浓香型白酒窖池中可培养细菌多样性研究

白酒在中国有着悠久的酿造和饮用历史,是中国各种传统酒类(除果酒、米酒外)的统称。1979年全国第三届评酒大会根据不同酿造工艺、制曲方式和风味特征等首次正式提出并确立了浓香型、清香型、酱香型、米香型和其他香型5种白酒香型[1-2]。目前市场上的白酒香型主要是以4种基础香型为主的12种香型,其中作为行业占比第一大香型的浓香型白酒因其“窖香浓郁、绵柔甘冽、香味协调、尾净余长”的风味特点被誉为“中国白酒典范”[2-4]。2021年浓香型白酒最新标准GB/T 10781.1—2021《白酒质量要求第1部分:浓香型白酒》正式发布,对浓香型白酒给出明确定义:以粮谷为原料,采用浓香大曲为糖化发酵剂,经泥窖固态发酵,固态蒸馏、陈酿、勾调而成的,不直接或间接添加食用酒精及非自身发酵产生的呈色呈香呈味物质的白酒。浓香型白酒采用泥窖作为发酵载体,已有研究表明在“泥窖生香”的微生态机制中主要包含2个发酵体系:酒醅发酵体系和窖泥发酵体系。2个优势菌群全然不同的体系中,微生物在发酵过程中发生了菌群的迁移富集和代谢产物的传递交换,共同影响着浓香型白酒典型“窖香”的形成。老窖出好酒,在连续不断的生产过程中,窖泥中的营养成分和特征特性不断发生变化,微生物的群落结构不断的进行演替,形成了适合于白酒酿造的特有的微生物群落,并最终决定了浓香型白酒的品质[5-8]。目前对浓香型白酒酿造过程中窖池微生物体系与其酒体品质及风味特征相关机理的研究有了一定的进展,但三者之间的互作机制和内在关联仍未完全解析。

浓香型白酒窖池中微生物群落结构的解析以及特征微生物资源的发掘对揭示白酒酿造风味机理、提升白酒品质、加强质量管理具有重要意义。目前白酒窖池中微生物群落结构研究主要采用聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳(PCR-denatured gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)[9]、聚合酶链式反应单链构象多态性分析(PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)[10]、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)[11]、宏基因组学和宏转录组学[12-14]及高通量测序[5,15]等非培养技术,该类技术可以获得窖泥微生物菌群的定性及相对定量信息[16],但对其中功能微生物的筛选与作用机制解析仍需获得微生物纯培养物。可培养组学(culturomics)是综合利用多种培养条件进行微生物菌种的分离培养,并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)和16S rDNA基因测序技术对分离菌种进行大规模鉴定,尽可能多地获得在常规培养条件下不可培养微生物的一种技术[17-18]。本研究依据浓香型白酒窖池中微生物群落结构特征,设计和优化了7种筛选培养基,开展了窖池中功能微生物,尤其是难培养厌氧微生物资源的发掘。根据不同分离筛选条件和分离生境的可培养细菌种类和丰度,确定了浓香型白酒窖池特征菌,并解析特征菌的生物学特性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器与试剂

HG-50高压灭菌锅,日本平山制作所株式会社;移液器(100 μL、1 mL、5 mL),德国Eppendorf公司;AC2-4S1生物安全柜,新加坡艺思高科技有限公司;DG-250厌氧工作站,英国Don Whitley Scientific公司;DLQ120-B智能厌氧制备仪,北京爱思普科技有限公司;BHG-8082型恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;LX-165T2R医用离心机,青岛海特生物医疗有限公司;MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪,德国Bruker Daltonik GmbH公司;全自动革兰氏染色仪,青岛澜澈生物科技有限公司;厌氧盒,日本三菱化学公司;ECLIPSE 80i光学显微镜,尼康仪器(上海)有限公司。

0.85%生理盐水,北京君立康科技发展有限责任公司;厌氧产气袋,日本三菱化学公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA Marker,天根生化科技(北京)有限公司;溶菌酶、琼脂糖,北京全式金生物技术有限公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.2 培养基的选择和制备

