高尿酸血症(hyperuricemia, HUA)是嘌呤代谢异常所致的慢性代谢疾病,常伴有痛风、肥胖、糖尿病、高血压等并发症。研究表明,我国已经成为HUA的多发地[1]。调查显示,目前我国HUA患者集中于中老年男性和绝经女性,呈现男性多于女性,沿海高于内陆的分布,并具有年轻化的趋势[2]。2000—2014年我国HUA患病率达13.3%[3]。2019—2020年广州8 832名调查对象中患HUA比例达39.1%,其中男性患病率为53.6%,女性患病率为20.9%[4]。HUA已经成为我国仅次于糖尿病的第二大代谢疾病。
目前治疗HUA的药物分为以下几类:抑制嘌呤代谢相关酶的降尿酸药物(别嘌呤醇、非布司他、托匹司他)[5],促进尿酸排泄药物(苯溴马隆、丙磺舒)[6],双重抑制降尿酸药物,尿酸酶类药物[7]。然而这些药物可能引发肝功能受损、胃肠道不良反应和肠道菌群失调等副作用[8]。研究发现,益生菌可能对尿酸异常具有一定的调节作用[9]。益生菌可以影响尿酸合成关键酶活性从而抑制尿酸的合成,也可以通过调节肠道菌群等方式促进尿酸的排泄,从抑制尿酸合成和加速尿酸排泄2个层面发挥降尿酸作用[[10]。据此,益生菌通过调节肠道菌群或者促进嘌呤和尿酸代谢可能是缓解或治疗HUA的重要途径之一。WANG等[11]认为,肠道菌群对尿酸的生出、代谢、排泄有重要的影响。XIAO等[12]从传统泡菜中筛选出14株乳酸菌,发现其对高尿酸血症肾功能损伤具有一定的保护治疗作用。酸乳是一种深受消费者青睐的酸乳制品,也是益生菌发挥益生功能的重要载体。2015年,日本发现格氏乳杆菌PA-3通过降解嘌呤达到降低尿酸的效果,并据此研究开发了具有降尿酸功效的明治PA-3益生菌酸乳。YAMANA等[13]也成功筛选了具有降尿酸活性的格氏乳杆菌LG08。目前国内外关于降尿酸益生菌及其产品的研究不多,主要原因是缺乏降尿酸活性稳定和发酵特性优良的益生菌菌株。实验室前期从健康婴儿粪便中筛选得到了1株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)F40-4,体外研究和体内动物实验验证均具有明显的降尿酸效果。本研究旨在探究这株发酵乳杆菌F40-4在酸乳发酵中的应用潜力,为进一步研究与开发具有降尿酸功效的益生菌酸乳提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
全脂乳粉、白砂糖、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、发酵乳杆菌F40-4,中国海洋大学功能性乳品与益生菌工程实验室;MRS肉汤培养基、脱脂乳培养基、MRS琼脂培养基,青岛海博生物技术有限公司;PBS缓冲液,北京索莱宝生物科技有限公司;NaOH、酚酞,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LDZX-75KBS立式高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;SW-CJ-1D超净工作台,苏州市净化设备有限公司;202-3AB电热恒温干燥箱、LRH-250生化培养箱、DK-98-IIA电热恒温水浴锅,天津市泰斯特仪器有限公司;PB-10酸度计,德国赛多利斯集团;TG20KR-D高速冷冻离心机,长沙东旺实验仪器有限公司;iCinac型酸化监控仪,法国AMS公司;YP202 N电子天平,上海精科仪器有限公司;TA.XT PLUS质构仪,英国SMS公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种活化
将冷冻保存L.fermentum F40-4菌株的甘油菌液以2%的接菌量接入10 mL灭菌MRS液体培养基中,37 ℃培养24 h进行活化,按此方法继续活化3代,取活化第3代的菌株进行实验。
1.3.2 抑菌实验
参考杨慧等[14]的方法。分别取10 μL活化的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌液分别接种于0.6% MRS肉汤半固体培养基中,然后倒入提前放置牛津杯的平皿中,待培养基凝固后,取出牛津杯,向孔洞中加入150 μL L.fermentum F40-4菌液,以150 μL MRS肉汤为空白对照,置于37 ℃培养箱中培养12 h。观察抑菌圈大小,用游标卡尺测量抑菌圈的直径。
1.3.3 酸乳制备
