石榴皮是石榴取籽后的农副产品,被大量丢弃,既造成了环境污染也造成了资源浪费。为解决此问题,国内外学者就石榴副产物进行了大量研究,其中包括了从石榴皮中提取石榴多酚[1]、石榴黄酮[2]、果胶[3]、色素[4]等研究。但未见从石榴皮中提取石榴皮纤维素纳米晶体(pomegranate peel cellulose nanocrystals,PCNC)的相关研究报道。
纤维素纳米晶体是具有高结晶度的棒状纳米粒子。主要制备方法有蒸汽爆破法、高压均质法、超声波技术、酸/碱水解和酶辅助水解[5]。纤维素纳米晶体的提取步骤主要包括2个部分,首先是对植物材料进行碱处理和漂白,以去除材料中的木质素、半纤维素、蜡和油等成分得到纤维素。最后是使用物理或化学等方法使纤维素尺寸缩小,成为纤维素纳米晶体。纤维素纳米晶体具有触变性,当添加到流体食品中时,可以提供出色的加工和贮存性能,含有纤维素纳米晶体的流体具有剪切稀化性,随着发生剪切而降低黏度,使流体更容易进行机械加工,在流体贮存期间,纤维素纳米晶体也可作为稳定剂[6];纤维素纳米晶体具有高度有序的结构,可改善膜的机械性能,本身无毒。将其加入到可食膜中,可增强其水蒸气阻隔性和抗菌性能[7]。因此,从石榴皮中提取纤维素纳米晶体在食品加工、贮藏、包装等领域具有很高的应用潜力。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
突尼斯软籽石榴产自四川会理,采摘期为八月中旬;盐酸(36%)、氢氧化钠(块状)、次氯酸钠、浓硫酸(95%)均为分析纯,成都市科隆化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱,上海一恒科技有限公司;均质机,上海美谱达仪器有限公司;Q200MDSC差示扫描量热仪,美国TA公司;Nano ZS马尔文粒度仪,英国马尔文仪器有限公司;X-射线衍射仪,荷兰PANalytical公司;傅里叶红外光谱仪,美国Thermo electron公司;扫描电子显微镜,日本日立公司;原子力显微镜,德国Bruker公司;热重分析仪器,德国NETZSCH公司;真空冷冻干燥机,美国SIM公司。
1.3 实验方法
1.3.1 石榴皮渣制备
手工剥离石榴皮,40 ℃烘箱干燥60 h,粉碎,过40目筛,贮藏备用。
1.3.2 石榴皮纤维素的制备[8]
取上述30 g石榴皮渣,加入300 mL蒸馏水,85 ℃搅拌30 min。然后加入300 mL 1 mol/L HCl, 85 ℃搅拌30 min,过滤,洗涤至中性。而后加入300 mL 100 g/L氢氧化钠溶液,70 ℃搅拌160 min,过滤,洗涤至中性。最后用300 mL 1%(体积分数)次氯酸钠溶液,95 ℃搅拌60 min,重复3次,直到滤渣被漂白,过滤,洗涤至中性。进行真空冷冻干燥,得到石榴皮纤维素,密封袋中贮存备用。
1.3.3 PCNC的制备
使用酸水解法提取纤维素纳米晶体[9],稍作修改:取上述5 g石榴皮纤维素,加入75 mL 55%(体积分数)硫酸溶液,50 ℃搅拌60 min。将所得溶液在4 000 r/min下离心10 min以除去硫酸,重复5次。从离心机中收集的沉淀物用超纯水稀释,在4 ℃条件下透析至中性。然后将纤维素纳米晶体悬浮液以10 000 r/min的速度均质处理3 min,获得中性匀浆胶体悬浮液,冰浴超声10 min。最后将悬浮液冷冻干燥成粉末,得到PCNC,4 ℃下密封贮存备用。
1.3.4 纳米纤维素晶体表征
1.3.4.1 粒径与Zeta电位测定
利用Nano ZS马尔文粒度仪对纳米纤维素晶体的粒径和稳定性进行表征。配制0.1 mg/mL的纤维素纳米晶体悬浮液,上机检测(测试前超声处理5 min)。
1.3.4.2 傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)测定