通过对浓香型白酒窖池中微生物群落结构和窖池中特征菌种生理代谢特征研究相关文献的调研[5,19-20],参考KOMODO(Known Media Database)网站(http://komodo.modelseed.org/)中对不同种属厌氧微生物培养基配制的建议要求[21],最终选择了7种培养基进行浓香型白酒窖池中可培养细菌的分离培养研究。TSA培养基和R2A琼脂培养基作为好氧微生物分离培养基,其中TSA培养基主要用于分离常见好氧菌和不动杆菌属;R2A琼脂培养基则用于分离苛养好氧菌。改良MRS琼脂培养基、强化梭菌培养基、苛养厌氧菌琼脂培养基、改良PYG培养基和蛋白瘤胃球菌培养基作为厌氧微生物分离培养基,分别用于片球菌属/乳杆菌属、梭菌属、苛养厌氧菌、喜热菌属/普雷沃氏菌属和瘤胃球菌属等厌氧或兼性厌氧微生物的选择性分离。7种培养基的配方如下,灭菌条件均为121 ℃、15 min。

TSA培养基(g/L):胰蛋白胨15.0,大豆蛋白胨5.0,NaCl 5.0,琼脂15.0。

R2A琼脂培养基(g/L):蛋白胨0.5,酵母粉0.5,酪蛋白胨0.5,葡萄糖0.5,可溶性淀粉0.5,K2HPO4 0.3,丙酮酸钠 0.3,MgSO4 0.024,琼脂15.0加热溶解。

改良MRS琼脂培养基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉膏10.0,酵母粉5.0,葡萄糖20.0,柠檬酸铵2.0,吐温80 1.0 mL,半胱氨酸盐酸盐0.5,CH3COONa 5.0,K2HPO4 2.0,MgSO4 7H2O 0.1,MnSO4 0.05,琼脂 15.0。

强化梭菌培养基(g/L):胰蛋白胨10.0,牛肉膏10.0,酵母粉3.0,葡萄糖5.0,NaCl 5.0,可溶性淀粉1.0,CH3COONa 5.0,半胱氨酸盐酸盐0.5,琼脂15.0。

苛养厌氧菌琼脂培养基(g/L):混合蛋白胨23.0,NaCl 5.0,可溶性淀粉1.0,葡萄糖1.0,C3H3NaO3 1.0,L-精氨酸1.0,琥珀酸钠0.5,半胱氨酸盐酸盐0.5,NaHCO3 0.4,可溶性焦磷酸0.25,氯化血红素0.01,维生素K 0.001,琼脂15.0。

改良PYG培养基(g/L):胰蛋白胨 5.0,蛋白胨 5.0,酵母粉 10.0,牛肉膏 5.0,葡萄糖 5.0,K2HPO4 2.0,吐温-80 1.0 mL,NaHCO3 0.4,NaCl 0.08,KH2PO4 0.04,MgSO4 7H2O 0.02,CaCl2 2H2O 0.01,刃天青 1.0 mg/L。加热煮沸3～5 min,冷却后添加氯化血红素5 mg/L、维生素K1 1 mg/L、半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L和琼脂15.0 g/L,pH 7.2。

蛋白瘤胃球菌培养基(g/L):胰蛋白胨 5.0,酵母粉 2.0,葡萄糖 3.0,纤维二糖 2.0,(NH4)2SO4 0.8,NaCl 0.48,KH2PO4 0.24,K2HPO4 0.24, MgSO4 7H2O 0.1,CaCl2 7H2O 0.064,刃天青 1.0 mg/L。加热煮沸3～5 min,冷却后添加Na2CO3 4.0 g/L、脂肪酸溶液1 mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L和琼脂15.0 g/L,pH 7.0。

样品采集自四川省宜宾市某浓香型白酒生产企业3个车间的窖池,3个窖池的窖龄分别为30年、20年和15年,样品来源包括窖泥和酒醅。窖泥样品分别从距地面约0.3、1、2 m的窖池四壁和底部采集,3个窖池的窖泥样品混匀作为窖泥待检样品;酒醅样品采用五点取样法,从四周和中间采集,3个窖池的酒醅样品混匀作为酒醅待检样品。窖泥和酒醅样品均从出池当天(2022年1月13日)的一批窖池中采样获得,采集后的样品密封,-20 ℃保存备用。

1.2 实验方法

设计7种不同筛选分离培养基,采用好氧和厌氧的培养方式,结合MALDI-TOF MS和16S rDNA基因测序技术对浓香型白酒窖泥和酒醅样品中的细菌进行大规模分离筛选和鉴定,本实验建立的白酒窖池中可培养细菌多样性研究的技术路线如图1所示。

