酵母菌对高盐稀态酱油风味强化研究进展

酱油作为东亚国家重要的饮食调味品,其色、香、味在酿造过程中形成的丰富度及协调度是影响消费者对酱油接受程度的主要因素[1]。与色泽和滋味不同,酱油的风味较难通过后期调配以达到人们期望的感官品质。这是由于酱油的香气成分丰富且复杂,风味的构成与各种微生物长期的相互作用和代谢有关[2-3]。现阶段酱油的酿造多采用高盐稀态发酵法,霉菌、细菌及酵母菌的不断繁殖使高盐度的酱醪在3～6个月的时间里缓慢发酵[4]。由于竞争性抑制,在制曲及盐水发酵前期,酱油中米曲霉占据优势大量生长,分泌大量蛋白酶和糖苷水解酶水解原料中的多糖和蛋白质[5-6]。这些酶解产物不仅构成了酱油的基础风味,分解生成的小分子营养组分也会为后期微生物的繁殖创造物质条件。在整个发酵周期内,酱醪微生物群落由耐盐和耐酸性较差的前期优势菌株向耐受性较强的菌株逐渐演变,在发酵后期,酱醪中的真菌以酵母菌为主[7-8]。

酱油中的挥发性风味化合物可分为醇类、酯类、酚类、醛类、酸类、酮类、吡嗪类、呋喃类等。研究表明,这些风味化合物的种类和含量与酱醪中酵母菌的繁殖情况密切相关[9]。近年来,随着代谢组学及测序技术的发展,酵母菌与酱油风味形成的相关性逐步得到了揭示和报道[10-12]。本文将对酱油主要风味组分及不同酵母菌对各类风味化合物的贡献程度进行综述,为酱油风味的定向强化提供理论依据,并对未来酱油生产工艺的研究及发展方向进行展望。

1 高盐稀态酱油中的特征性风味化合物

发酵食品均具有其独特的香气,人们通常只要凭借其特征风味即可判断出食品的种类。而食物的特征风味实际上是多种挥发性化合物综合作用的结果。作为一种风味多样的酿造调味品,酱油中存在的,并已得到重复报道验证的挥发性组分累计达到400余种[13]。不同酱油风味的差异基本来源于酿造原料、微生物菌群结构及生产工艺参数的不同[14]。虽然酱油的产品风味具有显著的多样性,但酿造过程均遵循GB 2717—2018《食品安全国家标准酱油》中相对规范的生产原则,即采用大豆、小麦或其副产物为原料,经米曲霉制曲发酵而成,这就使得酱油在酿造过程中可产生成分相对固定的且具有辨识性的特征性风味组分。目前文献报道较为集中的酱油特征性风味化合物根据各自类别整理如表1所示。

在酱油整体的风味物质构成中,醇类和酸类是挥发性组分中含量最多的2类化合物[22]。酱油中醇类化合物主要为微生物代谢产生,其中乙醇所占比重通常最大,这种酵母初级代谢产物是使各类发酵产品产生令人愉悦风味的重要化合物[23-24]。糠醇、苯乙醇则是酱油特征风味构成的关键化合物,它们均具有较高的沸点,在烹调过程中不易损失。糠醇呈现烟熏香,可使酱油风味更加浓郁,苯乙醇则呈玫瑰花香气,是酵母菌降解苯丙氨酸的产物[25]。其他醇类化合物如2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇同样为拥有较高风味活性值的挥发性物质,主要呈现麦芽香气、苦杏仁风味,同时在非挥发状态下可贡献酱油的酸味及焦糖味口感[26]。1-辛烯-3-醇的主要来源是原料的制曲阶段,是米曲霉孢子的特征风味,因此当孢子浸于醪液后可为酱油带来令人愉悦的蘑菇香气[27]。自然发酵的条件下,这些多元醇和高级醇的大量产生通常在发酵的中后期,与酱醪中酵母的繁殖情况呈现正相关。挥发性酸类化合物主要为乙酸、丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸等,这些挥发性酸类为酱油的风味提供甜香、酸香及奶酪香,并同样可作为各类酯化反应的前体物质,同时它们还可以降低醪液的pH值,为耐盐酵母菌的大量繁殖创造有利环境。其中乙酸所拥有的刺激性香气对酱油的整体风味具有一定的协调作用[22],而2-甲基丁酸、3-甲基丁酸含量则需要得到适当的控制,因其在低浓度下呈现水果香,而积累到较高的浓度会带来不愉快的腐臭味,对酱油的品质造成影响[28]。

