近年来,发酵食品受到广泛的欢迎,在各国菜肴中占有重要的地位[1]。发酵食品采用自然接种、天然发酵的工艺,具有独特的风味特征。白酒是一种典型的多菌种固态发酵食品,风味是衡量白酒品质的重要指标[2]。酱香型白酒是中国三大传统白酒之一,因其独特的风味而广受喜爱。酱香型白酒具有浓郁持久的香气,无论是香味化合物的种类还是含量都远高于其他香型白酒[3]。酱香型白酒的风格源于其独特的酿造工艺和发酵特点[4]。酱香型白酒的酿造采用高温大曲, 高温大曲含有多种微生物和酶类,在赋予酱香型白酒典型特征香气和口味方面起着重要作用。
高温大曲生产过程中的培养温度为60 ℃以上,远高于其他大曲[5]。高温大曲在堆积发酵结束拆仓时会形成不同颜色的曲块,分为白曲、黄曲和黑曲[6]。温度是影响高温大曲发酵过程中微生物群落组装和风味代谢的关键环境因素之一[7-8]。芽孢杆菌为多种类型大曲中最具代表性和具有耐高温特性的细菌之一,被证明是酱香型白酒生产中主要的产酱香风味功能性细菌,在白酒的发酵过程中,可以水解蛋白质和淀粉等大分子物质,并代谢生成多种风味化合物,其对于白酒的风味贡献已被广泛研究[9-11]。
除了研究较多的芽孢杆菌外,其他微生物的潜在功能也需要探索。大曲岩石芽孢杆菌(Scopulibacillus daqui)最早是从芝麻香型白酒制作过程中采集的高温大曲样品中分离出来的一株嗜热菌[12],与其相关的研究报道非常少。本研究使用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)和高通量测序技术,同时运用相关性分析的手段,解析了火山渣芽孢杆菌属(Scopulibacillus)与大曲风味物质的关联程度。并以高温大曲黑曲样本为筛菌对象,采取合适的分离筛选办法,对高温大曲中的火山渣芽孢杆菌属微生物进行分离,研究其对在不同温度下(30、40、50、60 ℃)的生长特性和产风味情况。本研究有助于高温大曲中嗜热微生物的研究,并为其在制曲工艺中的生产应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集
高温大曲样本,贵州省某酒厂,选取黄白黑3种不同类型的大曲样本各3块作为平行采集样本,详细信息见表1。将曲磨成细粉,确保每个样品的质量有200 g,放入自封袋中及时转移至-80 ℃冰箱保存。
表1 样品信息表
Table 1 Sample information
编号类型产地WQ1白曲贵州省WQ2白曲贵州省WQ3白曲贵州省YQ1黄曲贵州省YQ2黄曲贵州省YQ3黄曲贵州省BQ1黑曲贵州省BQ2黑曲贵州省BQ3黑曲贵州省
1.2 主要试剂与仪器
乙醇、三氯甲烷、酵母粉、琼脂粉、蛋白胨,国药集团化学试剂(北京)有限公司;饱和酚溶液,生工生物工程(上海)股份有限公司。
GC 7890B气相色谱/MS 5975质谱、色谱柱DB-FFAP,美国Agilent公司;SPME自动进样系统,德国Gerstel公司;三相萃取头,上海安谱实验科技股份有限公司。
1.3 核酸提取、测序及生物学分析
为了确定大曲中的微生物群落结构,提取大曲的DNA后进行高通量测序。DNA提取具体实验步骤参考ZHANG等[13]的方法。提取到的总DNA测定其浓度后进行琼脂糖凝胶电泳检测。将质量浓度>50 ng/μL,且具有清晰条带的DNA样本置于-80 ℃冰箱保存备用。细菌使用通用引物组338F和806R扩增16S rRNA基因的V3～V4高变区。真菌使用通用引物组ITS3和ITS4扩增内部转录间隔区(ITS2)区域。测序工作由南京基序智谷生物科技有限公司(中国南京)完成。生成的所有原始序列均通过QIIME v.1.9.1和R(http://www.r-project.org)进行处理。使用Greengene_16S rRNA数据库和基于QIIME的RDP分类器包装器(v.2.2),对代表性的细菌OTU序列进行注释。使用BLAST将代表性真菌OTU序列与UNITE真菌ITS数据库(https://unite.ut.ee/)进行比较。
1.4 风味物质的测定
将大曲粉(5 g)添加到20 mL超纯水中,超声波处理30 min(0 ℃),4 ℃冰箱过夜放置后8 000×g离心10 min(4 ℃),收集上清液备用。在20 mL顶空样品瓶中依次加入5 mL上清液以及1.5 g NaCl,再以5 μL薄荷醇(质量浓度为100 mg/L)作为内标,迅速用带聚四氟乙烯垫片的空心铁盖密封。检测条件参照本实验室前期建立的方法[14]。
1.5 菌株的筛选及形态学观察
称取10 g高温大曲黑曲样品,加入90 g灭菌后的0.9%生理盐水和2～3颗玻璃珠,放置于50 ℃培养箱振荡30 min。涂布适宜稀释梯度的菌悬液于LB平板,重复操作3次后置于50 ℃培养箱培养36 h,根据不同菌落形态进行类编号和形态学观察。
1.6 菌株的分子生物学鉴定