1.2.1 好氧微生物的分离纯化

在生物安全柜中分别称取25 g窖泥待检样品和酒醅待检样品于225 mL无菌生理盐水中,充分混匀制备成1∶10样品稀释液,吸取1 mL稀释液加入9 mL无菌生理盐水,充分混匀制备成1∶100样品稀释液,重复上述操作对样品进行梯度稀释,取2～3个合适浓度的稀释液分别涂布于TSA培养基和R2A琼脂培养基平板上,37 ℃培养3 d。从2种培养基平板上选取菌落形态不同的单菌落,在对应的培养基平板上四区划线分纯,37 ℃培养3 d。重复上述操作对分离菌株进行纯化,根据菌落形态和革兰氏染色镜检确认,将纯化后的分离菌株编号并转移至含15%无菌甘油的甘油管中,-80 ℃冰箱保藏备用。

1.2.2 厌氧微生物的分离纯化

为最大限度地分离获得浓香型白酒窖池中不同生长特性的厌氧微生物,对厌氧菌的分离采用2种方法:平板涂布法和滚管法。

平板涂布法:试验前一天将无菌生理盐水、5种厌氧微生物分离培养基放置于厌氧工作站中过夜置换除氧,刃天青作为指示剂确认氧气除净。试验当天,在厌氧操作台分别称取25 g窖泥待检样品和酒醅待检样品于225 mL无菌生理盐水中,充分混匀制备成1∶10样品稀释液,吸取1 mL稀释液加入9 mL无菌生理盐水,充分混匀制备成1∶100样品稀释液,重复上述操作对样品进行梯度稀释,取2～3个合适浓度的稀释液分别涂布于5种厌氧培养基平板上,37 ℃厌氧培养3 d后参考好氧微生物纯化及保藏方法在厌氧操作台中对厌氧分离菌株四区划线分纯和-80 ℃冰箱甘油管保藏。

滚管法:5种分装到厌氧管中的厌氧微生物分离培养基经智能厌氧制备仪置换除氧后高温灭菌,将灭菌后的液态琼脂培养基厌氧管于50 ℃水浴锅中保温备用。用无菌注射器吸取100 μL于厌氧工作站中稀释至适宜梯度的样品稀释液加入到厌氧管中,平放至盛有碎冰块的容器中迅速滚动,使带菌培养基在厌氧管内壁形成均匀的薄膜,完全凝固的厌氧管置于厌氧袋中37 ℃厌氧培养3 d。在厌氧工作站中用无菌针头挑取厌氧管内壁上菌落形态不同的单菌落,转接至相应的液体培养基厌氧管中37 ℃厌氧培养2 d。将梯度稀释后的厌氧管中的菌液用无菌注射器再次加入到液态琼脂培养基厌氧管中冰浴滚管。重复上述操作对厌氧管分离菌株进行纯化,至观察菌落和菌体形态均一后编号保藏于-80 ℃冰箱备用。

1.2.3 分离菌株MALDI-TOF MS鉴定

采用MALDI-TOF MS鉴定系统对分离菌株进行快速鉴定,以初步确定分离菌株的分类学地位[22]。该方法主要通过采集微生物稳定表达的核糖体蛋白指纹图谱,与已知微生物菌种蛋白指纹图谱数据库比对分析后,得到待测菌株的鉴定结果及置信水平,实现微生物菌种的快速鉴定[23-24]。本研究使用的MALDI-TOF MS鉴定数据库包括10 833株菌,其中革兰氏阴性菌4 318株,革兰氏阳性菌5 572株,酵母菌和丝状真菌943株。

根据GB/T 33682—2017《基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则》中甲酸提取法对分离菌株进行MALDI-TOF MS鉴定:分别挑取各待测菌株菌落于盛有300 μL超纯水的1.5 mL离心管中,充分混匀后加入900 μL无水乙醇(色谱纯),旋涡振荡1 min离心菌体细胞(13 000 r/min,2 min),弃去上清液,重复离心操作,用移液器吸净上清液后向沉淀中加入50 μL 70%的甲酸水溶液,旋涡振荡重悬菌体,再加入50 μL乙腈混合均匀,13 000 r/min离心2 min,吸取1 μL上清液点样在样品靶板孔中,待室温下晾干后滴加1 μL α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,HCCA)基质溶液覆盖在每个样本上,室温下自然晾干。将点样完成的靶板放入仪器中,按照仪器操作规程设置参数后采集待测菌株蛋白指纹图谱。采集到的质谱数据导入本地微生物指纹图谱库,在鉴定系统中得到待测菌株的鉴定结果。