称取1 mg纳米纤维素晶体粉末和100 mg溴化钾粉末于研钵中,研至均匀,取30 mg混合样品压制成片,在500～4 000 cm-1的红外波段进行测定得到其光谱。
1.3.4.3 X-射线衍射(X-ray diffraction,XRD)测定
取适量样品,采用X-射线衍射仪进行测定。操作条件为:铜靶,管压30 kV,电流10 mA,步长0.05°,扫描速度0.05°/s,衍射角(2θ)扫描范围为5°～80°。采用Segal公式[10]计算PCNC的结晶度指数(crystallinity index,CrI),如公式(1)所示:
(1)
式中:I002为002晶面(2θ=22°)衍射峰强度,即结晶区的衍射强度;I18.5为2θ=18.5°处晶格衍射峰强度,即无定形区的衍射强度。
1.3.4.4 差示扫描量热(differential scanning calorimetry,DSC)测定
取5 mg样品加到坩埚中,以空坩埚作为对照。DSC测定程序为:氮气作为保护气,升温速率25 ℃/min,温度从30 ℃上升至400 ℃。
1.3.4.5 热重分析(thermogravimetric analysis,TGA)测定
在氮气条件下以10 ℃/min的恒定加热速率,记录从30～600 ℃的热重(thermogravimetric,TG)曲线和导数热重(derivative thermogravimetric,DTG)曲线。
1.3.4.6 扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)测定
将样品置于带有导电胶的样品台上,吹去多余样品,经离子溅射仪喷金30 s后,在加速电压3.0 kV 的条件下进行观察并拍摄样品形貌。
1.3.4.7 原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)测定
将一滴高度稀释的悬浮液放在硅片基底上并使其风干。使用Dimension Fast Scan型原子力显微镜进行扫描。
2 结果与分析
2.1 粒径与Zeta电位分析
使用Nano ZS马尔文粒度仪对纳米纤维素悬浮液的粒度大小和电位分布进行分析,如图1所示。其粒度主要分布区间为100～400 nm,表明大部分PCNC颗粒具有纳米尺寸,与AFM所显示的尺寸一致。但动态光散射(dynamic light scattering,DLS)获得的纳米纤维素的粒径值并不是绝对的,而是表观粒径。这是因为DLS依赖于布朗运动来监测散射强度,并通过Stokes-Einstein根据扩散率确定粒径,方程依赖于假设的球形流体动力学的半径值,并且扩散系数是恒定的,对于棒状的纳米纤维素粒子来说并不恒定[11]。通过Zeta电位测定来确定PCNC悬浮液的稳定性,其Zeta电位值为-38.6 mV。原因可能是PCNC在提取过程中时,纤维素的无定形区域被H2SO4水解,一些表面羟基被硫酸基团取代,从而让颗粒带负电。研究表明,Zeta 电位绝对值超过25 mV的纳米纤维素悬浮液通常是稳定的,而Zeta电位值在-15～15 mV的纳米颗粒不稳定,会发生絮凝现象[8]。MEHANNY等[12]进行了纳米纤维素的Zeta电位的研究实验,发现其值大多集中在18～60 mV。因此本试验制备的PCNC具有良好的稳定性。
图1 PCNC粒径分布图
Fig.1 PCNC particle size distribution
2.2 傅里叶变换红外光谱分析
