疲劳是一种影响人类正常工作和生活的常见综合症,通常由剧烈运动、缺氧、睡眠不足或长期患病导致的[1]。疲劳的症状多种多样,通常表现为肌肉酸痛和精神不振[2]。长期过度运动诱发疲劳的过程中,通常伴随着肌肉损伤、心肺功能受损、免疫系统紊乱等一系列损害,并具有进一步诱发慢性疲劳综合症的风险[1]。其中,肌肉功能的损伤,不仅会导致运动功能障碍,也会通过“肌肉-神经”链影响到中枢神经系统,存在诱发中枢性疲劳的可能性[3]。因此维持肌肉稳态,是一种对抗疲劳的重要方式。研究发现,在维持肌肉稳态的过程中,线粒体介导的能量代谢和氧化应激信号传导途径是重要影响因素[4]。而由于线粒体生物发生过程的复杂性,会通过多靶点途径影响机体健康,因此“多化合物-多靶点”的干预理论正逐渐成为国际社会对抗疲劳的主要策略[5]。其中,由于中草药富含多种具有特殊功能活性的化合物,在调理健康中有着悠久的应用历史,利用中草药缓解疲劳的方式现在也被人们采纳[5]。
芫根(Brassica rapa L.)作为一种药食两用的传统食物,性温味辛。富含多糖、黄酮、多酚、皂苷等活性物质,表现出如抗缺氧、抗氧化、调节肠道菌群、调节免疫等诸多生物活性[6]。近期的研究也发现了芫根的抗疲劳功能,但是作用机制有待阐明[7]。由于在疲劳发生过程中伴随着肌肉功能失调,目前关于芫根的生物活性研究中,尚未对保护肌肉的生物过程进行探索。因此本研究将聚焦于探索芫根对长期游泳诱发疲劳小鼠的骨骼肌稳态的保护作用,揭示芫根发挥抗疲劳功效的一种实现途径。为利用芫根开发功能性食品提供了理论基础,为人类卫生健康建设贡献中国智慧。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
芫根购自西藏拉萨。
ATP试剂盒、辅酶Ⅰ(NAD+/NADH)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)试剂盒、过氧化氢酶(catalase, CAT)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)试剂盒,南京建成生物工程研究所。
RNA提取试剂盒 RC112、逆转录试剂盒 R323、荧光定量qPCR试剂盒 Q711V20.1,南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
ABTS,上海百灵威化学技术有限公司;DPPH,国药集团化学试剂有限公司;其余试剂均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SorvallTM ST 8型高速冷冻离心机,美国赛默飞公司;BioTek多功能酶标仪,美国伯腾公司;XLX-096D 实时荧光定量PCR仪,江苏鑫蓝鑫生物科技有限公司;UVmini-1285 紫外可见光分光光度计,日本岛津公司;光学显微镜,日本奥林巴斯公司。
1.3 芫根提取液的制备
将芫根洗净、切片,放入鼓风干燥箱50 ℃烘干,打成细粉,过40目筛网。取芫根粉末50 g,按料液比1∶14(g∶mL)加入去离子水,浸泡0.5 h后,用沸水回流提取1 h,提取2次,趁热合并煎液并过滤。然后在60 ℃条件下减压悬蒸浓缩,将浓缩液过滤,真空冻干,冻干粉为芫根提取物(aqueous extract of Brassica rapa L.,AEB)。
1.4 体外抗氧化活性测试
1.4.1 DPPH自由基清除能力测定
先用乙醇溶解DPPH(0.05 mmol/L),将1 mL样品提取物及不同质量浓度(0～5 mg/mL)的维生素C溶液和1 mL的DPPH溶液混匀,并在37 ℃避光反应30 min。检测其在517 nm下的吸光度[8]。DPPH自由基清除能力按公式(1)计算:
DPPH自由基清除率/%=1-[1-(A1-A2)/A0]×100
(1)
式中:A1,样品的吸光度;A2,纯水的吸光度;A0,DPPH溶液与纯水(对照组)的吸光度。