1.2.4 分离菌株DNA提取和16S rDNA及功能基因测序

对于MALDI-TOF MS鉴定未得到结果的菌株,则采用16S rDNA及功能基因测序技术进行进一步鉴定。按照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒说明书的操作步骤提取各分离菌株的基因组DNA,-20 ℃保存备用。分离菌株的16S rDNA测序PCR扩增以27F和1492R为引物,功能基因gyrB测序PCR扩增以gyrB-F(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′)和gyrB-R(5′-AG-CAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTC-NGTCAT-3′)为上下游引物,反应体系参考文献[25]的方法。PCR完成后对扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,以检测DNA提取质量。将条带清晰且无杂带的扩增产物送生工生物工程股份有限公司进行双向测序。

1.2.5 特征菌种系统发育分析

根据不同分离筛选条件和分离生境的可培养细菌种类和丰度,结合文献调研确定6株浓香型白酒窖池潜在特征菌并对特征菌种进行了系统发育分析。将测序得到的各菌株序列整理拼接后提交至GenBank,运用Clusta-X软件对序列进行校正[26],通过NCBI进行BLAST比对后利用MEGA软件中的邻接法(Neighbor-Joining)开展序列同源性分析及系统发育树的构建,自展值(bootstrap value)设置重复取样1 000次。

1.2.6 特征菌种形态学特征和生理生化试验

将纯化后的6株浓香型白酒窖池特征菌种代表菌株接种于相应分离培养基上,观察不同菌株菌落形态特征。同时将分离株菌落通过戊二醛固定、无菌水漂洗、乙醇梯度脱水、干燥及离子溅射仪喷金后固定于样品台上,利用扫描电镜观察菌株菌体微观形态。结合宏观和微观形态特征参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[27],按照梅里埃API 50 CHB和API 20A鉴定试剂盒说明书对分离菌株进行碳源利用等生理生化指标检测。

2 结果与分析

2.1 浓香型白酒窖池中可培养细菌分离纯化结果

经多次划线分纯及菌落菌体形态特征排重后,从浓香型白酒窖池中共分离得到来自21个属44个种的124株细菌,包括芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、泪珠状产孢菌属(Lacrimispora sp.)、嗜蛋白菌属(Proteiniphilum sp.)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus sp.)和互营球菌属(Syntrophococcus sp.)在内的9株潜在细菌新种。厌氧条件分离得到100株分离株,其中PYG培养基35株,蛋白瘤胃球菌培养基18株,苛养厌氧菌培养基18株,强化梭菌培养基13株,MRS培养基16株。在好氧条件下2种好氧培养基分离出24株可培养菌株:富集培养基TSA分离出14株,寡营养的R2A培养基分离出10株。厌氧条件下分离得到的微生物数量显著高于有氧环境,表现出更高的丰度。在窖泥和酒醅2种不同的分离生境中,获得的可培养微生物在数量方面相差不大,分别分离到60株和64株。

2.2 分离菌株MALDI-TOF MS及16S rDNA鉴定结果

采用甲酸提取法通过MALDI-TOF MS快速鉴定系统对浓香型白酒窖池中分离到的124株可培养微生物进行分类学地位确认。结果显示81株分离株得到种水平的鉴定结果,占待检菌株的65.3%。采用16S rDNA测序技术对经MALDI-TOF MS鉴定未得到结果的43株细菌进行进一步鉴定。鉴定分析结果表明,124株分离菌株均得到种属水平的鉴定结果(表1),所有分离株分属于21个属的44种,包括Bacillus sp.,Lacrimispora sp.,Proteiniphilum sp.,Paenibacillus sp.和Syntrophococcus sp.在内的9株潜在细菌新种。