使用Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取待测菌株的DNA。以细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增。PCR反应条件:94 ℃预变性6 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,30个循环,72 ℃延伸10 min。测定浓度后进行琼脂糖凝胶电泳实验。将符合条件的DNA样本送至上海生物工程有限公司进行测序。测序结果在美国国家生物信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)数据库中进行BLAST比对,用MEGA 11.0构建目标菌的系统发育树。
1.7 菌株的生长特性研究
将分离筛选出的菌株接种于小麦汁培养基中,分别于30、40、50、60 ℃,200 r/min摇床培养,每隔3 h取一次样,并于600 nm处测其OD值。
1.8 菌株的固态发酵风味成分分析
小麦固体发酵培养基:破碎后的小麦为原料,加入95 ℃的水(50%)润粮5 h,115 ℃灭菌30 min,无菌条件下按200 U/g淀粉加入糖化酶,60 ℃处理2 h,装瓶115 ℃灭菌30 min备用。将菌株接种于LB液体培养基,50 ℃摇床培养24 h即为种子液。将种子液按10%的接种量添加至100 g的小麦固体发酵培养基中,分别置于30、40、50、60 ℃ 4个不同温度下的培养箱中静置发酵7 d。采用HS-SPME-GC-MS分析检测菌株在不同温度下发酵产物的挥发性风味物质。具体操作参考1.4节的方法。
1.9 数据分析及绘图
利用SIMCA-14.1软件对挥发性风味进行多元统计分析;使用RFRUSPSS统计软件计算出Spearman相关系数,显著性水平设定在0.05,利用Gephi绘制网络图;生长曲线及风味变化绘图采用Origin 2022。
2 结果与分析
2.1 高温大曲中的挥发性组分分析
通过HS-SPME-GC-MS分析,在黄白黑3种高温大曲样本中共鉴别出135种挥发性化合物,共计12类(表2)。其中定性出的数量最多的是含氮化合物、醇类和酯类化合物,均定性出23种,共占据全部组分的51.11%。并非所有挥发性成分都具有一定的香气属性,将定性出的135种挥发性化合物与Flavornet Home(http://www.flavornet.org/index.html)和Flavor DB(https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)两个香气数据库进行比对,结果显示共有78种化合物具有香气贡献,其相对含量如增强出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034637)。
表2 三种类型大曲中鉴定的挥发性化合物
Table 2 Volatile compounds identified in three kinds of Daqu
编号白曲黄曲黑曲总计醇类20211723芳香族1615916酚类6556呋喃类2345含氮化合物20222023含硫化合物1233内酯类1111醛类10121515酸类5688酮类991111酯类18192323其他1111总计109116117135
采用偏最小二乘-判别分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)模型法,对不同样本间的78种香气化合物进行关联分析。如图1所示,9个高温大曲样品根据黄白黑3种不同类型聚为3类,表明黄白黑3种不同类型的大曲之间的代谢物具有显著差异。如电子增强出版附表1所示,含氮化合物中2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪在黄曲和黑曲中的含量明显高于白曲。YANG等[15]基于全二维气相色谱-飞行时间质谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography and time-of-flight mass spectrometry,GC×GC-TOF/MS)和超高效液相色谱与串联四极杆飞行时间质谱仪联用(ultra performance liquid chromatography with tandem quadrupole time of flight mass spectrometer,UPLC-Q-TOF/MS)从高温大曲3种不同类型的大曲中共检测出647种化合物,其中黑曲和黄曲中的吡嗪结构多样,如2,6-二甲基吡嗪仅存在于黑曲和黄曲。WANG等[16]的研究表明在高温环境下,嗜热微生物(如芽孢杆菌)可以产生吡嗪,成为占主导地位的微生物群落,说明黑曲和黄曲的发酵温度可能更高。因此,3种大曲中化合物的组成和含量差异显著,可能是由于发酵室不同区域温度差异引起的菌群差异所导致的。
图1 三种类型大曲的PLS-DA评分图
Fig.1 PLS-DA score plot of three kinds of Daqu