醛类化合物在酱油中的含量较少,但其风味活性值通常较高[29],因此同样为酱油风味的重要组成部分。这些醛类的生成途径可能由Strecker降解反应以及微生物代谢或分解原料得到[30]。在醛类化合物中,乙醛的占比通常较高,其具有强烈的刺激性香气,是酵母酒精发酵的中间代谢产物。苯甲醛、苯乙醛呈现水果香及花香,2-甲基丁醛、3-甲基丁醛呈现坚果及奶酪香,它们对酱油特征风味的形成同样具有较大贡献[31]。壬醛、癸醛主要为柑橘香及脂肪香,少量存在即可提升酱油风味的层次感及丰富度。值得注意的是,相对于生酱油,灭菌后的熟酱油中醛类化合物含量通常会得到大幅增加且酱油风味也得到了增强,这表明除微生物的生化合成外,由化学反应生成的醛类同样占较大比重。酮类化合物中的1-羟基-2-丙酮呈现啤酒、烟草风味,3-羟基-2-丁酮具有令人愉悦的乳制品及草莓香气,它们可为酱油带来醇厚的风味。近年来的研究分离得到HDMF/HEMF并确认它们为酱油酱香来源关键的风味化合物[32],并且只在酿造酱油中被检出,是由微生物代谢产生的糖类及氨基酸通过美拉德反应获得或由酵母产生的酶催化反应产生[33-34]。3-羟基-2-甲基-4-吡喃酮俗称为麦芽酚,可能由酱油生产中使用的原料小麦焙炒产生,或源于霉菌与细菌代谢产物的氧化,可为酱油带来焦香风味。

酱油中的挥发性酯类化合物主要由酱醪中酵母分泌的酶催化或经非酶酯化反应产生[35],由于醪液中的醇类以乙醇为主,所以酯化反应生成的酯类多为乙酯。酯类化合物带有的花香和果香可使酱油的整体风味趋向于浓郁且柔和[36]。中低级挥发性脂肪酸酯中乙酸乙酯的含量最多,但在长时间的发酵过程中呈现先增后减的趋势。芳香酸酯以沸点较高的苯乙酸乙酯为主,具有浓烈的蜂蜜香气,是构成酱油特征风味的重要组分[37]。高级脂肪酸酯以亚油酸乙酯为主,主要由曲霉等微生物的脂酶水解出的脂肪酸转化得到,其贡献了酱油浓郁的后味。酱油中脂肪酸酯的主要来源是大豆中的脂肪分解,因此大豆品种及油脂含量对酱油的酯类构成及风味有着不可忽视的影响[38]。通常情况下,低沸点酯通常都具有强烈的芳香,对点蘸类酱油贡献较大,但在烹调过程中较难存留。而高级酸类构成的酯沸点较高,因此在酱油的调味过程中保留程度较高。

酱油中的酚类化合物均具有一定的挥发性,尽管种类有限,但对酱油的风味仍具有较大影响。这些酚类化合物多呈现烟熏香或麦芽烘焙的风味[39],愈创木酚主要为微生物代谢香草酸产生[40],其在发酵酒类中可能会被视为异味成分,但在酱油中却是构成产品关键特征风味的重要部分。4-EG和4-乙基苯酚为构成酱油酱香风味的核心化合物,其中4-EG主要通过酵母代谢阿魏酸产生[41],呈味阈值极低,在酱油中的含量小幅变化即可对产品品质产生显著影响。这些酚类化合物虽然在发酵初期产生较少,但其含量会随着发酵的进行逐渐增加并积累,因此被认为与酱醪中酵母的繁殖存在相关性。

以吡嗪类、吡咯类、呋喃类为主的一些杂环化合物主要在美拉德反应过程合成或降解产生[42]。反应的底物多来源于微生物的代谢产物或分泌的酶水解原料。这些杂环化合物中,吡嗪类化合物被检测到的种类相对较多,多呈现烤肉香、咖啡香,赋予酱油豆香与酱香。2-乙酰基呋喃具有坚果、焦糖等香气,2-乙酰基吡咯具有烘烤香、坚果香味,为酱油赋予了浓郁厚重的风味,同时它们也是食品原料中普遍存在的天然风味物质。近年有研究表明,这些杂环化合物可随着特定微生物的代谢直接或间接产生[43],因此这些杂环风味化合物存在着被选择性提升的潜力。虽然在酱油中检测到这几类杂环化合物的含量均相对较少,但它们的风味阈值较低[44],少量存在即可强化感官分辨效果,对食品整体风味产生贡献。