1.4.2 ABTS阳离子自由基清除能力测定
首先,将14 mmol/L ABTS溶液和4.9 mmol/L K2S2O8溶液以1∶1(体积比)的比例混合,在室温下避光反应16 h,获得ABTS的储备液。将20 μL不同质量浓度(0～5 mg/mL)的AEB或维生素C溶液加入180 μL ABTS储备液中,混匀。静置10 min后,在734 nm处检测吸光度[8]。ABTS阳离子自由基清除率按公式(2)计算:
ABTS阳离子自由基清除率/%=1-[1-(A1-A2)/A0]×100
(2)
式中:A1,样品的吸光度;A2,纯水的吸光度;A0,对照组的吸光度。
1.4.3 ·OH清除能力测定
分别将1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液和1 mL 9 mmol/L的H2O2溶液混合,随后加入1 mL不同质量浓度(0～5 mg/mL)的AEB溶液或维生素C溶液。混匀,37 ℃孵育30 min后,在510 nm处测量吸光度并按公式(3)计算·OH清除率[8]。
·OH清除率/%=1-[1-(A1-A2)/A0]×100
(3)
式中:A1,样品的吸光度;A2,纯水的吸光度;A0,对照组的吸光度。
1.4.4 铁离子还原能力测定
向不同质量浓度(0～5 mg/mL)的2 mL AEB溶液或维生素C溶液中加入PBS(2 mL,0.2 mol/L,pH 6.6)和2 mL 10 g/L的K3Fe(CN)6。混匀并在50 ℃下温育20 min,快速冷却并加入2 mL 100 g/L的 Cl3CCOOH以终止反应。混合物5 000 r/min离心5 min,将2 mL上清液转移到新试管中,并与2 mL 1 g/L的FeCl3溶液混合。室温静置10 min,在700 nm处检测吸光度[8]。按公式(4)计算铁离子还原能力:
铁离子还原能力=A1-A2
(4)
式中:A1,样品的吸光度;A2,空白组的吸光度。
1.5 动物实验设计
1.5.1 长期运动诱导疲劳小鼠模型构建
32只雄性KM小鼠[8周龄;(40±2) g],维通利华实验动物有限公司,所有的实验动物均经过江南大学实验动物中心伦理委员会批准(伦理编号:JN.No20211130k0341225)。小鼠被饲养在温度、湿度恒定且每周期12 h光照/黑暗的环境下,可以自由获取食物和水。适应5 d,开展实验。
将小鼠分为4组(n=8),空白组(Con组):生理盐水灌胃,不游泳;游泳运动组(Ex组):生理盐水灌胃,并游泳干预;芫根低剂量组(AEB-L组):AEB[0.5 g/(kg·d)]灌胃;并游泳干预;芫根高剂量组(AEB-H组):AEB[1 g/(kg·d)]灌胃;并游泳干预。
上述AEB溶液的浓度为100 g/L。每天灌胃小鼠,持续4周。
游泳模型可以更自然地模拟运动性疲劳过程,根据长期游泳诱导疲劳的小鼠模型[9],结合本实验的条件,构建运动模型:从第2周开始,在Ex、AEB-L和AEB-H组灌胃30 min后,每天进行30 min 无负荷强迫力竭游泳训练。根据实验动物的疼痛感知发现,由于上午8点至下午5点间动物的有氧代谢变化量最小,本实验中游泳训练在上午9点至下午2点间进行[10]。第30天,小鼠禁食9 h后开始负重游泳实验:在Ex、AEB-L和AEB-H组的小鼠灌胃30 min后,在小鼠的尾部固定相当于其体重3%的小铁球,开展强迫负重游泳30 min实验[11]。游泳实验结束后,用异氟烷麻醉小鼠,进行眼球采血,然后颈部脱臼处死小鼠。解剖并取出腓肠肌组织,立即冻存于-70 ℃。
1.5.2 肌肉组织形态学观察
将新鲜的腓肠肌组织,用质量分数4%多聚甲醛固定。然后用石蜡包埋,制作5 μm的切片。H&E染色后,用光学显微镜可视化(放大200倍)。采用Image J软件进行分析。统计每个样本的5张不同照片中至少100根纤维,计算每个样本的肌纤维直径。计算每平方毫米的肌纤维数目和白细胞浸润数量[12]。