2.2 高温大曲微生物群落结构分析
为了揭示高温大曲黄白黑样品中菌群结构的差异,对细菌和真菌属水平进行了分析。高通量结果显示所有样品中共检测到108个细菌属和22个真菌属。本研究将相对丰度>1%的属定义为优势属,其分布情况如图2所示。
a-细菌;b-真菌
图2 三种类型大曲的微生物群落属水平结构
Fig.2 Microbial community structure at the genus level of three kinds of Daqu
对于真菌属,Thermoacus和Thermomyces在所有样品中均占有极高的丰度,其平均相对丰度分别为49.8%和41.9%。对于细菌属,细菌群落主要由3种优势细菌属组成:Virgibacillus、Kroppenstedtia、Scopulibacillus,其平均相对丰度分别为34.9%、29.3%、11.2%。ZHU等[17]研究了高温大曲发酵过程微生物多样性的动态变化规律,结果表明Kroppenstedtia、Bacillus、Virgibacillus、Thermoascus和Thermomyces为高温大曲发酵终点的标志性微生物。此外,已有研究揭示了Scopulibacillus是高温大曲的代表性细菌群之一[18],在我们的研究中Scopulibacillus随大曲颜色的加深而明显增多(白曲1.4%,黄曲8.7%,黑曲23.7%)。这很可能是由于其作为一种嗜热菌属,相对于白曲,黄曲和黑曲的发酵温度更高,因而更有利于其生长繁殖。
2.3 微生物群落与风味物质的关联分析
网络关联分析是研究微生物和风味化合物之间潜在相互作用的有力工具。为了加强黄白黑大曲样本之间的分离,进行了PLS-DA。通过变量投影重要性指标(variable importance in projection,VIP)值来判别对于区分黄白黑3种大曲具有一定贡献的差异微生物和风味化合物,其中共有5种微生物和28种香气化合物VIP值>1。因此计算了5种差异微生物与28种差异化合物之间的Spearman相关系数,并选取ρ>0.5和显著性P<0.05的关系作为网络的强相关节点(图3)。分析结果显示,3个细菌属与2个真菌属与20种风味化合物呈显著正相关性(P<0.05,ρ>0.5)。其中,Scopulibacillus与6种风味化合物显著正相关(P<0.05,ρ>0.5)。参考香气数据库,这6种风味化合物大多都有怡人的芳香气味,如2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪(炸马铃薯)、3-羟基-2-丁酮(奶油味)、邻苯二甲醚(香草味)、正己醇(花香味)和苯乙醇(蜂蜜味)。SHI等[18]研究结果显示包含Scopulibacillus在内的4个细菌属和2个真菌属几乎与高温大曲所有丰富的挥发物都表现出正相关。这些结果表明Scopulibacillus可能是高温大曲中重要的风味功能微生物。
图3 微生物与挥发性物质之间的相关性分析
Fig.3 Correlation analysis between microbiota and volatile compounds
2.4 菌株的分离筛选及形态学特征
利用平板涂布分离方法,对能够在50 ℃的高温条件下存活的菌株进行多次分离纯化。最终得到1株纯种菌株LBM32026。其在LB固体培养基上的菌落形态和革兰氏染色镜检结果如图4所示。
a-菌落形态图;b-显微形态图
图4 菌株LBM32026的形态学特征
Fig.4 Morphological characteristics of strain LBM32026
2.5 菌株的分子生物学鉴定
以目标菌株的DNA为模板,经PCR扩增出的16S rDNA序列大小为1 443 bp。从系统树可知,LBM32026与大曲岩石芽孢杆菌亲缘关系最近。通过序列与NCBI数据库对比发现菌株LBM32026与Scopulibacillus daqui(KC913194.1)相似性为99.79%。由此可确定这株菌为Scopulibacillus daqui,其系统发育树如图5所示。
图5 菌株LBM32026系统发育树分析
Fig.5 Phylogenetic tree analysis of strain LBM32026
2.6 菌株的生长特性研究
由图6可知,该菌株在50和60 ℃的高温条件下培养9 h后逐渐进入对数期,15 h时OD600达到最大,此后菌株生长较为平缓,进入稳定期。而在30 ℃和40 ℃的低温条件下,菌株几乎不生长。即该菌株在50 ℃和60 ℃条件下生长较为迅速,在30 ℃和40 ℃条件下生长速度变慢甚至出现抑制生长的现象。
图6 菌株LBM32026在不同温度下的生长曲线
Fig.6 Growth curve of strain LBM32026 at different temperatures
2.7 菌株的固态发酵风味成分分析