2.3 浓香型白酒窖池中可培养细菌多样性分析

2.3.1 不同分离条件可培养细菌多样性分析

从浓香型白酒窖池中分离得到的124株分离株中,厌氧环境分离到的100株包含16个属的34种。其中PYG培养基分离效果最好,共获到8个属17个种的共35株细菌,包括梭菌属(Clostridium sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、泪珠状产孢菌属(Lacrimispora sp.)、鼠伴菌属(Muricomes sp.)、嗜热芽胞杆菌属(Caldibacillus sp.)、嗜蛋白菌属(Proteiniphilum sp.)、氨基酸杆状菌属(Aminobacterium sp.)、互营球菌属(Syntrophococcus sp.)和3株潜在细菌新种,梭菌属和芽胞杆菌属为该培养基中的优势分离菌种,分别占该培养基总分离株的22.9%和34.3%;蛋白瘤胃球菌培养基分离到6个属10个种的共18株分离株,包括芽胞杆菌属、泪珠状产孢菌属、互营球菌属、肠球菌属(Enterococcus sp.)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus sp.)、魏茨曼氏菌属(Weizmannia sp.)和3株潜在新种微生物,芽胞杆菌属为该培养基中的优势分离菌种,占该培养基总分离株的44.4%;苛养厌氧菌培养基分离到7个属的11种共18株分离株,包括芽胞杆菌属、泪珠状产孢菌属、梭菌属、嗜热芽胞杆菌属、鼠伴菌属、嗜蛋白菌属、魏茨曼氏菌属和1株潜在细菌新种,芽胞杆菌属和泪珠状产孢菌属为该培养基中的优势分离菌种,均占该培养基总分离株的22.2%;强化梭菌培养基分离到7个属的9种共13株可培养细菌,包括梭菌属、芽胞杆菌属、泪珠状产孢菌属、嗜热芽胞杆菌属、鼠伴菌属、魏茨曼氏菌属、沉积物杆菌属(Sedimentibacter sp.)和1株潜在新种,梭菌属和鼠伴菌属为该培养基中的优势分离菌种,均占该培养基总分离株的23.1%;MRS培养基分离到7个属的11种共16株分离株,包括梭菌属、芽胞杆菌属、魏茨曼氏菌属、醋乳杆菌属(Acetilactobacillus sp.)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)和魏斯氏菌属(Weissella sp.),乳杆菌属和链球菌属为该培养基中的优势分离菌种,分别占该培养基总分离株的37.5%和18.8%。厌氧条件下获得的分离株中窖池优势微生物种属芽胞杆菌属、梭菌属及同属于梭菌目(Clostridiales)的泪珠状产孢菌属分离株数量均占比较大:芽胞杆菌属分离到4个种共27株,占厌氧分离株总数的27%;梭菌属分离到8个种共16株,占厌氧分离总数的16%;泪珠状产孢菌属得到4种共12株,占总数的12%。其他如嗜热芽胞杆菌属[28]、乳杆菌属[29]、链球菌属[30]和嗜蛋白菌属[31]等浓香型白酒窖池中已报道的常见微生物菌属也均获得了不同数量的分离株。

好氧条件下的2种培养基分离到9个属14个种的24株可培养菌株。其中TSA培养基分离到9个属的11种共14株可培养细菌,包括梭菌属、芽胞杆菌属、鼠伴菌属、氨基酸杆状菌属、棒杆菌属(Corynebacterium sp.)、土壤芽胞杆菌属(Solibacillus sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、丙酸杆菌属(Propionibacterium sp.)和埃希氏菌属(Escherichia sp.),梭菌属和芽胞杆菌属为该培养基中的优势分离菌种,均占该培养基总分离株的21.4%;寡营养的R2A培养基分离到芽胞杆菌属的4种共10株分离株,包括1株潜在芽胞杆菌属新种。有氧条件下分离到的24株可培养细菌优势菌属与厌氧条件分离株相似,数量较多的也为芽胞杆菌属和梭菌属,前者得到5个种的13株,后者包含2个种共3株。此外丙酸杆菌属、土壤芽胞杆菌属、棒杆菌属等可培养微生物菌属在有氧分离培养条件下也均得到了一定数量的分离菌株。

比较不同分离筛选条件下获得的可培养细菌种类和丰度,可以发现在厌氧条件下分离到的细菌种属类型及数量均高于有氧环境,表现出更高的丰度和多样性。值得注意的是,在有氧和厌氧2种分离培养环境下获得的窖池分离菌株数量最多的均为芽胞杆菌属和梭菌属。表明可以通过优化和改良培养基等方式获得在有氧条件下较难培养的梭菌属微生物,也可以在厌氧环境中分离得到部分需氧或兼性厌氧的芽胞杆菌属微生物。但不同种类培养基对微生物分离筛选能力仍存在一定差异:泪珠状产孢菌属在除MRS培养基外的4种厌氧培养基中均获得一定数量的分离株;魏茨曼氏菌属则在除PYG培养基外的4种厌氧培养基中均有分离株出现;嗜热芽胞杆菌属和鼠伴菌属在蛋白瘤胃球菌培养基和MRS培养基中未有分离株获得,但在其余3种培养基中均得到了可培养菌株。而部分种属的微生物只在特定培养基中有所分离:类芽胞杆菌属和肠球菌属只在蛋白瘤胃球菌培养基中分离出,分别为1株和2株;氨基酸杆状菌属仅在PYG培养基中分离到1株;沉积物杆菌属只在强化梭菌培养基中分离到2株;醋乳杆菌属、乳杆菌属、链球菌属和魏斯氏菌属则仅在MRS培养基中得到一定数量的分离株。与R2A相比,TSA培养基由于营养成分更丰富,体现出了更优良的细菌分离效果:棒杆菌属、土壤芽胞杆菌属、不动杆菌属、丙酸杆菌属和埃希氏菌属均仅在该培养基上得到了分离株。