1.5.3 生化指标检测
根据南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书,分别检测并计算:小鼠肌肉组织中ATP、NAD+、NADH、MDA、T-SOD、CAT、GPx的指标。
1.6 实时荧光定量PCR
根据诺唯赞提供的试剂盒说明书,提取小鼠腓肠肌组织的RNA,用Nano-200核酸定量仪鉴定纯度(RNA浓度≥100 ng/μL)。继续根据相关试剂盒的说明书进行逆转录反应,合成cDNA。将cDNA稀释至合适倍数后,按照试剂盒进行qPCR反应。根据NCBI数据库设计各基因引物,见表1。以β-actin为内参基因,用2-ΔΔCt计算各基因的相对表达量。
表1 PCR引物序列
Table 1 Sequences of primers for PCR
基因上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')β-actinCCTCTATGCCAACACAGTAGCCACCAATCCACACAGSIRT1ATGACGCTGTGGCAGATTGTTCCGCAAGGCGAGCATAGATPGC-1αCCTATGAGCGTTTGGGACTTCGGTGAACATTTTCTAGCCCATCTTFAMGGAATGTGGAGCGTGCTAAAAACAAGACTGATAGACGAGGGGNrf2GGTCACGCTAATGCAGACAATTCTTCTCAGGGGTATTCGCTTTHO-1ACAGATGGCGTCACTTCGTGTGAGGACCCACTGGAGGAMLPTCAGCACAGACACTGGCGAGCATCTGATGGCACAGCGGAAGCAGGTCTTGMuRF1GTGAAGGAGGAGCTGAGTCAGAAGTGCTTGGCACTTGAGAGGAAGGTAG Ankrd2 GCGGACATGATGGCTAAGAACCT GGCTGGTATAGGCTGAGGTGTCTActa1ATGTGGCTATCCAGGCGGTGCTGTCATGATGGCGTGTGGCAGGGCATAGC
1.7 数据分析
结果用平均值±标准差表示。用单因素方差分析(ANOVA)法分析组间差异。用GraphPad Prism 8.2.1软件处理数据,*表示P<0.05、**表示P<0.01、***表示P<0.001,表示与对照组比较具有统计学差异,#表示P<0.05、##表示P<0.01、###表示P<0.001,表示与Ex组比较具有统计学差异。
2 结果与分析
2.1 芫根体外抗氧化活性
如图1所示,AEB在不同的自由基清除实验中均表现出良好的抗氧化活性。经计算,AEB对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、·OH的半数抑制率(IC50)分别为(0.906 6±0.043 2)、(0.709 5±0.013 6)、(0.473 3±0.024 5)mg/mL。其中,AEB对·OH清除活性与维生素C接近。植物提取液的抗氧化活性象征着其功能物质的活性,如多糖、黄酮、多酚等物质[13]。结果表明,AEB对自由基具有较强的清除作用,意味着芫根具有良好的抗氧化活性,具有减轻体内活性氧损伤的潜力,并可能具有保护组织在应激状态下受到损伤的功效。
a-DPPH自由基清除活性;b-ABTS阳离子自由基清除活性;c-·OH的清除活性;d-铁离子还原力
图1 AEB体外抗氧化活性
Fig.1 Antioxidant activity of AEB in vitro
2.2 肌肉组织形态学观察
为了进一步确定芫根的组织保护功效,对骨骼肌进行H&E染色和形态学观察。如图2所示,在Ex组中可以明显地观察到肌肉的裂纹、坏死和肿胀;而在AEB-L组中,观察到仅有轻微裂纹;在AEB-H组的肌肉组织则更趋近于正常,表明在运动前摄入AEB可以有效减少长期力竭运动引发的骨骼肌损伤。