2 不同酵母菌对酱油风味的强化

酱油酿造过程实质上是微生物的繁殖代谢及相互作用的一系列活动。由于酱油的发酵环境开放、且发酵周期漫长,自然环境中的微生物会持续的通过各种途径被携带进入酱醪,其中一些耐盐性微生物则有机会在酱醪中成功定殖。这种开放式多菌种共存的发酵体系,不仅丰富了酱油的口味,还可以显著改善酱油的感官风味。根据酱醪中优势微生物的动态变化趋势,参与整个发酵过程的微生物群落一般可分为3个阶段:曲霉期、转化期和酵母期[45]。研究表明,微生物群落从曲霉阶段向酵母阶段的转化从盐水加入时就已经开始,因此酵母菌是驱动酱油中后期发酵至关重要的微生物,其对酱油产品最终风味的形成具有关键作用[46],并且不同种类的酵母菌对酱油特征风味的贡献也各不相同。

2.1 接合酵母

接合酵母是发酵产品中常见的酵母菌,具有葡萄糖的发酵能力及较好的产醇性能[47],无性生殖时细胞为芽殖,有时有假菌丝,有性生殖时其子囊通过细胞接合形成,每一个子囊含有1～4个圆形或卵形的子囊孢子。酱醪中的接合酵母主要有鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces baillii)等。目前对酱醪中接合酵母的研究以Z.rouxii为主,它是常见的嗜高渗透压酵母,在拥有较高浓度的离子和非离子(糖和醇)环境下均可生长及繁殖[48],于酱醪中的检出率及丰度均较高。Z.rouxii在自然条件下的定殖主要在酱油发酵的前期,当成曲加入盐水后,米曲霉开始逐步消亡,耐盐乳酸菌被解除生长抑制开始繁殖并代谢产生乳酸,这为Z.rouxii等嗜酸性酵母提供了适宜的生长环境[49]。近年来的大量研究表明,Z.rouxii是酵母发酵期的主发酵酵母,可给予酱油良好的产品风味。它除了以生物合成途径产生乙醇外,还可通过Ehrlich途径由相应的氨基酸代谢产生大量的高级醇及芳香醇[50],是酱油醇香的主要贡献者,其中包括苯乙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇等均是酱油特征风味的关键组成部分。YAO等[51]用含6%盐分的培养基对Z.rouxii进行单独培养后,发现其生长情况与样品中的苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇等高级醇类化合物的浓度密切相关。基于其优越的产香性能,调味品酿造相关产业已经开始对Z.rouxii及其代谢产物进行系统研究,并逐步以人工接种的方式对酱醪原始微生物群落进行干预以强化酱油风味。方冠宇等[52]于酱醪pH自然降至适宜条件后接种Z.rouxii进行酵母发酵,研究发现酱醪中的高级醇和芳香醇的含量及种类均得到大幅上升。由于Z.rouxii在pH>5.5的环境中难以维持其耐盐性,因此在发酵初期对酱醪中总酸的调控将有利于该酵母的繁殖和代谢产物的积累。此外,有报道显示Z.rouxii在自身生长过程中还可产生有助于HDMF合成的酶类[53-54],可使在接种该酵母的酱醪中HDMF这种重要的酱油特征性风味物质的含量也得到增加。而Z.baillii原为酒类特别是白酒酿造过程中的优势微生物[55],但由于其具有良好的醇类和酯类生产能力,近年来也逐渐被应用于酱油的风味强化。除自身代谢产生挥发性风味化合物外,这些接合酵母的代谢产物(如丙酮酸、氨基酸和维生素等)也为一些细菌的繁殖提供了营养物质及生长因子[22],这促进了酱醪微生物多样性的形成,多菌种发酵也间接地丰富了酱油的整体风味。