为了进一步确定Scopulibacillus daqui LBM32026产生的挥发性化合物,采用HS-SPME-GC-MS分析检测耐高温菌株在30、40、50、60 ℃ 4个不同温度下发酵7 d的发酵产物,共发现挥发性化合物40种。其中包括8种醇类、2种酯类、3种酸类、8种含氮类、7种芳香族、4种酚类、5种醛类、1种酮类、1种内酯类和1种其他类化合物,其半定量计算结果见增强出版附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034637)。经对比在原位体系中6种与Scopulibacillus显著正相关的风味化合物也均被检测到,其中2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪仅在50、60 ℃中被检测出,这表明高温更有利于这类物质的产生。3-羟基-2-丁酮的含量呈先升高后下降的趋势,在发酵体系中其可以作为四甲基吡嗪合成的前体物质。邻苯二甲醚仅在40 ℃下微量检出。正己醇和苯乙醇的含量随着发酵温度的升高整体呈下降趋势。
随着温度的升高,菌株固态发酵产物挥发性成分整体含量、含氮化合物、酚类、醛类、内酯类和酸类化合物含量呈上升趋势。含氮化合物主要是吡嗪类,是美拉德反应的产物之一[19]。吡嗪类化合物一般具有烘焙香和坚果香味,对高温大曲曲香的形成具有重要贡献[20]。菌株还可以代谢生成愈创木酚,相对含量占总挥发性化合物的20%以上,愈创木酚具有烟熏风味,是酱香型白酒中主要的酚类物质。醛类化合物通常表现为水果香味,是大曲和白酒中的重要呈香物质。包含丙位壬内酯在内的内酯类化合物,具有奶香、水果香、坚果香、焦糖香等优良的风味特征,对大曲和白酒整体风味的形成具有重要作用[21]。菌株在60 ℃发酵可以产生酸类物质3-甲基丁酸。王勇等[22]提取牛栏山二锅头中的香气化合物,发现3-甲基丁酸等是闻香强度较高的物质,且具有水果香,对白酒整体香气贡献较大。如图7所示,芳香族、醇类和酯类这3类化合物在30和40 ℃下含量较高。首先,固态发酵相较于液态发酵其发酵时间更长且营养底物更丰富,所以菌株在30和40 ℃的固态发酵条件下也能生长,并代谢了部分发酵产物。此外,风味化合物之间存在相互转化,部分化合物不仅来源于微生物代谢也可能来源于化学反应。
图7 菌株LBM32026在不同温度下的挥发性化合物含量
Fig.7 Content of flavor compounds of strain LBM32026 at different temperatures
3 结论与讨论
本研究解析了火山渣芽孢杆菌属与高温大曲风味化合物的关联程度。研究结果显示,Scopulibacillus与大曲中6种风味化合物呈显著正相关。并以高温大曲黑曲样本为筛菌对象,最终得到一株纯种菌株Scopulibacillus daqui LBM32026。研究其在不同温度下的生长特性,发现菌株在50和60 ℃下生长较为迅速,在30和40 ℃下生长速度变慢甚至出现抑制生长的现象。利用单菌固态发酵实验分析不同温度下菌株的风味代谢情况,共检测到挥发性化合物40种。且在原位体系中与Scopulibacillus显著正相关的6种风味化合物均被检测到。随着发酵温度的升高,菌株固态发酵产物中的挥发性化合物整体含量、含氮化合物、酚类、醛类、内酯类和酸类化合物含量呈上升趋势。综上,菌株LBM32026能够耐受较高的发酵温度且发酵风味良好。
[1] DIMIDI E, COX S R, ROSSI M, et al.Fermented foods:Definitions and characteristics, impact on the gut microbiota and effects on gastrointestinal health and disease[J].Nutrients, 2019, 11(8):1806.
[2] JIN G Y, ZHU Y, XU Y.Mystery behind Chinese liquor fermentation[J].Trends in Food Science &Technology, 2017, 63:18-28.
[3] 范文来, 徐岩.酱香型白酒中呈酱香物质研究的回顾与展望[J].酿酒, 2012, 39(3):8-16.
FAN W L, XU Y.Current practice and future trends of key aroma compounds in Chinese soy sauce aroma type liquor[J].Liquor Making, 2012, 39(3):8-16.
[4] DUAN J W, YANG S Q, LI H H, et al.Why the key aroma compound of soy sauce aroma type Baijiu has not been revealed yet?[J].LWT, 2022, 154:112735.