2.3.2 不同分离生境可培养细菌多样性分析

浓香型白酒窖池的窖泥和酒醅分离得到的124株可培养菌株中,60株来源于窖泥样品,包括15个属的29个种:芽胞杆菌属、梭菌属、泪珠状产孢菌、醋乳杆菌属、氨基酸杆状菌属、嗜热芽胞杆菌属、棒杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、鼠伴菌属、嗜蛋白菌属、沉积物杆菌属、土壤芽胞杆菌属、链球菌属和魏茨曼氏菌属。其中分离株数量占比较大的优势菌种芽胞杆菌属有5种16株,占窖泥分离株总数的26.7%;泪珠状产孢菌属有4种11株,占窖泥分离株的18.3%;梭菌属有6种10株,占窖泥分离株的16.7%。除肠球菌属和乳杆菌属有2种分离株外,其余10个属分离的可培养细菌均仅有1种分离株出现,且有4株泪珠状产孢菌属疑似新种和1株嗜蛋白菌属疑似新种,表现出较高的微生物种属多样性。

酒醅样品中共得到18个属30个种的64株分离株,包括芽胞杆菌属、梭菌属、泪珠状产孢菌、醋乳杆菌属、氨基酸杆状菌属、嗜热芽胞杆菌属、乳杆菌属、鼠伴菌属、沉积物杆菌属、土壤芽胞杆菌属、链球菌属、魏茨曼氏菌属、不动杆菌属、埃希氏菌属、丙酸杆菌属、类芽胞杆菌属、互营球菌属和魏斯氏菌属。其中菌株数量较多的优势分离菌种芽胞杆菌属有6种24株,占酒醅分离株总数的37.5%;梭菌属有4种9株,占酒醅分离株的14.1%,鼠伴菌属有1种6株,占酒醅分离株的9.4%。酒醅样品中4株乳杆菌属分离株分属于4个种,在种类和数量上较其他非优势分离菌种微生物均呈现出一定的多样性。其他14个属的可培养微生物分离株在种和株的数量上相差不大,同时酒醅样品分离得到1株芽胞杆菌属疑似新种、1株类芽胞杆菌属疑似新种和2株互营球菌属疑似新种。

比较不同分离生境获得的可培养细菌种类和丰度,可以发现在窖泥和酒醅样品中分离到的细菌种属类型及数量均有较高的相似性,且2种样品获得的分离株中芽胞杆菌属和梭菌属均有较高丰度,表明在2个采样位置的微生物数量及优势菌种差异较小,与前人研究结果一致,即在白酒酿造过程中窖泥和酒醅2个发酵体系之间可以通过黄水实现微生物代谢产物和不同菌种的传递和迁移,2个发酵体系中的微生物在酒体风味成分的形成过程中存在一定的协同效应[6-7,20]。其中,分离得到的梭菌属菌种种类最为丰富,主要包括酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、科氏梭菌(Clostridium kluyveri)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、永达尔氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、柔嫩梭菌(Clostridium leptum)和酒梭菌(Clostridium liquoris)等。梭菌属菌种是窖泥中优势微生物,通常能够利用底物等有机物代谢产生己酸、丁酸、乙酸等重要风味香味物质。分离得到的芽胞杆属菌种种类也较为丰富,主要包括地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、副地衣芽胞杆菌(Bacillus paralicheniformis)、贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)、卡夫里亚莱斯氏芽胞杆菌(Bacillus cabrialesii)、暹罗芽胞杆菌(Bacillus siamensis)、白色芽胞杆菌(Bacillus albus)和沙福芽胞杆菌(Bacillus safensis)等。芽胞杆菌具有发达的水解酶系统,在白酒酿造过程中能够充分利用底物,产生吡嗪类、丁二醇、3-羟基-2-丁酮、有机酸等白酒中重要的香味成分。此外,梭菌属和芽胞杆菌属菌种的代谢产物还能促进窖泥中微生物的相互作用,调节窖泥中微生物群落结构,进而影响浓香型白酒的香气成分。但窖泥和酒醅2种样品的分离株在种属水平上还是有一定差异:棒杆菌属、肠球菌属和嗜蛋白菌属3个属的微生物仅在窖泥样品中分离获得;而不动杆菌属、埃希氏菌属、类芽胞杆菌属、丙酸杆菌属、互营球菌属和魏斯氏菌属则仅在酒醅样品中分离到。侧面证实了窖池中2种发酵体系通过物质交换和微生物转移共同决定和影响着浓香型白酒典型风味物质的形成,以及酒体品质的改善提升。

