质等,分析铁皮石斛不同部位发酵米酒的品质差异。结果表明,添加铁皮石斛后,米酒发酵周期缩短,在一定程度上抑制了酒精发酵作用。Do-Fo、Do-St米酒中还原糖、总糖、多糖含量较高,这可能是因为铁皮石斛茎和叶中多糖含量高于其他部位;Do-Fl、Do-Fo米酒中黄酮、总酚含量显著高于其他部位发酵的米酒,其中Do-Fl米酒总酚含量最高,Do-Fo米酒黄酮含量最高;Do-Ro、Do-Fl、Do-St、Do-Fo米酒中挥发性风味成分分别有25、29、27、26种,Do-Ro米酒种挥发性风味物质含量最高但种类最少,Do-Fl米酒中挥发性风味物质种类最丰富,含量也较高。综上所述,铁皮石斛花、茎、叶、根不同部位发酵的米酒在理化指标、活性物质、挥发性成分等品质存在差异,其中铁皮石斛花发酵的米酒品质较佳。
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