[5] ZHANG Y D, DING F, SHEN Y, et al.Characteristics of the microbiota and metabolic profile of high-temperature Daqu with different grades[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2022, 38(8):137.
[6] WANG Y R, CAI W C, WANG W P, et al.Analysis of microbial diversity and functional differences in different types of high-temperature Daqu[J].Food Science &Nutrition, 2020, 9(2):1003-1016.
[7] 吴盛露, 杜海, 徐岩.生物热对传统固态发酵菌群演替及其代谢影响的研究进展[J].微生物学通报, 2022, 49(6):2281-2294.
WU S L, DU H, XU Y.Effect of bio-heat on microbial succession and metabolism in traditional solid-state fermentation:A review[J].Microbiology China, 2022, 49(6):2281-2294.
[8] XIAO C, LU Z M, ZHANG X J, et al.Bio-heat is a key environmental driver shaping the microbial community of medium-temperature Daqu[J].Applied and Environmental Microbiology, 2017, 83(23):e01550-e01517.
[9] HE G Q, DONG Y, HUANG J, et al.Alteration of microbial community for improving flavor character of Daqu by inoculation with Bacillus velezensis and Bacillus subtilis[J].LWT, 2019, 111:1-8.
[10] XU B Y, XU S S, CAI J, et al.Analysis of the microbial community and the metabolic profile in medium-temperature Daqu after inoculation with Bacillus licheniformis and Bacillus velezensis[J].LWT, 2022, 160:113214.
[11] YANG Y, ZOU Y F, ZENG K J, et al.Effect of Bacillus subtilis fortified inoculation on the microbial communities in different niches of Daqu[J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2022, 134(5):407-415.
[12] YAO S, ZHAI L, XIN C H, et al.Scopulibacillus daqui sp.nov., a thermophilic bacterium isolated from high temperature Daqu[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2016, 66(11):4723-4728.
[13] ZHANG H X, DU H, XU Y.Volatile organic compound-mediated antifungal activity of Pichia spp.and its effect on the metabolic profiles of fermentation communities[J].Applied and Environmental Microbiology, 2021, 87(9):e02992-e02920.
[14] WANG X S, DU H, ZHANG Y, et al.Environmental microbiota drives microbial succession and metabolic profiles during Chinese liquor fermentation[J].Applied and Environmental Microbiology, 2018, 84(4):e02369-e02317.
[15] YANG L, FAN W L, XU Y.GC × GC-TOF/MS and UPLC-Q-TOF/MS based untargeted metabolomics coupled with physicochemical properties to reveal the characteristics of different type daqus for making soy sauce aroma and flavor type Baijiu[J].LWT, 2021, 146:111416.
[16] WANG P, WU Q, JIANG X J, et al.Bacillus licheniformis affects the microbial community and metabolic profile in the spontaneous fermentation of Daqu starter for Chinese liquor making[J].International Journal of Food Microbiology, 2017, 250:59-67.
[17] ZHU C T, CHENG Y X, ZUO Q C, et al.Exploring the impacts of traditional crafts on microbial community succession in Jiang-flavored Daqu[J].Food Research International, 2022, 158:111568.
[18] SHI W, CHAI L J, FANG G Y, et al.Spatial heterogeneity of the microbiome and metabolome profiles of high-temperature Daqu in the same workshop[J].Food Research International, 2022, 156:111298.
[19] KOEHLER P E, ODELL G V.Factors affecting the formation of pyrazine compounds in sugar-amine reactions[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1970, 18(5):895-898.
[20] YAN Y, CHEN S, NIE Y, et al.Quantitative analysis of pyrazines and their perceptual interactions in soy sauce aroma type Baijiu[J].Foods, 2021, 10(2):441.
[21] 于海燕, 姚文倩, 陈臣, 等.内酯类化合物在食品中的风味贡献及形成机制[J].现代食品科技, 2022, 38(5):337-349;55.
YU H Y, YAO W Q, CHEN C, et al.Flavor contribution and biosynthesis mechanism of lactone compounds in food[J].Modern Food Science and Technology, 2022, 38(5):337-349;55.
[22] 王勇, 徐岩, 范文来, 等.应用GC-O技术分析牛栏山二锅头白酒中的香气化合物[J].酿酒科技, 2011(2):74-76;79.
WANG Y, XU Y, FAN W L, et al.Determination of aroma compounds in Niulanshan Erguotou liquor by GC-O[J].Liquor-Making Science &Technology, 2011(2):74-76;79.