a-肌肉切片;b-肌纤维直径;c-肌纤维密度;d-白细胞浸润数
注:*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001 vs.Con组。#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001 vs.Ex组,(下同)。
图2 对肌肉组织形态学的影响(n=3)
Fig.2 Effects on histological changes in muscle
ImageJ量化分析结果表明,AEB-H组的肌纤维直径比Con组和Ex组显著提高(P<0.01),且肌纤维密度也明显增加(P<0.001),这两者的变化表明AEB的摄入提高了肌肉的综合强度,减轻了运动诱发的肌肉稳态异常。此外,可以在切片图中观察到Ex组肌纤维中有大量白细胞浸润、侵染。计数可知,单位面积的肌纤维中的白细胞浸润的数量比Con组多出了29.12%(P<0.001);AEB的摄入可以有效减少白细胞浸润数量,在AEB-H组中,比Ex组降低了18.82%(P<0.01)。
结果表明,AEB可以通过增强肌肉强度和减少炎症侵染的方式,发挥维持肌肉稳态的作用,且AEB-H组的效果最显著。
2.3 对肌肉能量代谢的影响
在发生剧烈运动时,肌肉中的高能磷酸物(如ATP)被优先消耗,当肌肉中的能量消耗大于能量供应时,可能会诱发肌肉损伤[14]。通过对肌肉组织的ATP含量测定发现,Ex组的ATP含量比Con组降低了63.30%(P<0.001),而AEB-L组和AEB-H组的含量均分别比Ex组上调了141.45%(P<0.01)和253.40%(P<0.001)。由于AEB中富含糖类物质[15],在摄入后提高体内能量储备是理所当然的。但ATP的生物合成过程不仅需要能量底物,与糖酵解过程相关辅酶也发挥了重要作用。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),是线粒体进行ATP合成的关键辅助因子,在糖酵解过程的重建中发挥关键作用[16]。如图3所示,本研究中发现Ex组的NAD+含量呈现出显著的低水平(P<0.001),而摄入AEB的2组NAD+的含量均显著提高。虽然NADH作为NAD+的还原态,具有正向调节细胞能量合成的作用,但在本研究中未发现显著组间差异。通常NAD+/NADH比值被用来评价糖酵解和三羧酸循环(tricarboxylin acid cycle,TCA)的强弱[17]。本研究中,Ex组的NAD+/NADH值显著低于其他组(P<0.001),而AEB-L、AEB-H组的比值均显著高于Ex组(P<0.001)。NAD+/NADH值的降低会对糖酵解和TCA过程产生抑制作用,同时也说明细胞呼吸过程耗氧量偏高,组织可能处于过氧化状态[17]。本研究中的结果表明,AEB可以通过调节NAD+/NADH比值,重塑应激状态下肌肉细胞糖酵解和TCA的过程,提高ATP在肌肉细胞的生物合成,来满足肌肉在剧烈运动时,对能量的大量需求。
a-肌肉ATP含量;b-肌肉NAD+含量;c-肌肉NADH含量;d-NAD+/NADH比值
图3 对肌肉能量代谢影响(n=6～8)
Fig.3 Effects on energy metabolism in muscle
另外有研究发现NAD+/NADH的比值在维持线粒体的电子传递链中具有重要意义,从而调控线粒体的代谢和生物发生[18]。
2.4 对肌肉线粒体功能的影响
SIRT1是一种NAD+依赖性脱乙酰酶,可通过脱乙酰化调节PGC-1α表达[19]。PGC-1α作为转路共激活因子,对线粒体功能代谢、氧化应激过程起重要调节作用。PGC-1α通过调节核呼吸因子(nuclear respiratory factor,Nrf1、Nrf2等),进而继续激活线粒体转录因子TFAM[20]。TFAM通过线粒体膜进入线粒体基质,与线粒体DNA结合,继而激活线粒体生物合成。因此SIRT1/PGC-1α/TFAM通路在维持线粒体的生物发生和功能稳定中具有重要意义[21]。