2.2 球拟酵母

球拟酵母同样为一种可耐受高渗透压环境的酵母菌,可适应的pH范围较广,酵母细胞呈圆形或卵形,无假菌丝,多边芽殖。酱油发酵醪中存在的球拟酵母主要有球拟圆酵母(Torulopsis globosa)、埃切球拟酵母(Torulopsis etchellsii)、易变球拟酵母(Torulopsis versatilis)、莫格球拟酵母(Torulopsis mogii)等。由于具有良好的产酯能力,球拟酵母被广泛应用于各类酿造食品中以提升产品风味[56],在酱油的发酵过程中可将醪液中前期生成的醇类和有机酸合成为酯类、产生4-EG并促进酱油的成熟及特征风味形成[57]。其中T.mogii在10%浓度的盐水中可繁殖旺盛,在18%的浓度下仍能维持良好的生长状态,并对乙醇具有一定的耐受能力,于发酵前期接入酱醪后可显著增加酱油中酯类及4-EG的含量,但发酵产乙醇能力相对较弱[58]。张丽[59]研究发现,于45～60 d将T. mogii接种进入酱醪后,终产品总酯含量显著多于对照组,但在更早的阶段接种反而不利于总酯的积累,这可能由于酵母生成挥发性酯类的同时也对其有分解作用[60],导致在较大的时间区间里,酯类产出量逐渐低于分解量,这也可能是大多数酱油在发酵后期挥发性酯类含量均较低的原因。LIU等[61]于发酵第45天将T.versatilis接种至酱醪,并在发酵结束后检测酱油样品中风味物质含量,结果显示成品酱油中棕榈酸乙酯的含量相对空白组增加了7.9倍,愈创木酚含量增加了1.77倍,3-甲基-1-丁醇的含量也得到了显著提升。同时该研究还发现发酵过程中T.versatilis与其他酵母协同发酵还可显著提升酱油中的苯甲醛、苯乙醛、3-甲基丁醛等醛类化合物的含量。在传统的开放式发酵过程中,球拟酵母在酱醪的发酵初期就开始生长,但在酱醪发酵的后期时,当主发酵酵母逐渐消退后才开始大量繁殖并开始发酵。因此为提升酱油挥发性风味物质含量并给予微生物代谢产物更多的积累时间,现阶段多在发酵的中前期以人工接种的方式对球拟酵母菌群进行强化。可利用球拟酵母最适繁殖温度偏高但对pH变化敏感性较低的特点,在酵母接种后根据酱油的目标风味选择控温发酵或变温发酵,以改善产品挥发性风味物质的构成以及整体香气的倾向性。同时,这样的发酵方法也是缩短酱油酿造周期的重要手段。

2.3 假丝酵母

假丝酵母天然存在于各类高盐发酵的调味品中,也是广式高盐稀态酱油发酵过程中的常见酵母,其在酱油的酵母发酵阶段占据主导地位,假丝酵母细胞呈圆形、卵形或长形等,生殖方式为芽殖,有时会存在假菌丝和有隔菌丝。酱醪中检测到的假丝酵母通常有埃切假丝酵母(Candida etchellsii)、易变假丝酵母(Candida versatilis)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)等。由于假丝酵母在富含有机酸与高盐环境下可竞争性生长,因此在酱油自然发酵条件下其通常在发酵后期开始迅速增殖并逐步占据优势[62]。假丝酵母与酱醪中其他耐盐酵母相似,其在醪液中繁殖及生长产生的代谢产物对最终酱油的氨基酸态氮等理化指标及氨基酸等呈味物质含量的影响有限,但却对产品特征风味的形成具有积极的贡献[36],现阶段已广泛应用于酱油、豆酱等调味品的发酵。有报道显示,在酱醪中C.versatilis的存在可显著提升酱油中酯类和酚类化合物的含量,如乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、2,6-二甲氧基苯酚和4-EG等[63],可在酱油发酵中后期促使酱油成熟并促进风味的形成和口感的改善。张玲[64]于发酵第60天后向酱醪中添加C.versatilis,发现其可促进酱油中乙酸、4-EG、苯乙醛、2-苯乙酸酯等风味物质的产生,并且4-EG的含量与未添加的样品相比具有极显著差异。同时C.versatilis代谢产出乙醇的也能力较强,并可在高盐条件下发酵麦芽糖,为酱油带来醇香和酒香。邹谋勇等[65]于酱醪中筛选出一株假丝酵母菌(Candida oceani)FW922-1,发现该菌株可在不添加额外营养物质前提下合成及代谢多种风味物质,显著提高发酵酱油或酱类中的苯乙醇含量,改善发酵产品的风味且不产生不良气味。韩冉等[66]发现在不同发酵阶段接种C.etchellsii进入酱醪,最终酱油产品的风味与对照组相比存在明显不同。相对于早期接种,发酵中期接种该酵母于酱醪后,发酵结束后酱油中检测得到的风味化合物明显增多,其中酯类和有机酸类的增加较为显著。这表明假丝酵母的菌群优势需要在在酱油发酵的中后期进行建立,这可能是由于其合成酯类以及代谢产生4-EG所需的前体物质在酱醪中达到一定浓度时,对酱油风味的强化效果才可展现出显著性。因此采用特定工艺提高酿造前期酱醪中的醇类物质含量可作为提升假丝酵母产香效果的可行途径之一。而对酱油中4-EG含量的优化则可通过调整原料构成或制曲工艺,提升醪液中阿魏酸的基础含量,进而通过调整酵母接种时间、通气量、发酵温度等参数调控酵母菌群丰度以提升4-EG的生成量。不仅如此,假丝酵母还有合成其他风味化合物(如一些呋喃类和吡嗪类化合物)的潜力[67],有报道指出在酱醪的高盐条件下C.etchellsii可生成HEMF,并在20%～22%的盐浓度下生产HEMF的能力最佳[68]。这些呋喃酮类与4-EG、苯乙醇等高沸点的风味化合物一样,是构成酱油酱香与豉香的关键组分,也是酱油在烹饪过程中特征风味可以得到保留的基础。