综合来看,芽胞杆菌属为浓香型白酒窖池中分离数量最多的微生物种类,包含8种40株,约占总分离菌株数的32%;梭菌属包含9种19株,约占总分离株的15%;泪珠状产孢菌属共有4种12株,约占总数的10%。对于文献报道较多的乳杆菌属、鼠伴菌属、魏茨曼氏菌属、氨基酸杆状菌属及魏斯氏菌属等在浓香型白酒酿造过程中对白酒中特定风味物质的形成、维持窖泥微生物结构稳定等方面发挥重要作用的微生物菌属也获得了一定数量的分离株。如乳杆菌属分离到4种共6株,鼠伴菌属和魏茨曼氏菌属分别有11株和7株。此外,在除TSA和MRS培养基外的其余5种培养基中,共有9株分离株16S rDNA测序结果显示与已知分类学地位模式菌株的16S rDNA序列相似性均低于98.65%[32],为潜在疑似新种,后续需进一步通过全基因组测序等分子生物学鉴定技术确定其分类学地位。

2.4 特征菌种鉴定及生物学特性分析

浓香型白酒酿造体系中微生物的种类、数量、种群间的相互作用以及代谢的多样性对白酒质量具有重要影响,是白酒香型和风格呈现多样化的主要原因。梭菌属和芽胞杆菌属作为浓香型白酒窖池中的优势微生物类群,在白酒酿造过程中发挥着重要作用。梭菌多为专性厌氧微生物,在厌氧发酵状态下能合成多种短链脂肪酸、醇类等风味物质。已有大量报道证实白酒窖池中的部分梭菌代谢产物乙酸、己酸、丁酸、正丁醇等是浓香型白酒重要的香气物质前体或本体[33]。此外,在浓香型白酒酿造过程中某些梭菌属菌株能产生异味物质[11],可能会直接影响浓香型白酒的品质。芽胞杆菌的种类和数量直接影响着窖池微生物群落结构和挥发性风味物质合成及酒的风格特征。该类菌种能水解淀粉、蛋白质等大分子物质,并利用糟醅浸润到窖泥中的营养物质产生丁酸和己酸等有机酸,有的菌种还能形成双乙酰等芳香类物质,因此是重要的产酸和产香菌[34]。为解析浓香型白酒窖池中功能菌的生物学特性,确定了6株潜在特征菌种开展系统发育和生物学特性分析。

2.4.1 特征菌种系统发育分析

6株(P1-3、P1-6、P2-1、K1-1、P3-5、R2-2-3)浓香型白酒窖池中可培养特征菌种代表菌株PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,在1 500 bp左右处有明亮单一条带,满足测序要求,送扩增产物进行测序。将得到的测序结果通过EzBioCloud数据库进行比对,寻找数据库中与目的基因序列同源性最高的已知分类学地位的菌种,从而确定目的基因归属。