如图4所示,通过对肌肉中SIRT1/PGC-1α/TFAM通路表达发现,在Ex组中的SIRT1/PGC-1α/TFAM的mRNA相对表达量均分别比Con组(P<0.001)显著组下降了48.47%、51.08%、54.16%。AEB处理后表达量均有显著上调,AEB-H组的上调更显著且稳定。AEB-H组的表达量分别比Ex组上调了80.92%(P<0.001)、50.74%(P<0.05)、68.71%(P<0.01)。结果表明,在本实验中,剧烈运动可能通过对SIRT1/PGC-1α/TFAM通路的靶向影响,诱发了小鼠骨骼肌线粒体功能障碍。而AEB通过干预该通路,促进了骨骼肌线粒体生物发生,说明AEB干预的潜在靶点可能是线粒体,印证了上文NAD+/NADH的结果。
a-肌肉SIRT1 mRNA相对表达量;b-肌肉PGC-1α mRNA相对表达量;c-肌肉TFAM mRNA相对表达量
图4 对肌肉线粒体功能影响(n=6)
Fig.4 Effects on mitochondrial function in muscle
此外,PGC-1α还可以调节核呼吸因子的表达,影响机体的抗氧化防御系统。因此下一步对AEB的抗氧化功效进行了探索。
2.5 对肌肉抗氧化能力的影响
2.5.1 对氧化应激指标的影响
过度运动时身体各个组织的O2需求大幅增加,持续积累的活性氧物质无法获得及时的消除,会对组织持续造成机体损伤,影响组织功能稳态[22]。因此个体的运动耐力与抗氧化防御系统有很强的正相关。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一种能在保护机体免受氧自由基损伤的酶。·O2-在体内可被SOD迅速转化为H2O2,然后经GPx和CAT催化生成水。MDA是脂质过氧化的产物,是判别力竭运动后抗氧化防御降低的重要标识物[23]。
如图5所示,剧烈运动使Ex组肌肉中的MDA含量比Con组上升了42.81%(P<0.001),使抗氧化T-SOD、GPx分别比Con组显著降低了23.61%(P<0.001)、36.81%(P<0.01),这意味着肌肉组织处于过氧化状态,与NAD+/NADH的趋势一致。AEB的处理可以显著降低肌肉MDA的含量,并提高抗氧化酶的活性,且AEB-H组的效果更加显著(P<0.001)。接下来对AEB调节抗氧化活性的可能分子机制进行研究。
a-肌肉MDA含量;b-肌肉T-SOD活性;c-肌肉CAT活性;d-肌肉GPx活性
图5 对氧化应激指标影响(n=6～8)
Fig.5 Effects on oxidative stress index in muscle
2.5.2 对抗氧化通路的影响
上文所述中,PGC-1α可以调节Nrf的表达。其中Nrf2在氧化应激的过程中,可以释放并与抗氧化反应元件结合,并上调抗氧化酶如血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)、醌氧化还原酶-2、SOD、CAT、GPx的表达。调节细胞内抗氧化防御系统的相关基因表达,促进抗氧化酶的合成[24]。有研究发现过氧化状态下,Nrf2的表达会显著降低。本研究中发现,如图6所示,Ex组肌肉的Nrf2表达量比Con组降低了64.15%(P<0.001);而AEB-L组和AEB-H组的表达量均有显著上调(P<0.001)。并且在HO-1的mRNA表达中也观察到了类似的趋势。
a-肌肉Nrf2 mRNA相对表达量;b-肌肉HO-1 mRNA相对表达量
图6 对肌肉Nrf2通路影响(n=6)
Fig.6 Effects on Nrf2 pathway in muscle
综上,剧烈运动使小鼠骨骼肌处于过氧化状态,表现为MDA指标上升与抗氧化酶活性降低,并且Nrf2的表达发生降低。而AEB干预可能通过增强Nrf2和Keap1的结合而阻断其对Nrf2的降解作用,使Nrf2能够在细胞内积累,并进入细胞核激活氧化应激相关基因的表达,如SOD、CAT、GPx等内源性抗氧化酶[25]。