2.4 其他酵母

酱油发酵过程中的微生物群落在发酵前期的变化较为显著,特别是在酱油制醪发酵的初期,酱醪中往往有着丰富的酵母菌菌群,但多为无乙醇发酵能力的杂酵母,它们在发酵中前期逐渐衰退并消亡,竞争存留下的酵母继续参与酱醪的发酵,此时酵母群落逐渐趋于稳定。但在发酵中后期,除几种酱醪中优势酵母外,其他酵母菌对酱油风味亦有积极贡献,并且这些非主发酵酵母使酱油呈现产地特色。SONG等[69]报道,异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)可能与当地酱油的特色风味形成有关,W. anomalus可在酱醪中与Z.rouxii 和C.versatilis竞争性生长,并合成多种高级醇,同时产酯类及酮类化合物的能力也较高。胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)在酱油发酵过程中可以维持较稳定的种群,并具有较高的油脂以及酯类、吡嗪类化合物(如2-苯乙酸乙酯、2,6-二甲基吡嗪等)合成能力[70]。另外一些种群较小的酵母同样有着增强酱油特征风味的潜力,如季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)均可以代谢产生较高水平的4-EG及其他酱油特征芳香化合物[71-72]。扩大这些低丰度酵母的种群规模以及针对性的促进或抑制其生物活性是强化及丰富酱油风味的可选工艺,可结合产品香气的协调性进行综合考量。除在酱醪中直接代谢产生挥发性风味物质外,部分酵母菌还以通过参与原料中大分子有机物的分解,为发酵过程中风味化合物的合成提供底物,从而间接提升酱油风味。如异常毕赤酵母(Pichia anomala)、扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)等,它们主要在发酵的起始阶段生长繁殖,可产生脂肪酶类及淀粉酶类促进原料中营养物质的水解,致使小分子化合物在酱醪中得到快速积累[73-74]。这些拥有增强酱油风味能力的酵母菌通常不会对酱油中的总酸、氨基酸态氮、还原糖等理化指标带来负面影响,因此均具有开发成为新型酱油风味强化酵母的潜力。

3 展望

酱油的生产多是在开放条件下进行,酿造过程中多种耐盐微生物会进入酱醪中定殖、发酵并参与酱油风味的形成。在这其中,酵母菌的丰度与酱油的最终风味密切相关。在酱油传统的酿造工艺中,酵母菌主要由环境携带自然进入酱醪。这种途径虽可生产出具有地方特色风味的产品,但自然环境中微生物的数量及菌群结构受季节和气候的影响,不利于酱油品质的稳定及规范化生产。目前,在发酵过程中主动接种酵母正在逐步成为强化酱油风味的重要手段。随着对酱油特征风味化合物的阐明以及对酱醪中耐盐酵母的深入研究,不同种类酵母的代谢特性和酱油特征风味物质形成的相关性已逐步清晰。这使得对酱油风味的定向增强成为可能,在酿造过程中人们可根据不同的风味需求有选择的在特定时期接种相应种类的酵母菌,以提升特定类别的风味化合物含量,或在相应阶段解除目标酵母的生长限制,针对性地对风味化合物进行积累。本综述为酱油的酿造技术在未来的研究中提供启迪,并对现有酿造工艺的改进和产品风味强化提供新的思路。

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