结果表明菌株P1-3的16S rDNA序列与1株肠鼠伴菌(Muricomes intestini)的模式菌株序列相似性最高,为99.64%。以海氏梭菌(Clostridium hylemonae)TN-271T序列为外群构建菌株P1-3与相关近缘模式菌株的系统发育树(图2-a),结果显示通过16S rDNA序列系统发育分析可将菌株P1-3鉴定为肠鼠伴菌。菌株P1-6的16S rDNA序列与酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)的模式菌株序列相似性最高,为100%。以瘤胃解蛋白质菌(Proteiniclasticum ruminis)D3RC-2T序列为外群构建菌株P1-6与相关近缘模式菌株的系统发育树(图2-b),结果显示通过16S rDNA序列系统发育分析可将分离株P1-6鉴定为酪丁酸梭菌。菌株K1-1的16S rDNA序列与2株泪珠状产孢菌属(Lacrimispora sp.)的模式菌株序列相似性均高于99%。通过对泪珠状产孢菌属菌种功能基因相关文献检索调研,发现目前没有该种属微生物功能基因相关文献报道。以Enterocloster aldensis RMA 9741T序列为外群构建菌株K1-1与相关近缘模式菌株的系统发育树(图2-c),结果表明通过16S rDNA序列系统发育分析可将菌株K1-1鉴定为泪珠状产孢菌属。菌株P2-1的16S rDNA序列与芽胞杆菌属(Bacillus sp.)的6株模式菌株序列相似性均高于99%(图2-d)。对菌株P2-1的gyrB基因通过NCBI的BLAST软件进行比对,结果表明P2-1的gyrB基因序列与地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的相似性最高,为99.8%。以嗜盐喜盐芽胞杆菌(Halobacillus halophilus)DSM 2266T序列为外群构建菌株P2-1与相关近缘模式菌株的系统发育树(图2-g),gyrB基因序列系统发育分析表明菌株P2-1为地衣芽胞杆菌。菌株P3-5的16S rDNA序列与芽胞杆菌属(Bacillus sp.)的10株模式菌株序列相似性均高于99%(图2-e)。对菌株P3-5的gyrB基因通过BLAST软件进行比对,结果表明P3-5的gyrB基因序列与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的相似性最高,为99.3%。以嗜盐喜盐芽胞杆菌(Halobacillus halophilus)DSM 2266T序列为外群构建菌株P3-5与相关近缘模式菌株的系统发育树(图2-h),gyrB基因序列系统发育分析表明菌株P3-5为枯草芽胞杆菌。菌株R2-2-3的16S rDNA序列与芽胞杆菌属(Bacillus sp.)的10株模式菌株序列相似性均高于99%(图2-f)。对菌株R2-2-3的gyrB基因通过BLAST软件进行比对,结果表明R2-2-3的gyrB基因序列与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)的相似性最高,为98.6%。以嗜盐喜盐芽胞杆菌(Halobacillus halophilus)DSM 2266T序列为外群构建菌株R2-2-3与相关近缘模式菌株的系统发育树(图2-i),gyrB基因序列系统发育分析表明菌株R2-2-3为贝莱斯芽胞杆菌。

2.4.2 特征菌种生物学特征分析

将6株浓香型白酒窖池特征菌种代表菌株接种于相应分离培养基上,观察不同菌株菌落形态特征(表2)。

同时对各分离菌株进行扫描电镜观察,菌体微观形态特征如图3所示。芽胞杆菌属分离株P2-1、P3-5和R2-2-3菌体形态特征为短杆状,单个或成对排列,部分菌体表面被覆代谢产生的膜,符合芽胞杆菌属菌株菌体形态特点;梭菌目菌株P1-3、P1-6和K1-1菌体形态特征为杆状,部分菌体呈梭状,单个或成对排列。

芽胞杆菌属分离株P2-1、P3-5和R2-2-3选用API 50 CHB试剂条进行生理生化特性测试,结果见表3。株菌在对L-山梨糖、L-鼠李糖、D-乳糖、菊糖、D-土伦糖、D-塔格糖和葡萄糖酸钾利用方面存在一定差异,其他生理生化项结果则均相同,在营养物质利用方面表现出了种属相似性和一定的菌株差异性。梭菌目厌氧菌株P1-3、P1-6和K1-1采用API 20A试剂条开展生理生化特性试验,结果见表4。3株试验菌都能水解明胶,菌株K1-1除对色氨酸和脲素为阴性,其他检测项均呈阳性或弱阳性;菌株P1-3和P1-6则相反,对试剂条大部分生理生化项都为阴性,推测3株分离菌虽然同属于厚壁菌门的梭菌目(Clostridiales),但在分类学水平上是完全不同的菌种,由此导致菌株生理生化特性的差异。

3 结论

本研究利用可培养组学技术,通过增加培养基种类和采用不同样品分离条件,对浓香型白酒窖泥和酒醅样品中可培养细菌进行了大量的分离培养及鉴定,同时开展了浓香型白酒酿造过程中特征菌种代表菌种的系统发育分析及菌株特性研究。通过5种特定的厌氧培养基和2种好氧培养基,从浓香型白酒窖池中共分离得到了来自21个属44个种的124株细菌,包括9株潜在细菌新种。其中,厌氧条件分离得到100株,好氧条件分离得到24株;窖泥样品分离得到60株,酒醅样品分离得到64株。芽胞杆菌属(Bacillus sp.)和梭菌属(Clostridium sp.)是窖池样品中分离的优势菌种。比较了不同分离筛选条件和分离生境的可培养细菌种类和丰度,并解析了6株浓香型白酒窖池潜在功能菌的生物学特性。本研究为浓香型白酒窖池中潜在新种的挖掘、特征性菌种资源的定向筛选、互作机制解析、功能性研究开发及产业化应用奠定基础。

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