2.6 对肌肉再生相关基因表达的影响
Titin是一种巨大的蛋白,在肌节生成和肌原纤维组装中起作用,有Z盘、I带、M线3个蛋白作用位点[26]。Z盘锚定在肌动蛋白丝的末端,控制肌节中力的传递。Z盘上的MPL与titin形成复合物,发挥应力传感器的作用[26]。本实验中观察到了剧烈运动使小鼠MPL表达量均发生大幅降低(P<0.001),这可能会最终促使小鼠表现出肌无力的症状。虽然AEB的摄入没有使其恢复至正常水平,但比Ex组的显著(P<0.001)提升,也表明了肌肉力量控制的恢复。I带调控着肌纤维的延伸,I带中的Ankrd2表达被发现和肌纤维重塑过程有关[26]。本实验中,如图7所示,Ex组的表达量显著低于其他组(P<0.001),意味着剧烈运动对肌纤维修复过程的损害;而AEB组的表达量显著提升(P<0.001),是说明这2组小鼠受损的肌纤维处于修复并增长的状态,对应了切片中观察到的肌纤维直径和密度增加。M线中的MuRF1受到萎缩刺激的激活[26],本研究中可以观察到Ex组MuRF1表达量显著增加,AEB组的表达显著减少,印证了AEB组肌纤维结构的增强。
a-肌肉MLP mRNA相对表达量;b-肌肉Ankrd2 mRNA相对表达量;c-肌肉MuRF1 mRNA相对表达量;d-肌肉acta1 mRNA相对表达量
图7 对肌肉再生相关基因表达的影响(n=6)
Fig.7 Effects on the expression of genes related to muscle regeneration
α-肌动蛋白(acta1)是骨骼肌中最主要的肌动蛋白亚型[12],和titin蛋白结合在新肌节生成中发挥重要作用[27]。本实验中,观察到AEB处理主要提高了titin蛋白相关mRNA表达量,对acta1表达的改变不显著。这种变化通过增加titin在调节肌节再生上的作用,促进受损肌纤维组织重塑,切片中观察到的形态稳定印证了这个过程。
3 结论与讨论
持续性过度运动会促使一定程度的肌肉损伤,因此如何维持肌肉稳态,修复肌肉损伤是减轻运动损害的重要手段。之前的研究观察到,芫根可以有效减轻急性运动中的肌肉损伤,为本研究提供了基础。
在本研究中,先确定了芫根提取液具有的良好抗氧化活性,具有减轻由应激运动产生的自由基侵染的潜力。随后,在对肌肉组织形态学分析中发现,运动诱发的肌肉损伤被AEB缓解了,并且还发现了AEB有效提高了肌肉强度,并减少了白细胞在肌肉纤维的浸润。进一步研究发现,过度运动使肌肉细胞NAD+/NADH比值降低,糖酵解过程发生了障碍,ATP合成显著不足;而AEB逆转了这种变化,重建肌肉细胞糖酵解的同时,也为维持线粒体功能提供了条件。接下来,对肌肉组织线粒体SIRT1/PGC-1α/TFAM通路的研究证明了力竭运动过程中,引发线粒体功能障碍的分子机制,并且也发现了AEB在重构线粒体生物发生时发挥的作用。PGC-1α可以继续干预Nrf2通路的表达,从而影响抗氧化防御体系。剧烈运动使小鼠骨骼肌出现过氧化状态,并且抗氧化酶的活性也降低;AEB作为一种抗氧化剂,减轻了肌肉组织的自由基损害,提高了抗氧化酶活性,而调节Nrf2/HO-1通路是可能发生的分子机制。最后,对影响肌肉titin蛋白相关基因MPL、Ankrd2、MuRF1的mRNA表达发现,剧烈运动使上述3个基因的表达发生显著变化,而AEB的摄入逆转异常表达,为肌肉损伤后的再生提供了基础蛋白。
综上,本文揭示了芫根提取物通过维持肌肉细胞能量代谢稳定,促进线粒体功能,从而抑制剧烈运动造成的骨骼肌生理功能异常。另外,通过对MPL、Ankrd2、MuRF1的调节,促进了骨骼肌的损伤修复和纤维的重组,维持了骨骼肌的形态稳定。
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