参考张颖等[15]的方法。将蒸馏水加热至55 ℃后,加入12%脱脂奶粉和6%白糖,搅拌均匀后使溶液保持在65 ℃,水合30 min进行分装。用温控水浴锅加热,使体系保持在95 ℃,高温灭菌5 min后迅速冷却至42 ℃。实验设置3组酸乳,按接种比例分为0∶1组(L.fermentum F40-4和发酵剂接种比例0∶1)、1∶1组(L.fermentum F40-4和发酵剂接种比例1∶1)、1∶2组(L.fermentum F40-4和发酵剂接种比例0.5∶1)。42 ℃恒温发酵,利用酸化监控仪每10 min测一次pH,每30 min测定一次可滴定酸度,待pH接近4.5时,达到发酵终点,4 ℃冷却后熟24 h,进行酸乳理化性质测定。
1.3.4 析水率测定
称取10 g酸乳样品,4 ℃,1 000 r/min离心10 min,称取沉淀质量,析水率按公式(1)计算:
析水率
(1)
1.3.5 可滴定酸度测定
参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》。利用酸碱滴定法,以酚酞为指示剂,0.1 mol/L NaOH测定酸乳中可滴定酸的含量。
1.3.6 微生物指标测定
总活菌数测定参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》,利用平板计数法测定活菌数。
1.3.7 质构测定
使用质构仪采用2次咀嚼测试程序对酸乳进行质构分析[16-17]。参数设置如下:底部类型为直径50 mm圆柱形探头,力量感应源ILC/500 N,底部类型为直径50 mm圆柱形探头,形变百分量35%,检测速度60.0 mm/min,触发力0.75 N。
1.3.8 感官评价
挑选10名接受过专业感官分析培训的学生组成评价组(男女比例为1∶1),分别对发酵酸乳进行感官评价。
1.3.9 风味化合物测定
样品准备:准确称取2.0 g酸乳样品于顶空瓶中,3组样品每个样品设置3个平行。
顶空条件:孵育温度60 ℃,时间10 min,孵育速度250 r/min,进样速率51 mL/min,进样针温度T3为65 ℃,进样体积为500 μL。
GC-IMS条件:FS-SE-54-CB-1色谱柱(15 m×0.53 mm,1 μm);IMS温度T1 45 ℃;柱温T2 40 ℃;漂移气(E1)和载气(E2)均为氮气,纯度99.999%。色谱洗脱程序为程序升压,E1和E2流量随时间变化情况如表1所示。
表1 色谱柱洗脱参数
Table 1 Elution parameters of column
时间/minE1流量/(mL/min)E2流量/(mL/min)0150221502515010101505020150100
1.3.10 数据分析
采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 7.0进行统计分析,以星号表示显著性差异(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 L.fermentum F40-4对酸乳发酵剂菌株生长的影响
保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是酸乳发酵剂的主体菌株。开发复合发酵剂的前提是辅助发酵菌株与保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌之间不能有明显的生长拮抗作用。据此,研究了L.fermentum F40-4对酸乳发酵剂主体菌株保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生长的影响,结果如图1所示。结果表明,L.fermentum F40-4对嗜热链球菌的生长没有抑制作用,对保加利亚乳杆菌的生长有轻微抑制作用,但其程度不影响菌株的生长发酵。保加利亚乳杆菌是酸乳发酵剂中的主要产酸菌株,若能在酸乳后熟期一定程度地抑制保加利亚乳杆菌的生长,则可以有效减轻后酸化[18],改善酸乳的风味和口感。L.fermentum F40-4对保加利亚乳杆菌生长的轻度抑制特性有可能在酸乳后熟和贮藏期间起到延缓后酸化的作用。另外,L.fermentum F40-4对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生长的影响研究是在MRS培养基中进行,L.fermentum F40-4在牛乳基质中对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生长的影响还待进一步研究。
a-保加利亚乳杆菌;b-嗜热链球菌
图1 L.fermentum F40-4对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生长的影响