FTIR光谱可表征石榴皮渣处理成PCNC而发生的化学成分变化。石榴皮渣、PCNC的FTIR光谱见图2。图中所有样品都有2个主要的吸收峰集中区域,分别为2 700～3 500 cm-1与700～1 800 cm-1。3 400 cm-1附近区域的吸收峰归因于纤维素结构中羟基的伸缩振动[13]。2 900 cm-1附近的峰归因于纤维素中β-糖苷环中碳氢键的拉伸。1 731 cm-1附近的吸收峰主要是半纤维素的乙酰基或木质素中的芳香族基团中碳氧双键的拉伸[12],在PCNC中并未观察到此吸收峰,表明半纤维素或木质素的溶解或去除。1 620 cm-1附近的吸收峰来源于样品中水的氢氧键,1 515 cm-1附近的吸收峰是木质素中碳碳双键的震动[14]。1 430 cm-1附近的吸收峰与结晶带相关,是—CH2对称拉伸或醚键的拉伸[8,15]。1 350 cm-1和1 175 cm-1附近的吸收峰,表明PCNC中存在磺酸盐[12],这可能是在用硫酸水解时引入的。1 250 cm-1附近的吸收峰对应木质素芳基中烷基醚的拉伸。1 160 cm-1附近的吸收峰归因于吡喃糖环骨架醚键伸缩和碳碳单键的拉伸[9]。1 056 cm-1附近的吸收峰归因于吡喃糖环的C—O—C键的拉伸。890 cm-1附近的吸收峰与典型纤维素的—CH摇摆振动(特定于β-葡萄糖苷)有关[16]。FITR光谱表明石榴皮渣经处理后,半纤维素和木质素被有效地去除了,这与热稳定性结果一致,与RASHID等[17]对稻壳纳米纤维素的FTIR分析结果相似。
图2 PCNC、石榴皮渣FITR光谱图
Fig.2 FITR spectra of pomegranate peel residue and PCNC
2.3 结晶度分析
纤维素主要由通过分子内或分子间(氢键、范德华力)作用形成的结晶区和无定形区组成[15]。通过X射线衍射可分析石榴皮渣和PCNC的晶体结构和结晶度指数。XRD衍射图谱如图3所示,PCNC衍射图谱中观察到3个结晶峰,分别为2θ= 15.4°(110)、22.4° (200)、 34.1°(004),这是纤维素I 的典型晶体结构。石榴皮渣前2个峰较为明显,在34°附近未观察到结晶峰,且经处理后的PCNC结晶峰强度显著增加,表明半纤维素、木质素和非结晶纤维素在处理过程中,被有效地去除掉了。这与DAHLEM等[18]对马黛茶纳米纤维素XRD图谱所呈现的结果一致。纤维素的结晶度是影响纤维素在复合材料中的增强能力和机械强度的关键因素,高结晶度的纤维素能更有效地增强复合材料的性能[19]。通过公式(1)计算得出,石榴皮渣、PCNC的结晶度分别为33%、63%。这与LUZI等[20]提取的北非草纳米纤维素结晶度为70%,FENG等[21]提取的甘蔗渣纳米纤维素结晶度为73.6%,DAI等[16]提取的菠萝皮纳米纤维素结晶度为61%,结果接近。
图3 PCNC、石榴皮渣XRD衍射图
Fig.3 XRD patterns of pomegranate peel residue and PCNC
2.4 热稳定性分析
通过DSC、TGA对石榴皮渣和PCNC进行热稳定性分析,结果如图4所示。DSC曲线图(图4-A)表示石榴皮渣和PCNC的热流率(吸热或放热速率)随温度变化的函数关系,所有样品均呈现吸热现象,并且PCNC出现的吸热峰所需温度更低。这是因为锐度与结晶区域的存在有关,在提取过程中,非纤维素物质被去除了,所以PCNC的吸热峰更尖锐[17]。DSC研究证实了PCNC具有比原材料更高的结晶度,与XRD结果一致。TG曲线图(图4-B)表示石榴皮渣和PCNC的残余重量随温度变化的函数关系。石榴皮渣和PCNC在30～80 ℃时出现较快的质量损失,这是由于水分在此阶段的温度下快速蒸发所导致的,而石榴皮渣质量损失更多,是因为其含水量较高。石榴皮渣、PCNC的主要质量损失发生在200～400 ℃区间。原因是石榴皮中主要含有纤维素、半纤维素、木质素等物质。纤维素具有较高的结晶度,这使其具有热稳定性,其降解温度大概在 315～400 ℃。半纤维素和木质素是无定形的,在纤维素之前开始降解,由于乙酰基的存在,半纤维素的热稳定性较差,其降解区间为220～315 ℃。木质素含有大量的芳香环,具有各种分支结构,可在较宽的温度范围内降解,其降解区间为160～900 ℃。DTG曲线图(图4-C)表示石榴皮渣和PCNC的质量损失速率随温度变化的函数关系。