Fig.1 Effect of L.fermentum F40-4 on the growth of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus
2.2 L.fermentum F40-4对酸乳发酵过程中pH和酸度的影响
将L.fermentum F40-4与酸乳发酵剂配比分别调配为0∶1、1∶1和1∶2,于42 ℃发酵,每隔10 min测定pH和可滴定酸度,结果如图2所示。3组酸乳的pH在发酵过程中均呈现降低的趋势,在3 h后3组发酵样品中的pH均为4.5左右,达到发酵终点。1∶1和1∶2组发酵酸乳样品的pH在前90 min一直高于0∶1组。在90 min后,3组样品pH的下降速率均有所减缓;相对1∶1组和0∶1组而言,1∶2组发酵酸乳pH下降速率最快,且发酵终点pH最低。上述结果表明L.fermentum F40-4在前90 min发酵过程中对发酵剂菌株具有轻微的抑制作用,这与前面L.fermentum F40-4对保加利亚乳杆菌生长的影响结果一致,但在发酵后期这种抑制作用基本消失。酸乳发酵过程中的酸度变化趋势与pH变化基本一致。结合3组样品发酵过程中pH和酸度的整体变化情况,L.fermentum F40-4的添加不会影响酸乳的正常发酵进程。
图2 发酵过程中酸乳的pH变化
Fig.2 Change of pH value of yogurt during fermentation
2.3 L.fermentum F40-4对酸乳冷藏过程中pH的影响
酸乳发酵结束后,冷藏后熟是赋予酸乳更佳风味和口感的重要步骤。在本研究中,酸乳发酵停止后,将酸乳置于4 ℃冷藏24 h,3组酸乳样品的pH如图3所示。
图3 L.fermentum F40-4对酸乳样品冷藏pH的影响
Fig.3 Effect of L.fermentum F40-4 on pH of refrigerated yogurt samples
3组样品在贮藏过程中pH都降低了,其中1∶1样品组酸乳下降最少,0∶1组下降最多,说明L.fermentum F40-4的添加对主要产酸菌保加利亚乳杆菌具有一定的抑制作用。市售酸乳的pH一般在4～4.5[21-22],3组酸乳样品的pH均在此范围。后酸化是目前酸乳冷藏和贮藏过程中的一种负面现象,主要是由于保加利亚乳杆菌持续发酵产酸导致,影响了酸乳的口感和风味。上述研究结果表明,L.fermentum F40-4可以延缓酸乳在冷藏过程中的pH下降进程,具有改善酸乳后酸化的效果。这可能是由于L.fermentum F40-4对保加利亚乳杆菌生长具有一定程度的抑制作用,从而延缓了后酸化。
2.4 L.fermentum F40-4对酸乳贮藏过程中活菌数的影响
活菌数是评判酸乳品质的重要指标之一。3组酸乳样品在贮藏过程中的最终活菌数如图4所示。1∶1组的总活菌数最高,1∶2组样品活菌数次之,0∶1组样品的总活菌数最低,原因可能是1∶1组样品中L.fermentum F40-4的接种量比0∶1组和1∶2组样品多,所以该组酸乳样品的总活菌数最高。3组样品的活菌数都在109以上,符合酸乳品质要求。
图4 L.fermentum F40-4对酸乳贮藏活菌数的影响
Fig.4 Effect of L.fermentum F40-4 on the number of bacteria in yogurt samples during storage
2.5 L.fermentum F40-4对酸乳析水率的影响
析水率是表征酸乳凝固特性的重要指标。添加不同比例的L.fermentum F40-4对酸乳冷藏过程中析水率的影响结果如图5所示。
图5 L.fermentum F40-4对酸乳贮藏析水率的影响
Fig.5 Effect of L.fermentum F40-4 on water-discharging rate of yogurt during storage
结果表明,1∶1组样品的析水率最低,0∶1组样品的析水率最高。酸乳的析水率与酸度、菌粉添加量等因素有关,若酸度较低或菌粉添加较多且有震动收缩过程均会导致析水率上升[21]。酸度过高,超过了酪蛋白的等电点,酪蛋白网络结构会出现脱水现象,导致乳清析出较多;菌粉添加量较多,则凝乳微粒数量较多,一旦受到震动,水从酪蛋白的网络结构中流出。根据结果可知,添加L.fermentum F40-4能够降低酸乳析水率,减少了乳清析出,且最佳添加比例为1∶1。
2.6 L.fermentum F40-4对酸乳质构的影响
质构是评价酸乳品质的另外一个重要指标,与酸乳的口感和风味密切相关。对L.fermentum F40-4不同添加量的3组酸乳样品进行了质构检测分析,结果如表2所示。3组样品的内聚性、硬度、咀嚼性、弹性、黏附性、胶黏性均无显著差异。酸乳硬度是指质构探头穿过酸乳过程中受到的压力最大值,与原料乳、加热强度、均质参数、酸乳酸度等因素有关[14-15]。该3组样品在原料乳、加热处理、均质强度等方面均保持一致,因此影响酸乳样品硬度的因素可能与酸乳酸度有关。虽然L.fermentum F40-4的添加对酸乳的pH有一定的影响,但不会影响酸乳的质构指标,对酸乳口感不会带来负面影响。
表2 不同酸乳样品的质构分析结果
Table 2 Results of texture analysis of yogurt samples
组别硬度/N内聚性弹性/mm胶黏性/N咀嚼性/mJ黏附性/(N·mm)0∶1组1.29±0.03a0.66±0.01a0.12±0.01a0.84±0.03a0.10±0.01a0.25±0.04a1∶1组1.23±0.03a0.68±0.02a0.12±0.03a0.84±0.01a0.10±0.02a0.22±0.04a1∶2组1.31±0.04a0.66±0.02a0.14±0.02a0.86±0.04a0.12±0.01a0.27±0.03a
注:相同字母表示它们之间差异不具有显著性。
2.7 L.fermentum F40-4对酸乳感官评价的影响
感官评价是评判酸乳品质的最直观指标。为研究添加L.fermentum F40-4对酸乳感官特性的影响,对3组酸乳样品进行了感官评价,结果如图6所示。
图6 L.fermentum F40-4对对酸乳感官评价结果的影响
Fig.6 Effect of L.fermentum F40-4 on the sensory evaluation of yogurt samples
结果表明,未添加L.fermentum F40-4的0∶1组酸乳样品感官评价显著低于其他2组酸乳样品。1∶2组样品的色泽、质地、气味较佳,但口感上略有颗粒感,口味偏酸。1∶1组样品的色泽乳白,气味香甜且富有乳香风味,质地细腻无颗粒和裂纹,滋味酸甜适中,口感细腻绵密,无乳清析出,其在气味、质地、口感、滋味和色泽方面都高于0∶1组样品,评分最高。上说结果说明接种L.fermentum F40-4可以提升酸乳的感官特性。
2.8 L.fermentum F40-4对酸乳挥发性风味化合物影响
测定了1∶1组样品和0∶1组样品的挥发性风味物质,对差异风味化合物进行比较分析研究,结果如图7所示。结果表明,酸乳风味中化合物主要为烃类、酯类、醇类、醛类、酮类、酸类、芳香族。添加L.fermentum F40-4后,酸乳样品中的酯类含量显著提高,包括肉桂酸甲酯、乙酸异丙酯、乙酸龙脑酯等,提升了酸乳的香味。在2组酸乳样品的差异风味组分中检测出了乙酸辛酯、水杨酸甲酯、乙酸异丙酯、2-苯乙醇乙酸酯等酯类物质,其中肉桂酸甲酯、乙酸异丙酯、乙酸龙脑酯含量较高。在2组酸乳样品中检测出的差异酸类风味物质为辛酸、壬酸、乙酸,其中辛酸含量最高,赋予酸乳清香风味。醛类化合物属于微量香气成分,对酸乳风味构成有重要影响[22]。在2组样品的差异风味组分中检测出了正庚醛、壬醛等醛类物质。酮类和醛类化合物由多不饱和脂肪酸氧化、热降解、氨基酸或微生物代谢产生,可赋予酸乳特有的风味。在2组样品的差异风味化合物中检测到了酮类和醛类化合物有2-丁酮。正庚醛、反式-2-己烯醛、戊烯醛。L.fermentum F40-4是专性发酵乳杆菌,除了上述风味化合物之外,其发酵代谢产物还可能有乳酸、CO2和乙醇等物质。综上研究结果表明,添加L.fermentum F40-4赋予了酸乳更多的风味物质。
图7 添加 L.fermentum F40-4 酸乳的风味指纹图
Fig.7 Flavor fingerprint of yogurt sample added L.fermentum F40-4
3 结论
将具有降尿酸活性的L.fermentum F40-4和酸乳发酵剂以不同比例组成复合发酵剂,探究L.fermentum F40-4对发酵酸乳品质的影响。与不添加L.fermentum F40-4的酸乳相比,添加L.fermentum F40-4的酸乳样品活菌数更高,析水率更低,提高了酸乳的质构和感官特性,产生了更丰富的风味物质。该研究结果表明添加L.fermentum F40-4有助于提高酸乳的品质,可作为辅助发酵剂用于降尿酸益生酸乳的发酵生产。
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