石榴皮渣在200～400 ℃出现了2个降解峰,第一个峰为半纤维素的降解峰(峰谷在240 ℃左右),第二个峰为纤维素的降解峰(峰谷在336 ℃左右),由于木质素的降解温度范围较大,因此没有呈现明显的降解峰,而PCNC只呈现一个纤维素的降解峰(峰谷在321 ℃左右)。因此PCNC中纤维素的热稳定性比石榴皮渣纤维素的热稳性低,原因可能是由于在酸水解过程中,纳米纤维素的分子质量急剧下降和高度硫酸化的无定形区域降解所致,同时通过硫酸水解引入硫酸根基团可显著降低纤维素纳米晶体降解的活化能[22]。并且在PCNC的DTG曲线中,纤维素降解速率出现骤降后骤升,这是由于高度硫酸化的无定形区域先行降解所导致的。温度超过400 ℃后,石榴皮渣、PCNC降解速率变缓,在此阶段主要是碳质残留物的降解及单体 D-吡喃葡萄糖单元分解成残基。在此温度区间内,石榴皮渣降解速率一直高于纳米纤维素,这是可能是由于石榴皮渣中木质素仍在缓慢降解所导致的。这与DE等[23]对巴西白茅草纳米纤维素的研究结果相似。
A-DSC;B-TG;C-DTG
图4 PCNC、石榴皮渣DSC、TG、DTG曲线图
Fig.4 DSC, TG, DTG curves of PCNC and pomegranate peel residue
2.5 微观结构分析
通过SEM图像分析纳米纤维素的形态是一种非常常见的方法,且纤维素的来源和制备方法对纳米纤维素的尺寸和性质有较大的影响。PCNC、石榴皮渣SEM图如图5所示。在图5-B中,石榴皮渣的表面粗糙程度高于PCNC,这是因为未经处理的石榴皮渣纤维素周围存在胶结材料(如果胶、半纤维素和木质素),从而导致表面不规则[16]。在图5-A中观察到其形态呈薄片状,这是由于在处理过程中,PCNC表面的羟基之间会形成氢键造成的。然而SEM 图并无法清楚地观测PCNC的真实结构。
A-PCNC;B-石榴皮渣
图5 PCNC、石榴皮渣SEM图
Fig.5 SEM images of PCNC and pomegranate peel residue
AFM可对纳米纤维素的形态和结构进行检测,PCNC、石榴皮渣AFM二维、三维图如图6所示。在图6-A中,PCNC为200×50 nm左右的棒状结构,硫酸的水解作用通常会横向切割纤维的无定形区域,导致纤维直径从微米减小到纳米,从而具有纳米尺寸,由于AFM 测量中存在尖端展宽效应,所以纳米纤维素颗粒的计算宽度大于实际值[9]。在图6-B中,石榴皮渣为直径500 nm左右的圆形结构,由于是使用高度稀释的悬浮液进行检测的,因此所显示的石榴皮渣尺寸相对实际较小。在AFM图中存在明暗2种不同的区域,其中明亮区域代表结晶区域,而黑暗区域代表纤维素结构中纤维轴方向的无定形部分[5]。在图6-C和图6-D中可以观察到PCNC的明亮峰形区域多于石榴皮渣,表明PCNC的结晶度大于石榴皮渣,这与XRD所呈现的结果一致。与HUSSIN等[24]从毛棕榈叶中提取纳米纤维素的AFM图像一致。
A-纳米纤维素二维图;B-石榴皮渣二维图;C-纳米纤维素三维图;D-石榴皮渣三维图
图6 纳米纤维素、石榴皮渣AFM二维、三维图
Fig.6 AFM 2D and 3D images of PCNC, pomegranate peel
3 结论
采用酸水解法成功从石榴皮中提取了PCNC。在形态上,PCNC具有纳米尺寸,呈棒状结构,并且其悬浮液具有良好的稳定性,不易聚沉。石榴皮渣经过酸处理后,无木质素和半纤维素残留,具有较高的纯度,同时还具有较高的结晶度,结晶度为63%,但是经处理后的PCNC,热稳定性稍有降低。石榴皮可作为纳米纤维素新的来源,能以纤维素纳米晶体的形式增加其应用潜力,用于制备多种生物纳米复合材料,应用于食品加工、贮藏、包装等众多领域。
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